实验二十、食品中黄曲霉毒素B1的产生与检测 标准依据：GB/T5009.22-2003食品中黄曲霉毒素B1的测定 一、实验目的与要求 1、学习酶联免疫(ELIS)方法测定粮食及食品中黄曲霉毒素B,的实验原理，掌握实验的操 作要点及测定方法 2、了解酶联免疫(ELISA)的工作原理，正确熟练使用酶标仪。 二、实验原理： 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉毒素B,经提取、脱脂、浓缩后与 定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物 后显色，与标准曲线比较测定含量 三、仪器与试剂： (一)试剂盒组成 1、AFB:抗原包被16孔×6条形带框酶标板： 2、抗体： 3、酶标二抗： 4、空白对照液： 5、底物(1mg×4): 6、底物液A: 7、底物液B: 8、终止液： 9、PBS一T洗液 10、一次性手套(2副)。 (二)仪器 1、酶标仪：2、离心机。 四、实验步豫： (一)样品中AFB1的提取 1.大米和小麦（脂肪含量<3.0%）： 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g,加入250m1具塞锥形瓶中。准确加人60mL三氯甲 烷，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mlL烧杯中
实验二十、食品中黄曲霉毒素 B1 的产生与检测 标准依据：GB/T5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素 B1 的测定 一、实验目的与要求： 1、学习酶联免疫(ELISA)方法测定粮食及食品中黄曲霉毒素 B1 的实验原理，掌握实验的操 作要点及测定方法 2、了解酶联免疫(ELISA)的工作原理，正确熟练使用酶标仪。 二、实验原理： 本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，样品中的黄曲霉毒素 B1 经提取、脱脂、浓缩后与 定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物 后显色，与标准曲线比较测定含量。 三、仪器与试剂： （一）试剂盒组成 1、 AFB1 抗原包被 16 孔×6 条形带框酶标板； 2、抗体； 3、酶标二抗； 4、空白对照液； 5、底物（1mg×4）； 6、底物液 A； 7、底物液 B； 8、终止液； 9、PBS 一 T 洗液； 10、一次性手套（2 副）。 （二）仪器 1、酶标仪； 2、离心机。 四、实验步骤： （一）样品中 AFB1 的提取 1． 大米和小麦（脂肪含量＜3.0％）： 样品粉碎后过 20 目筛，称取 20.0g，加入 250m1 具塞锥形瓶中。准确加人 60mL 三氯甲 烷，盖塞后滴水封严，150rpm 振荡 30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于 50mL 烧杯中
立即取12l滤液（相当4.0g样品）于75mL蒸发皿中。65℃水浴通风挥干。用2.0mL甲醇 一PBS(20+80)分三次(0.8L、0.7L、0.5ml)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小 试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。 2.玉米（脂肪含量3.05.0%）： 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g,加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入50.0mL甲醇 一水(80+20)溶液和15.0ml石油酰，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤 纸过滤于125m分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于50烧杯内，从中取10.0ml (相当于4.0g样品)于75l蒸发皿中，以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 3.花生（脂肪含量15.0-45.0%）： 样品去壳去皮粉碎后称取20.0g,加入250L具塞三角瓶中，准确加人100.0mL甲醇水 (55+45)溶液和30ml石油醚，盖塞后滴水封严，150rm振荡30min,静置15min后用快速 定性滤纸过滤于125l分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于1001.烧杯内，从中 取20.0L(相当于4.0g样品)置于另一125l分液漏斗中，加入20.0ml三氯甲烷，振摇 2min,静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）放出三氯甲烷于75l蒸发皿中， 再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下 按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 4.植物油： 用小烧杯称取4.0g样品，用20.0ml.石油酰，将样品移于125ml分液漏斗中，用20.0ml 甲醇水(55十45)溶液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油4.0g样为4.575mL, 可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇)振摇2min,静置分层后，放出下层甲醇水 溶液于750mL蒸发皿中。再用5,0mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入燕发皿 中，以下按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 5.其它食品：可按照G85009有关章节提供的方法操作，最终提取物（相当于4.0g样品） 应收集于2.0m1甲醇一PBS(20+80)中。 (二)样品测定 1、将下列试剂稀释后备用 PBS一T洗液：390ml蒸榴水稀释(1：40)： 底物液A:9mL蒸溜水稀释(1：9)： 抗体：7.0mL洗液稀释(1：140)： 酶标二抗：10mL洗液稀释(1：200)：
立即取 12mL 滤液（相当 4.0g 样品）于 75mL 蒸发皿中。65℃水浴通风挥干。用 2.0mL 甲醇 一 PBS (20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小 试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当 2.0g 样品。 2. 玉米（脂肪含量 3.0～5.0％）： 样品粉碎后过 20 目筛，称取 20.0g，加入 250mL 具塞锥形瓶中。准确加入 50.0mL 甲醇 一水（80+20）溶液和 15.0mL 石油醚，盖塞后滴水封严，150rpm 振荡 30min。用快速定性滤 纸过滤于 125mL 分液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于 50mL 烧杯内，从中取 10.0mL （相当于 4.0g 样品）于 75mL 蒸发皿中,以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 3．花生（脂肪含量 15.0－45.0％）： 样品去壳去皮粉碎后称取 20.0g，加入 250mL 具塞三角瓶中，准确加人 100.0mL 甲醇水 (55 ＋45）溶液和 30mL 石油醚,盖塞后滴水封严，150rpm 振荡 30min，静置 15min 后用快速 定性滤纸过滤于 125mL 分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于 100mL 烧杯内，从中 取 20.0 mL（相当于 4.0g 样品）置于另一 125mL 分液漏斗中，加入 20.0mL 三氯甲烷，振摇 2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）．放出三氯甲烷于 75mL 蒸发皿中， 再加 5.0mL 三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下 按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 4．植物油： 用小烧杯称取 4.0g 样品，用 20.0mL 石油醚，将样品移于 125mL 分液漏斗中，用 20.0mL 甲醇水(55 ＋45）溶液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油 4.0g 样为 4.575mL， 可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇）振摇 2min，静置分层后，放出下层甲醇水 溶液于 750mL 蒸发皿中。再用 5.0mL 甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿 中，以下按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 5．其它食品：可按照 G8 5009 有关章节提供的方法操作，最终提取物（相当于 4.0g 样 品） 应收集于 2.0m1 甲醇一 PBS(20＋80)中。 （二）样品测定 1、将下列试剂稀释后备用 PBS 一 T 洗液：390mL 蒸榴水稀释（1:40）； 底物液 A: 9mI 蒸溜水稀释（1:9）； 抗体: 7.0mL 洗液稀释（1:140）； 酶标二抗:10mL 洗液稀释（1:200）；
阴性对照液：200μ1抗体十200μ1空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置 2、抗体抗原反应 将抗体与等量样品提取液（溶液为甲醇一PBS)在玻璃试管内混合振荡后室温静置15 分钟。启封酶标板，用洗液2×3分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入此抗体 抗原反应液及空白对照液(3孔)和阴性对照液(3孔)，130如l/孔，37℃湿盒中瓣有（或加 盖以保持相对湿度)，2小时后，倒掉反应液并拍干，用洗液3×3分钟洗板，拍干。 3、酶标记反应 加入酶标二抗，100μ1/孔，37℃盒中孵有1小时后，用洗液5×3分钟洗板，拍干。 4、显色反应 1g底物十2.5ml底物液A十42μ1底物液B,待底物充分溶解后加入酶标板，100μ1 /孔，37℃15分钟后加终止液40μ1/孔。 5、测定 酶标仪490nm测定各孔0.D值。 五、数据处理及计算结果： 1、求出各孔的0.D校正值：0.D校正值=0.D实测值一空白对照孔0.D值（均值）。 2、求出待测样的0.D%值：0.D%=[0.D校正值/阴性对照孔0.D校正值（均值）]×100%。 3、求出待测样AFB,含量(g/g):在标准竞争抑制曲线上找到待测样0.D%值（座标Y值） 的对应点，该点座标X值的反对数(10x)即为样品中AFB:的含量(ng/g),见图1。 大、使用进口试剂盒检测的主要实验步骤 1.样品提取：取5.0g样品与锥形瓶中，加入70%甲醇25ml,振摇3min,过滤 于分液漏斗中，静置分层，放出下层的甲醇水提取液，即为样品提取液。（亦 可根据样品中黄曲霉毒素含量进行适当稀释为待测样液) 2.免疫反应：红色微孔中加入蓝色试剂100μ1，分别加入标准品和样品各 100μl,三次混匀，移100μ1到白色抗体孔，摇匀，室温反应10min,弃去 液体，用去离子水洗5次，用吸水纸扣干 3.显色反应：加入绿色试剂100ul,摇匀，室温反应10min,加入红色试剂 100μ1，终止反应。 4.结果检测：在450nm处用酶标仪检测
阴性对照液:200μl 抗体十 200μl 空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。 2、抗体抗原反应 将抗体与等量样品提取液（溶液为甲醇一 PBS）在玻璃试管内混合振荡后室温 静置 15 分钟。启封酶标板，用洗液 2×3 分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入此抗体 抗原反应液及空白对照液（3 孔）和阴性对照液（3 孔）,130μl／孔,37℃湿盒中孵育（或加 盖以保持相对湿度），2 小时后，倒掉反应液并拍干,用洗液 3×3 分钟洗板，拍干。 3、酶标记反应 加入酶标二抗，100μl／孔，37℃盒中孵育 1 小时后，用洗液 5×3 分钟洗板，拍干。 4、显色反应 lmg 底物十 2.5m1 底物液 A ＋42μl 底物液 B，待底物充分溶解后加入酶标板，100μl ／孔，37℃15 分钟后加终止液 40μl／孔。 5、测定 酶标仪 490nm 测定各孔 0.D 值。 五、数据处理及计算结果： 1、求出各孔的 0.D 校正值：0.D 校正值＝O.D 实测值一空白对照孔 0.D 值（均值）。 2、求出待测样的 0.D％值：0.D％＝[O.D 校正值/阴性对照孔 0.D 校正值（均值）］× 100％。 3、求出待测样 AFB1 含量（ng／g）：在标准竞争抑制曲线上找到待测样 0.D％值（座标 Y 值） 的对应点，该点座标 X 值的反对数（10x）即为样品中 AFB1 的含量（ng／g），见图 1。 六、使用进口试剂盒检测的主要实验步骤 1. 样品提取：取 5.0g 样品与锥形瓶中，加入 70％甲醇 25ml，振摇 3min，过滤 于分液漏斗中，静置分层，放出下层的甲醇水提取液，即为样品提取液。（亦 可根据样品中黄曲霉毒素含量进行适当稀释为待测样液） 2. 免疫反应：红色微孔中加入蓝色试剂 100μl，分别加入标准品和样品各 100μl，三次混匀，移 100μl 到白色抗体孔，摇匀，室温反应 10min，弃去 液体，用去离子水洗 5 次，用吸水纸扣干 3. 显色反应：加入绿色试剂 100μl，摇匀，室温反应 10min，加入红色试剂 100μl，终止反应。 4. 结果检测：在 450nm 处用酶标仪检测
七、注意事项及说明： 1、带手套操作。酶标板用后处理，不能重复使用。样品提取过程中用过的玻璃仪器需要重 复使用时，应作解毒处理后，再洗涤。 2、操作时应手持酶标板板框，避免液体等沾污板底部，以保持酶标洁度。 3、试剂盒如需分次使用，应在每次使用前根据用量稀释试剂，每次用多少稀释多少，剩下 的酶标板和试剂，应及时封存，4℃保存备用。如需保存较长时间则应-20℃保存。但反复 冻融后，将导致抗体效价下降。 4、结果判定：根据参考资料三：现行国家食品（饲料）卫生标准中规定的FB允许量标准 对检测样品AFB,污染程度进行判定。 5、具体分析还要根据试剂盒的具体要求。 八、思考愿： 1、简述ELISA方法定量检测黄曲霉毒素B1的原理？ 2、实验对样品进行前处理的作用？ 3、影响检测准确性主要有哪些因素？ 4、酶标仪操作过程要注意些什么？
七、注意事项及说明： 1、带手套操作。酶标板用后处理，不能重复使用。样品提取过程中用过的玻璃仪器需要重 复使用时，应作解毒处理后,再洗涤。 2、操作时应手持酶标板板框，避免液体等沾污板底部，以保持酶标洁度。 3、试剂盒如需分次使用，应在每次使用前根据用量稀释试剂，每次用多少稀释多少，剩下 的酶标板和试剂，应及时封存，4℃保存备用。如需保存较长时间则应-20℃保存。 但反复 冻融后，将导致抗体效价下降。 4、结果判定：根据参考资料三：现行国家食品（饲料）卫生标准中规定的 AFB1 允许量标准 对检测样品 AFB1 污染程度进行判定。 5、具体分析还要根据试剂盒的具体要求。 八、思考题： 1、简述 ELISA 方法定量检测黄曲霉毒素 B1 的原理？ 2、实验对样品进行前处理的作用？ 3、影响检测准确性主要有哪些因素？ 4、酶标仪操作过程要注意些什么？