食品微生物学 实验指导书 周红朱新荣史学伟编 石河子大学食品学院 二00九年九月
食 品 微 生 物 学 实 验 指 导 书 周 红 朱新荣 史学伟 编 石 河 子 大 学 食 品 学 院 二 ○ ○ 九 年 九 月
实验须知 .3 第一部分 微生物学基本实验技术 4 普通光学显微镜的枸造和使用 4 实验 细菌的简单染色 实验 细菌的革兰氏染色 ...12 实验四 细菌的芽孢染色 .14 实验五 细黄的苹膜染色 16 实验 细菌的鞭毛染色 实验十 细菌的运动性观察 实验八 霉菌的形态观察 .22 实验九 酵母南的形态观察 ...24 实验十 放线菌的形态观察 25 四大类微生物菌落形态的比较和识别 26 微生物 小的测 实验十 微生物细胞总数的测定 …32 实验十四 培养基的配制 .34 实验十五培养基的灭菌 39 实哈十六 微生物的接种及分离技术 43 实验十七 水分活性对微生物生长的影响 51 实验十八 温度对微生物生长的影响 实验十九 化学药品对微生物生长的影响 54 实哈二十 紫外线照射对微生物生长的影响， .55 实验二 微生物的耐盐性试验 56 实验二 微生物的耐性试验 第二部分 食品微生物的检验技术 实验 食品中菌落总数测定 .58 实验 食品中强有和醛母的侧定 .62 立哈 食品中大肠菌群的测定 65 实验四 沙门氏菌属检验 71 实验 志贺氏菌检验 77 实验六 病原性大肠艾希氏茵检路 .81 实验七 肉毒梭菌及肉毒毒素检验 ,86 第三部分专业综合设计实验 89 实验 酒曲中酵母南的分离 实验 酸泡菜中乳酸菌的分离 92 实验 醋醪中醋酸菌的分 实验四 红曲的制备及红方腐乳的制作 .96 实拾五用 动物食品中蛋白质卧解南的检香与计数 ..98 实验六 鲜肉中微生物的分离与计数 实哈十 蔬菜上微生物的分离和计数 100 实 中微生物的检查 实验九 甜酒酿的制做 .104 附录一 试剂、药品使用常识 105 附录二 实验用试剂的配制 107
实 验 须 知..............................................................................................................................3 第一部分 微生物学基本实验技术.....................................................................................................4 实验一 普通光学显微镜的构造和使用......................................................................................4 实验二 细菌的简单染色.........................................................................................................10 实验三 细菌的革兰氏染色.....................................................................................................12 实验四 细菌的芽孢染色.........................................................................................................14 实验五 细菌的荚膜染色.........................................................................................................16 实验六 细菌的鞭毛染色.........................................................................................................18 实验七 细菌的运动性观察.....................................................................................................20 实验八 霉菌的形态观察.........................................................................................................22 实验九 酵母菌的形态观察.....................................................................................................24 实验十 放线菌的形态观察.....................................................................................................25 实验十一 四大类微生物菌落形态的比较和识别.........................................................................26 实验十二 微生物大小的测定.....................................................................................................29 实验十三 微生物细胞总数的测定..............................................................................................32 实验十四 培养基的配制............................................................................................................34 实验十五 培养基的灭菌............................................................................................................39 实验十六 微生物的接种及分离技术...........................................................................................43 实验十七 水分活性对微生物生长的影响....................................................................................51 实验十八 温度对微生物生长的影响...........................................................................................53 实验十九 化学药品对微生物生长的影响....................................................................................54 实验二十 紫外线照射对微生物生长的影响................................................................................55 实验二一 微生物的耐盐性试验..................................................................................................56 实验二二 微生物的耐糖性试验..................................................................................................57 第二部分 食品微生物的检验技术..................................................................................................58 实验一 食品中菌落总数测定..................................................................................................58 实验二 食品中霉菌和酵母菌的测定.......................................................................................62 实验三 食品中大肠菌群的测定..............................................................................................65 实验四 沙门氏菌属检验.........................................................................................................71 实验五 志贺氏菌检验............................................................................................................77 实验六 病原性大肠艾希氏菌检验...........................................................................................81 实验七 肉毒梭菌及肉毒毒素检验...........................................................................................86 第三部分 专业综合设计实验............................................................................................................89 实验一 酒曲中酵母菌的分离..................................................................................................89 实验二 酸泡菜中乳酸菌的分离..............................................................................................92 实验三 醋醪中醋酸菌的分离..................................................................................................94 实验四 红曲的制备及红方腐乳的制作....................................................................................96 实验五 动物食品中蛋白质分解菌的检查与计数......................................................................98 实验六 鲜肉中微生物的分离与计数.......................................................................................99 实验七 蔬菜上微生物的分离和计数..................................................................................... 100 实验八 牛奶中微生物的检查................................................................................................ 101 实验九 甜酒酿的制做.......................................................................................................... 104 附录一 试剂、药品使用常识................................................................................................ 105 附录二 实验用试剂的配制................................................................................................... 107
附录三 常用染色液 108 附录四 常用培养基 110 实 验 须知 微生物学实验课是一门操作技能较强的课程。通过本课程学习要求学生：牢 固地建立无菌概念，掌握微生物实验的一套基本操作技术；树立严谨、求实的科 学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力：树立勤俭节约、爱护公物、相 互协作的优良作风： 为了提高教学效果，保证实验的质量和实验室的安全，我们根据微生物实验 工作的特点，提出如下几点注意事项： 1.每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验的目的、原理和方法。 初步熟悉实验操作中的主要步骤和环节，使对整个实验的安排做到先后有序、有 条不紊和避免差错」 2.非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品（包括衣帽、书包等）应 放在不影向实验操作的地方。 3.每次实验前须用湿布按净台面，必要时可用“洁尔灭”溶液擦(0.1%浓 度)。实验前要洗手，以减少染菌的几率 4.微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作、防止杂菌污 染。为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点： ()在进行接种操作时，要关闭门窗，以防止空气对流。 (2)接种时尽量不要走动和讲话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅，而导致杂菌 污染 (3)凡用过的带菌移掖管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入5%石炭酸 或其他消毒液中浸泡20mi血，然后再取出清洗以免污染环境。 (4)在清洗带菌的培养皿、三角瓶或试管等之前应先煮沸半小时或进行加压 蒸汽灭菌。 (⑤)微生物学工作者在进行实验操作时应穿上工作服，离开时脱去，并经常 洗涤以保持清洁
附录三 常用染色液.............................................................................................................. 108 附录四 常用培养基.............................................................................................................. 110 实 验 须 知 微生物学实验课是一门操作技能较强的课程。通过本课程学习要求学生：牢 固地建立无菌概念，掌握微生物实验的一套基本操作技术；树立严谨、求实的科 学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力；树立勤俭节约、爱护公物、相 互协作的优良作风。 为了提高教学效果，保证实验的质量和实验室的安全，我们根据微生物实验 工作的特点，提出如下几点注意事项： 1．每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验的目的、原理和方法。 初步熟悉实验操作中的主要步骤和环节，使对整个实验的安排做到先后有序、有 条不紊和避免差错。 2．非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品(包括衣帽、书包等)应 放在不影响实验操作的地方。 3．每次实验前须用湿布按净台面，必要时可用“洁尔灭”溶液擦（0.1％浓 度)。实验前要洗手，以减少染菌的几率。 4．微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作、防止杂菌污 染。为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点： (1)在进行接种操作时，要关闭门窗，以防止空气对流。 (2)接种时尽量不要走动和讲话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅，而导致杂菌 污染。 (3)凡用过的带菌移掖管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入 5％石炭酸 或其他消毒液中浸泡 20 min，然后再取出清洗以免污染环境。 (4)在清洗带菌的培养皿、三角瓶或试管等之前应先煮沸半小时或进行加压 蒸汽灭菌。 (5)微生物学工作者在进行实验操作时应穿上工作服，离开时脱去，并经常 洗涤以保持清洁
第一部分 微生物学基本实验技术 实验一 普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1、了解普通光学显微镜的构造和原理，正确掌握油镜的使用方法。 2、学会观察微生物的基本形态。 二、光学显徽镜的结构及其基本原理 (一)光学显微镜的结构光学显微镜是由一组光学放大系统和机械支持及 调节系统组成（图1）。 目镜 节医 目镜筒 银调手 聚光镜升降测节手轮 粗调焦手轮的松紧调节手轮 集光的 图1光学显微镜构造示意图 1、机械系统部件显微镜的机械部件，是整个显微镜装配的骨架，它是安
第一部分 微生物学基本实验技术 实验一 普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1、了解普通光学显微镜的构造和原理，正确掌握油镜的使用方法。 2、学会观察微生物的基本形态。 二、光学显微镜的结构及其基本原理 （一）光学显微镜的结构 光学显微镜是由一组光学放大系统和机械支持及 调节系统组成（图 l）。 图 1 光学显微镜构造示意图 1、机械系统部件 显微镜的机械部件，是整个显微镜装配的骨架，它是安
装光学放大系统的基座。显微镜的机械部件包括镜座、载物台、物镜转换器、镜 筒和调节器等。 (1)镜座镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它 上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基座。 (2)载物台又称镜台，是载放被观察标本的地方。在用低倍镜观察样品 时（如平皿上的菌落），用手移动样品就可以了，如用高倍镜或油镜观察时，用 载物台上的压片夹固定样品。较好的显微镜则是用标本移动器（或称推进器）， 转动旋钮，可以使标本前、后、左、右移动。有的标本移动器带有标尺，可指明 标本所在位置。 (3)粗、细调节旋钮粗调节旋钮和细调节旋钮是调节镜筒或载物台上下 移动的装置，以达到调焦的目的。一般较好的显微镜，其粗、细调节旋钮是共轴 式的，在细调节旋钮外侧还刻有分度，可用于测量被检物体的厚度。 (4)物镜转换器它是装配物镜用的，可以装配46个物镜。由于观察样 品时，需要从低倍镜转向高倍镜以至油镜，因此，在物镜转换器上按顺序安装一 套不同放大倍数的物镜，使用起来很是方便。 (5)镜筒从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称机械镜筒。因为物镜的放大 率是对一定的镜筒长度而言的。镜简长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且 成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将 显微镜的标准筒长定为160mm,此数字标在物镜的外壳上。 2、光学放大系统部件光学显微镜的 光学系统包括光源、聚光器、物镜和目镜等 (图2)。 (1)光源光源是普通显微镜的取光 设备，通常使用内置式、亮度可调光源。一 般采用1220W卤素灯泡。 (2)聚光器聚光器安装在载物台下， 其作用是将光源的光线聚焦于样品上，以得 到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效 果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被 检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的 焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为 载物台平面下方0.lmm。因此，要求使用的 载玻片厚度应在0.81.2mm之间，否则被检 图2显微镜的光学系统 光源2.聚光镜3.标本4.物镜5.半五角棱镜6场 样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前 镜7.接日透镜Q聚光器孔径光栏B.目镜市场光栏
装光学放大系统的基座。显微镜的机械部件包括镜座、载物台、物镜转换器、镜 筒和调节器等。 （1）镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它 上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基座。 （2）载物台 又称镜台，是载放被观察标本的地方。在用低倍镜观察样品 时（如平皿上的菌落），用手移动样品就可以了，如用高倍镜或油镜观察时，用 载物台上的压片夹固定样品。较好的显微镜则是用标本移动器（或称推进器）， 转动旋钮，可以使标本前、后、左、右移动。有的标本移动器带有标尺，可指明 标本所在位置。 （3）粗、细调节旋钮 粗调节旋钮和细调节旋钮是调节镜筒或载物台上下 移动的装置，以达到调焦的目的。一般较好的显微镜，其粗、细调节旋钮是共轴 式的，在细调节旋钮外侧还刻有分度，可用于测量被检物体的厚度。 （4）物镜转换器 它是装配物镜用的，可以装配 4~6 个物镜。由于观察样 品时，需要从低倍镜转向高倍镜以至油镜，因此，在物镜转换器上按顺序安装— 套不同放大倍数的物镜，使用起来很是方便。 （5）镜筒 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称机械镜筒。因为物镜的放大 率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且 成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将 显微镜的标准筒长定为 160mm，此数字标在物镜的外壳上。 2、光学放大系统部件 光学显微镜的 光学系统包括光源、聚光器、物镜和目镜等 （图 2）。 （1）光源 光源是普通显微镜的取光 设备，通常使用内置式、亮度可调光源。一 般采用 12/20W 卤素灯泡。 （2）聚光器 聚光器安装在载物台下， 其作用是将光源的光线聚焦于样品上，以得 到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效 果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被 检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的 焦点在其上方 1.25mm 处，而其上升限度为 载物台平面下方 0.1mm。因此，要求使用的 载玻片厚度应在 0.8~1.2mm 之间，否则被检 样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前 图 2 显微镜的光学系统 1.光源 2.聚光镜 3.标本 4.物镜 5.半五角棱镜 6.场 镜 7.接目透镜 Q.聚光器孔径光栏 B.目镜市场光栏
透镜组前面还装有孔径光栏，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差 若将孔径光栏开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑：若收拢孔径光栏 过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过孔径光栏的调节再把视场 光栏（具备视场光栏的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在物视场内的物 体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。 (3)物镜安装在镜筒前端物镜转换器上的透镜。利用光线使被检物体第 一次造像，因而直接关系和影响着成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物 镜的性能可以从物镜外壳上标志着的数值孔径(numerical apeature,简写为NA) 大小来表示。NA是指物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率()和镜口角 (u)半数的正弦之乘积，可用公式表示： NA=n-sin u/2 数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据。分辨力是指显微镜 能辨别物体两点之间最小距离的能力。用8表示，其公式如下：6=1/NA 从公式中可看出，NA愈大，或观察时所用光波愈短，则分辨力愈大。提高 分辨力有下述措施： ①选择波长较短的光源，在使用可见光（如卤素灯或钨丝灯）作光源时，可 加蓝色滤光片以吸收长波的红、橙光，使波长接近于平均波长(0.55μm)。如果 使用波长为0.27μm的紫外光为光源，其分辨力可提高2倍。 ②增大介质的折射率。空气折射率为1.0，水折射率为1.33，玻璃折射率为 1.52,香柏油折射率为1.51。所以在观察细菌形态时，都使用油浸物镜，目的是 利用香柏油与玻璃的折射率近似的特性，以减少光线从一介质进入另一介质时产 生折射而散失，可增强视野的亮度和提高分辨力。 ③增大物镜的镜口角，但其极限值最大也难达到180°，改良余地很小。 ④增加明暗反差，使标本的明暗对比增强，这也是提高清晰度的一项措施。 另外，物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体 之间的介质不同，可分为： ①干燥系物镜以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小 于1。 ②油浸系物镜常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜，其放大率为90× 100×,数值孔径值大于1。 根据物镜放大率的高低，可分为： ①低倍物镜指1X一6×，NA值为0.04一0.15： ②中倍物镜指6×一25×，NA值为0.15一0.40： ③高倍物镜指25×一63×，NA值为0.35一0.95：
透镜组前面还装有孔径光栏，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差， 若将孔径光栏开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收拢孔径光栏 过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过孔径光栏的调节再把视场 光栏（具备视场光栏的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在物视场内的物 体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。 （3）物镜 安装在镜筒前端物镜转换器上的透镜。利用光线使被检物体第 一次造像，因而直接关系和影响着成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物 镜的性能可以从物镜外壳上标志着的数值孔径（numerical apeature，简写为 NA） 大小来表示。NA 是指物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（η）和镜口角 （u）半数的正弦之乘积，可用公式表示： NA = sin u / 2 数值孔径的大小又是衡量—台显微镜分辨力强弱的依据。分辨力是指显微镜 能辨别物体两点之间最小距离的能力。用δ表示，其公式如下： = / NA 从公式中可看出，NA 愈大，或观察时所用光波愈短，则分辨力愈大。提高 分辨力有下述措施： ①选择波长较短的光源，在使用可见光（如卤素灯或钨丝灯）作光源时，可 加蓝色滤光片以吸收长波的红、橙光，使波长接近于平均波长（0.55μm）。如果 使用波长为 0.27μm 的紫外光为光源，其分辨力可提高 2 倍。 ②增大介质的折射率。空气折射率为 1.0，水折射率为 1.33，玻璃折射率为 1.52，香柏油折射率为 1.51。所以在观察细菌形态时，都使用油浸物镜，目的是 利用香柏油与玻璃的折射率近似的特性，以减少光线从一介质进入另一介质时产 生折射而散失，可增强视野的亮度和提高分辨力。 ③增大物镜的镜口角，但其极限值最大也难达到 180o，改良余地很小。 ④增加明暗反差，使标本的明暗对比增强，这也是提高清晰度的一项措施。 另外，物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体 之间的介质不同，可分为： ①干燥系物镜 以空气为介质，如常用的 40×以下的物镜，数值孔径均小 于 l。 ②油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜，其放大率为 90×— 100× ，数值孔径值大于 1。 根据物镜放大率的高低，可分为： ①低倍物镜 指 l× — 6×，NA 值为 0.04 — 0.15； ②中倍物镜 指 6× — 25×， NA 值为 0.15 — 0.40； ③高倍物镜 指 25× — 63×，NA 值为 0.35 — 0.95；
④油浸物镜指90×一100×，NA值为1.25一1.40. 根据物镜像差校正的程度来分类可分为： ①消色差物镜是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，主要可以校正 轴上点的位置色差（红、蓝二色）和球差（青光）以及近轴点慧差。镜检时通常 与惠更斯目镜配合使用。 ②复消色差物镜物镜外壳上标有“Apo”字样。除能校正红、蓝、绿三色 光的色差外，还能校正黄色光造成的相差。通常与补偿目镜配合使用。 ③特种物镜在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。 如：带校正环物镜：带虹彩光栏物镜：相衬物镜：荧光物镜：无应变物镜：无罩 物镜：长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜(FL), 平场物镜(Plan),平场复消色差物镜(Plan Apo),超平场物镜(Splan),超平 场复消色差物镜(Splan Apo)等。 (4)目镜目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入 观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两个透镜 组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在 两个透镜的下方，装有由金属制的环状光栏或叫“视场光栏”，物镜放大后的中 间像就落在视场光栏平面处，所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜(Huygens eyepiece),如果要进 行研究用时，一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜(K)、平场目镜(P)、广 视场目镜(WF)。照相时选用照相目镜(NFK)。 (二)光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。因此 由透镜组组合起来相当于一个凸透镜， 起到放大的作用，图3是显微镜的成像 原理模式。AB为标本一一物镜L0 目镜Le一一眼睛。A"B"和眼点的距离 为显微镜的明视距离，它的成像原理 是：标本AB的像经过L0(物镜)后 到AB处成为一个放大倒立的实像（中 间像)，F为L0的后焦点。当光线传递 到Le(目镜)时，AB的实像在AB 目镜 处被放大成一个直立（相对中间像而 图3显徽镜的成像原理模式图 言)的虚像，然后传递到视网膜AB 上，标本AB就被放大了，人眼看到的AB被放大后的虚像AB'与原样品像的方
④油浸物镜 指 90× — 100×， NA 值为 1.25 — 1.40。 根据物镜像差校正的程度来分类可分为： ①消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，主要可以校正 轴上点的位置色差（红、蓝二色）和球差（青光）以及近轴点慧差。镜检时通常 与惠更斯目镜配合使用。 ②复消色差物镜 物镜外壳上标有“Apo”字样。除能校正红、蓝、绿三色 光的色差外，还能校正黄色光造成的相差。通常与补偿目镜配合使用。 ③特种物镜 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。 如：带校正环物镜；带虹彩光栏物镜；相衬物镜；荧光物镜；无应变物镜；无罩 物镜；长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜（FL）， 平场物镜（Plan），平场复消色差物镜（Plan Apo），超平场物镜（Splan），超平 场复消色差物镜（Splan Apo）等。 （4）目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入 观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两个透镜 组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在 两个透镜的下方，装有由金属制的环状光栏或叫“视场光栏”，物镜放大后的中 间像就落在视场光栏平面处，所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（Huygens eyepiece），如果要进 行研究用时，一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广 视场目镜（WF）。照相时选用照相目镜（NFK）。 （二）光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。因此 由透镜组组合起来相当于一个凸透镜， 起到放大的作用。图 3 是显微镜的成像 原理模式。AB 为标本——物镜 Lo—— 目镜 Le——眼睛。A"B"和眼点的距离 为显微镜的明视距离，它的成像原理 是：标本 AB 的像经过 Lo（物镜）后 到 AB 处成为一个放大倒立的实像（中 间像），F 为 Lo 的后焦点。当光线传递 到 Le（目镜）时，AB 的实像在 AB 处被放大成一个直立（相对中间像而 言）的虚像，然后传递到视网膜 AB 上，标本 AB 就被放大了，人眼看到的 AB 被放大后的虚像 A'B'与原样品像的方
向是相反的。 三、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。 (一)观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或木盒内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座， 平稳地将显微镜搬运到实验桌上。 2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放 记录本或绘图纸。 3、调节亮度插好电源插头，打开显微镜主电源开关，通过亮度调节旋钮 调整照明度，使物像清晰。 4、调节光轴中心显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜 和目镜的光轴及光栏的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。如具备视场光栏 的显微镜，调节时先将视场光栏缩小，用10×物镜观察，在视场内可见到视场 光栏圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，则利用聚光器外侧的两个调整 旋钮将其调至中央，然后缓慢地将视场光栏打开，能看到光束向视场周缘均匀展 开直至视场光栏的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。 (二)低倍镜观察镜检任何标本要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为 低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。 将标本制片放置载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处 在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜降至距标本0、5cm处，用目镜观察并 同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒或下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮 使物像清晰为止。移动标本，找到合适的目的物并将它移到视野中央，进行观察 或为下步进行高倍镜观察用。 (三)高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。在正常情况下， 高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片，若使用不同型号的物镜，在转 换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调整光亮适度， 缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升或镜筒下降，直至物像出现，再用细调节旋 钮调至物像清晰为止。找到需观察的部位，并移至视野中心进行观察或准备用油 镜观察用。 (四)油镜观察油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之 间的距离)很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有 “弹簧装置”因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标
向是相反的。 三、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。 （一）观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或木盒内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座， 平稳地将显微镜搬运到实验桌上。 2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约 10cm 左右，右侧可放 记录本或绘图纸。 3、调节亮度 插好电源插头，打开显微镜主电源开关，通过亮度调节旋钮 调整照明度，使物像清晰。 4、调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜 和目镜的光轴及光栏的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。如具备视场光栏 的显微镜，调节时先将视场光栏缩小，用 10×物镜观察，在视场内可见到视场 光栏圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，则利用聚光器外侧的两个调整 旋钮将其调至中央，然后缓慢地将视场光栏打开，能看到光束向视场周缘均匀展 开直至视场光栏的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。 （二）低倍镜观察 镜检任何标本要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为 低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。 将标本制片放置载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处 在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜降至距标本 0、5cm 处，用目镜观察并 同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒或下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮 使物像清晰为止。移动标本，找到合适的目的物并将它移到视野中央，进行观察 或为下步进行高倍镜观察用。 （三）高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。在正常情况下， 高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片，若使用不同型号的物镜，在转 换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调整光亮适度， 缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升或镜筒下降，直至物像出现，再用细调节旋 钮调至物像清晰为止。找到需观察的部位，并移至视野中心进行观察或准备用油 镜观察用。 （四）油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之 间的距离）很短，一般在 0.2mm 以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有 “弹簧装置”因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标
本制片，使物镜也受到损害。必须按下列步骤操作： 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm,再转换油浸物 镜至中央。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将镜筒缓慢地下降（或上升载物台），使油浸 物镜浸入香柏油中，其镜头几乎与标本接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光栏及聚光镜的孔径光栏，上调聚光器，使 光线充分照明。用粗调节旋钮将镜筒徐徐上升（此时绝不能将镜简下降），当出 现物像后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物像， 必须再从侧面观察，重复操作。 5、观察完毕，上升镜筒，转动物镜转换器，使油没物镜偏位，先用擦镜纸 擦去镜头上的油，再用擦镜纸雄少许乙醚酒精混合液（乙醚2份十纯酒精3份） 或二甲苯。擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭干净即可。 6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而 是成八字形位置，再下降至最低，降下聚光器，调节亮度旋钮至光线最暗，关闭 主电源开关，拔掉电源线。用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放 回柜内
本制片，使物镜也受到损害。必须按下列步骤操作： 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约 2cm，再转换油浸物 镜至中央。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将镜筒缓慢地下降（或上升载物台），使油浸 物镜浸入香柏油中，其镜头几乎与标本接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光栏及聚光镜的孔径光栏，上调聚光器，使 光线充分照明。用粗调节旋钮将镜筒徐徐上升（此时绝不能将镜筒下降），当出 现物像后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物像， 必须再从侧面观察，重复操作。 5、观察完毕，上升镜筒，转动物镜转换器，使油浸物镜偏位，先用擦镜纸 擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚 2 份十纯酒精 3 份） 或二甲苯。擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭干净即可。 6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而 是成八字形位置，再下降至最低，降下聚光器，调节亮度旋钮至光线最暗，关闭 主电源开关，拔掉电源线。用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放 回柜内
实验二 细菌的简单染色 一、目的要求 1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握简单染色法和无菌操作技术。 2、巩固显微镜的使用方法。 二、实验原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细猪的细胞小而秀 明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与 背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染 料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它 生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如 美蓝、结品紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能 与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正 电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两 者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法即仅用一种染料使细菌着色。此法虽手续简便，但一般只能显示 其形态，不能辨别其构造。 染色前必须先固定细菌。其目的有二，一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上： 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量 维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 三、实验器材 I、菌种大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus awreus)。 2、仪器显微镜。 3、染料草酸铵结晶紫或石炭酸复红。 4、材料载玻片，擦镜纸，二甲苯，香柏油和玻片搁架等 四、操作步骤 1、涂片在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水、用无菌的接种环挑取 少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，让其自然晾干。 2、固定手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火3次（用手指触涂 片反面，以不烫手为易)。待玻片冷却后，再加染料
实验二 细菌的简单染色 一、目的要求 1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握简单染色法和无菌操作技术。 2、巩固显微镜的使用方法。 二、实验原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透 明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与 背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染 料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它 生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如 美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能 与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正 电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两 者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法即仅用一种染料使细菌着色。此法虽手续简便，但一般只能显示 其形态，不能辨别其构造。 染色前必须先固定细菌。其目的有二，一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上； 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量 维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 三、实验器材 1、菌种 大肠杆菌（Escherichia coli ）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 2、仪器 显微镜。 3、染料 草酸铵结晶紫或石炭酸复红。 4、材料 载玻片，擦镜纸，二甲苯，香柏油和玻片搁架等。 四、操作步骤 1、涂片 在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水、用无菌的接种环挑取 少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，让其自然晾干。 2、固定 手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火 3 次（用手指触涂 片反面，以不烫手为易）。待玻片冷却后，再加染料