实验须知 普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物 学的基本知识：加深理解课堂讲授的某些微生物理论。同时，通过实验：培养学生观察、思 考、分析问题、解决问题和提出问题的能力：养成事实求是、严肃认真的科学态度，以及敢 于创新的开拓精神：树立物俭节约、爱护公物的良好作风 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验目的、原理和方法，做到心 中有数，思路清晰。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记 下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇到盛茵试管或瓶不慎打 破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告知道教师，及时处理， 切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使用乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关 掉火源，在用湿布或沙土掩盖灭火。必要时使用灭火机。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力 求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有的仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如 有南液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖15h后擦去， 如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗 涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师制定的地点 进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真 回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.离开实验室前将手洗净，注意关闭火、煤气、门窗、灯等
实验须知 普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物 学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物理论。同时，通过实验；培养学生观察、思 考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成事实求是、严肃认真的科学态度，以及敢 于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1. 每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验目的、原理和方法，做到心 中有数，思路清晰。 2. 认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记 下每次观察的现象和结果，以便分析。 3. 实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4. 实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇到盛菌试管或瓶不慎打 破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告知道教师，及时处理， 切勿隐瞒。 5. 实验过程中，切勿使用乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关 掉火源，在用湿布或沙土掩盖灭火。必要时使用灭火机。 6. 使用显微镜或其他贵重仪器时，要细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力 求节约，用毕后仍放回原处。 7. 每次实验完毕后，必须把所有的仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如 有菌液污染桌面或其他地方时，可用 3%来苏尔液或 5%石炭酸液覆盖 1.5h 后擦去， 如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗 涤前须浸泡在 3%来苏尔液中进行消毒。 8. 每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师制定的地点 进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9. 每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真 回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10. 离开实验室前将手洗净，注意关闭火、煤气、门窗、灯等
目录 实验一 细菌的简单染色 9 实验二 细菌的革兰氏染色 .12 实验三 细菌的特殊染色· 4 实验四 酵母菌的形态观察 .17 实验五霉菌的形态观察 .19 实验六 徽生物大小的测定 .22 实验七培养基的制备 25 实验八 干热灭菌 31 实验九高压蒸汽灭菌 33 实验十紫外线灭菌。 .36 实验十一 微孔滤膜过滤除菌 38 实验十二 微生物接种技术 .…40 实验十三 微生物的分离与纯化 .47 实验十四微生物的培养特征 51 实验十五 厌氧微生物的培养 53 实验十六微生物血球计数板直接计数法 .58 实验十七 微生物的平板菌落计数法 …62 实验十八细菌生长曲线的测定 .65 实验十九土壤中放线菌的筛选及形态观察 68 附录1实验室意外事故的处理 .72 附录2实验器皿的清洗与包扎 .73 附录3实验用培养基的配制. 75 附录4酸碱指示剂的配制（按笔画顺序排列）… .79 附录5实验用染色液及试剂的配制. 80
目录 实验一 细菌的简单染色 ........................................................................9 实验二 细菌的革兰氏染色 ..................................................................12 实验三 细菌的特殊染色 ......................................................................14 实验四 酵母菌的形态观察 ..................................................................17 实验五 霉菌的形态观察 ......................................................................19 实验六 微生物大小的测定 ..................................................................22 实验七 培养基的制备 ..........................................................................25 实验八 干热灭菌 ..................................................................................31 实验九 高压蒸汽灭菌 ..........................................................................33 实验十 紫外线灭菌 ..............................................................................36 实验十一 微孔滤膜过滤除菌 ..............................................................38 实验十二 微生物接种技术 ..................................................................40 实验十三 微生物的分离与纯化..........................................................47 实验十四 微生物的培养特征 ..............................................................51 实验十五 厌氧微生物的培养 ..............................................................53 实验十六 微生物血球计数板直接计数法..........................................58 实验十七 微生物的平板菌落计数法..................................................62 实验十八 细菌生长曲线的测定..........................................................65 实验十九 土壤中放线菌的筛选及形态观察......................................68 附录 1 实验室意外事故的处理 ..............................................................72 附录 2 实验器皿的清洗与包扎 ..............................................................73 附录 3 实验用培养基的配制 ..................................................................75 附录 4 酸碱指示剂的配制(按笔画顺序排列) .......................................79 附录 5 实验用染色液及试剂的配制......................................................80
Ⅰ徽生物的染色与形态结构的观察 微生物由于个体微小，需借助普通光学显微镜、相差显微镜等设各来讲行观容，其中用相差 显微镜可以直接观察微生物的形态特征，但其应用有局限性：用电子显微镜可以观察到微生 物的各种形态结构，但因其价格昂责、设备条件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限 制。所以，一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而微生物 细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的 明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通显微镜观察细茵时 代先将细菌进行染物时 巴的 www.bbioo.com
I 微生物的染色与形态结构的观察 微生物由于个体微小，需借助普通光学显微镜、相差显微镜等设备来进行观察，其中用相差 显微镜可以直接观察微生物的形态特征，但其应用有局限性；用电子显微镜可以观察到微生 物的各种形态结构，但因其价格昂贵、设备条件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限 制。所以，一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而微生物 细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的 明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通显微镜观察细菌时， 往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以清楚地观察到细菌的形状及某些细 胞结构。因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态 结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。 www.bbioo.com
实验一 细菌的简单染色 一、目的要求 1.掌握细菌简单染色法。 2.通过简单染色法比较细菌菌体细胞形态和排列方式。 二、基本原理： 细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体者色，与背景形成鲜明的对比，以便 在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等 常用碱性染料如美蓝、结晶紫等对细胞进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱 酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸 性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌接合 使细菌着色。经染色后的细茵细胞与背景形成鲜明对比，在显微镜下更易于识别。 三、实验材料 L.菌种：乳酸链球菌(streptococcus lactis)、大肠杆菌(Escherichia col)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、红螺旋菌(rhodospirillum sp.）. 2.染料：吕氏美蓝染液、草酸铵结品紫染液。 3.其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。 四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片+干燥→固定+染色+水洗 →干燥+镜检 ()涂片：用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或先滴 小满无商木于载酸片中央，用接种怀了运了引 从斜面上挑出少许，与载玻片上的水 滴混合均匀，涂成一薄层。 11简单染色的周定
实验一 细菌的简单染色 一、目的要求 1. 掌握细菌简单染色法。 2. 通过简单染色法比较细菌菌体细胞形态和排列方式。 二、基本原理： 细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便 在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。 常用碱性染料如美蓝、结晶紫等对细胞进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱 酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸 性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌接合 使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比，在显微镜下更易于识别。 三、实验材料 1. 菌种：乳酸链球菌（streptococcus lactis）、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、红螺旋菌（rhodospirillum sp.）。 2. 染料：吕氏美蓝染液、草酸铵结晶紫染液。 3. 其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。 四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检。 （1）涂片：用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或先滴一 小滴无菌水于载玻片中央，用接种环 从斜面上挑出少许，与载玻片上的水 滴混合均匀，涂成一薄层。 图 1-1 简单染色的固定
(2)干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠 近火焰。 (3)周定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速 来回移动34次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉 过烫为宜，放置待冷后染色（图11）。 固定的目的是： ①杀死微生物，固定其细胞结构： ②保证南体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉： ③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易者色。 (4)染色：滴加吕氏美蓝液（或其它染色液），覆盖玻片涂菌部份，染色1分钟。 (5)水洗：用木炭夹夹住玻片的一端，斜置玻片，用细小的缓水流自标本的上端流下， 洗去多余的染料，勿使水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水无色为止。 (6)干燥：将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水份，或微微加热，以加快 干燥速度。 (7)镜检。 油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高， 然后将油镜转到工作位置，在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜 筒小心的降下，使油镜侵在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈， 若使用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应该在聚光镜和载玻片之间也加滴香柏油，保证其 达到最大的效能。调解照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出 现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述禄作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升 太快，以至眼晴捕捉不到一闪而过的物象，通此情况，应重新操作。另外应特别注意不要 因在下降镜头时用力过难，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及我玻片， (8)显微镜用毕后的处理： ①上升镜筒，取下载玻片。 ②用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸越少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹， 然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦找镜头，以免使镜头沾 上污渍或产生划痕，形响观察。 ③用擦镜纸清洁其他物镜及目镜：用绸布清洁显微镜的金属部件。 ④将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，在向下旋。同时把聚 光镜降下，以免接触物镜与聚光镜发生碰撞危险， 五、实验报告
（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠 近火焰。 （3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速 来回移动 3~4 次，共约 3~4 秒。要求玻片温度不超过 60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉 过烫为宜，放置待冷后染色（图 1-1）。 固定的目的是： ①杀死微生物，固定其细胞结构； ②保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。 （4）染色：滴加吕氏美蓝液（或其它染色液），覆盖玻片涂菌部份，染色 1 分钟。 （5）水洗：用木炭夹夹住玻片的一端，斜置玻片，用细小的缓水流自标本的上端流下， 洗去多余的染料，勿使水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水无色为止。 （6）干燥：将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水份，或微微加热，以加快 干燥速度。 （7）镜检。 油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高， 然后将油镜转到工作位置，在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜 筒小心的降下，使油镜侵在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈， 若使用聚光器的数值孔径值超过 1.0，还应该在聚光镜和载玻片之间也加滴香柏油，保证其 达到最大的效能。调解照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出 现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升 太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象，遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要 因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。 （8）显微镜用毕后的处理： ① 上升镜筒，取下载玻片。 ② 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹， 然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾 上污渍或产生划痕，影响观察。 ③ 用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。 ④ 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，在向下旋。同时把聚 光镜降下，以免接触物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、实验报告
根据观察结果，绘出细菌的形态图 六、思考题 1.制各细离染色标本时，尤其应该注意哪些环节 2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 3.如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问避？如果加热温度过高、时间太长， 有会怎样呢？ 4.简述油镜的使用方法，为什么使用油镜时要滴加香柏油？
根据观察结果，绘出细菌的形态图 六、思考题 1. 制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 3. 如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长， 有会怎样呢？ 4. 简述油镜的使用方法，为什么使用油镜时要滴加香柏油？
实验二细菌的革兰氏染色 一、目的要求 掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。 二、基本原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此 基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，因为通过此法染色， 可将细菌鉴别为革兰氏阳性茵(G)和革兰氏阴性菌(G)两大类， 革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用： 1,碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。 2.媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用 的媒染剂是碘液。 3.脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同， 而将细菌加以区分。革兰氏阳性细南不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细南则易被脱色。常 用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。 4.复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未 脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。 近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰氏染色的机制提出不同的看 法。一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩 小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色：而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂 肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻 止溶剂透入，因而将结品紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不 能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌 不同，但具有革兰氏染色阳性反应。 三、实验材料 1.菌种：大肠杆菌(E.col)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2.染料：草酸铵结品紫染液、路哥氏碘液、蕃红染液。 3.其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、95%乙醇 擦镜纸等
实验二 细菌的革兰氏染色 一、目的要求 掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。 二、基本原理： 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Christain Gram 氏创立的，而后一些学者在此 基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，因为通过此法染色， 可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+ ）和革兰氏阴性菌（G- ）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用： 1. 碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。 2. 媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用 的媒染剂是碘液。 3. 脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同， 而将细菌加以区分。革兰氏阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细菌则易被脱色。常 用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是 95%的乙醇。 4. 复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未 脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。 近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰氏染色的机制提出不同的看 法。一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩 小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂 肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻 止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不 能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌 不同，但具有革兰氏染色阳性反应。 三、实验材料 1. 菌种：大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2. 染料：草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、蕃红染液。 3. 其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、95%乙醇、 擦镜纸等
四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片 +干燥固定 →草酸铵结品紫染色 约60秒 30秒 +水洗 →路哥氏碘液媒染一 →95%洒精脱色 +水洗 蕃红复染 +水洗 +干燥镜检 30-60秒 应注意，碘液媒染30秒钟后，直接用95%酒精从载玻片的一端冲洗脱色，直到留下的 酒精无明显的紫色为止。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染 色中关键的一步。只有仔细操作，反复实践才能获得满意的实验结果。 五、实验报告 观察革兰氏染色反应的结果（说明各南的形状、颜色） 六、思考题 1.什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不超过24小时？ 2.热固定的日的是什么？ 3什么大多数细菌染色用性染料而不用酸性染料进行染色？ 4.指出革兰氏染色反应中关键步骤，并解释之
四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片 干燥固定 草酸铵结晶紫染色 水洗 路哥氏碘液媒染 95%酒精脱色 水洗 蕃红复染 水洗 干燥镜检 应注意，碘液媒染 30 秒钟后，直接用 95%酒精从载玻片的一端冲洗脱色，直到留下的 酒精无明显的紫色为止。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染 色中关键的一步。只有仔细操作， 反复实践才能获得满意的实验结果。 五、实验报告 观察革兰氏染色反应的结果（说明各菌的形状、颜色） 六、思考题 1. 什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不超过 24 小时？ 2. 热固定的目的是什么？ 3. 什么大多数细菌染色用碱性染料而不用酸性染料进行染色？ 4. 指出革兰氏染色反应中关键步骤，并解释之。 约 60 秒 30-60 秒 约 30 秒
实验三 细菌的特殊染色 一、目的要求： 学习掌握芽孢、荚膜染色的原理和方法。 二、基本原理： 芽孢染色： 芽孢又叫内生孢子(endospore心)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体， 通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊 是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 由于芽胞壁厚、透性低、不易者色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行染色时，菌体和 芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不者色或仅显很淡的颜色，有的芽孢成淡红或淡蓝色的圆或 椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。 芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行 染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，者色、脱色均较困难，当 用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其者色，而 进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。 荚膜染色： 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成份为多糖、糖蛋白或多肽。 由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以观察 英膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。由于荚膜 含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。 三、实验材料： 1.南种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis):营养琼脂斜面培养2Oh 肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides):肉汁等斜面培养20h 2.染料： (1)芽孢染色用7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）。 (2)荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。 其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无茵水 1%盐酸、电炉、墨汁、20%CuS04、95%乙醇、擦镜纸等
实验三 细菌的特殊染色 一、目的要求： 学习掌握芽孢、荚膜染色的原理和方法。 二、基本原理： 芽孢染色： 芽孢又叫内生孢子（endospore），是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体， 通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊 是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 由于芽胞壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行染色时，菌体和 芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，有的芽孢成淡红或淡蓝色的圆或 椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。 芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行 染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当 用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而 进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。 荚膜染色： 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成份为多糖、糖蛋白或多肽。 由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以观察 荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。由于荚膜 含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。 三、实验材料： 1. 菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)：营养琼脂斜面培养 20h 肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）：肉汁等斜面培养 20h 2. 染料： （1）芽孢染色用 7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）。 （2） 荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。 其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、 1%盐酸、电炉、墨汁、20%CuSO4、95%乙醇、擦镜纸等
四、实验方法与步骤： 芽孢染色： 1.孔雀绿染色法： 取一干净载片按无菌法取枯草芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂茵处 滴加7.6%的孔雀绿饱和水溶液，在微火上加热，染色10分钟后，用水冲洗，再用0.5% 蕃红花红液染色1分钟，水洗，风干后镜检。芽孢被染成绿色，营养体呈红色。 2.石炭酸复红染色法： 在一支小试管(10*100mm)中，滴入3-4滴蒸溜水，用接种环取枯草芽孢杆菌于水 中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。然后滴加等体积的(3-4滴)石炭酸复红 液摇匀。将此试管放入沸水浴中煮1015分钟，使芽孢及菌体者色。取此菌液2-3环在洁 净的载片上做成涂片，自然干燥通过火焰固定后，在自来水下缓缓冲洗，使菌体脱色， 再用吕氏美蓝液复染12分钟。用水洗去多余染液，轻轻用吸水纸吸去水分，干后镜检 结果可见芽孢被染成红色，南体呈现蓝色。 荚膜染色法 1.方法①刚果红染色 将刚果红水溶液和明胶水溶液各一滴滴于干净载片上：用接种环蘸取细菌培养液或 悬浮液在载片上于上述两滴溶液混匀，自然干燥：滴加1%HC1冲洗，使涂片呈蓝色：用 蒸馏水漂洗，除去HC1:,用美蓝复染1分钟，水洗，自然干燥后镜检。 镜检：有荚膜的菌，菌体蓝色，荚膜不着色，背景蓝紫色：无荚膜的菌，菌体蓝色，背 景蓝紫色。由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能有一圈狭窄的不者色环，但这不是英膜。 荚膜不着色的部分宽。 2.方法②湿墨汁法 ()制菌液：加一滴墨汁于洁净的波片上，并挑少量菌与其充分混合。 (2)加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸 收多余液。 (3)镜检。 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 3.方法③Anthony氏法 (1)涂片、固定：按常规法涂片，在空气中自然干燥。 (2)染色：用1%结晶紫水溶液染色2分钟。 (3)脱色：用20%CuS04水溶液洗，再用毛边纸吸干。 (4)镜检并观察结果：荚膜淡紫色，细胞深紫色
四、实验方法与步骤： 芽孢染色： 1. 孔雀绿染色法： 取一干净载片按无菌法取枯草芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处 滴加 7.6%的孔雀绿饱和水溶液，在微火上加热，染色 10 分钟后，用水冲洗，再用 0.5% 蕃红花红液染色 1 分钟，水洗，风干后镜检。芽孢被染成绿色，营养体呈红色。 2. 石炭酸复红染色法： 在一支小试管（10*100mm）中，滴入 3-4 滴蒸溜水，用接种环取枯草芽孢杆菌于水 中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。然后滴加等体积的(3-4 滴) 石炭酸复红 液摇匀。将此试管放入沸水浴中煮 10-15 分钟，使芽孢及菌体着色。取此菌液 2-3 环在洁 净的载片上做成涂片，自然干燥通过火焰固定后，在自来水下缓缓冲洗，使菌体脱色， 再用吕氏美蓝液复染 1-2 分钟。用水洗去多余染液，轻轻用吸水纸吸去水分，干后镜检， 结果可见芽孢被染成红色，菌体呈现蓝色。 荚膜染色法 1. 方法 ① 刚果红染色 将刚果红水溶液和明胶水溶液各一滴滴于干净载片上；用接种环蘸取细菌培养液或 悬浮液在载片上于上述两滴溶液混匀，自然干燥；滴加 1%HCl 冲洗，使涂片呈蓝色；用 蒸馏水漂洗，除去 HCl；，用美蓝复染 1 分钟，水洗，自然干燥后镜检。 镜检：有荚膜的菌，菌体蓝色，荚膜不着色，背景蓝紫色；无荚膜的菌，菌体蓝色，背 景蓝紫色。由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能有一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜。 荚膜不着色的部分宽。 2. 方法 ② 湿墨汁法 （1）制菌液：加一滴墨汁于洁净的波片上，并挑少量菌与其充分混合。 （2）加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下 轻压，吸 收多余菌液。 （3） 镜检。 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 3. 方法 ③ Anthony 氏法 （1） 涂片、固定：按常规法涂片，在空气中自然干燥。 （2） 染色：用 1％结晶紫水溶液染色 2 分钟。 （3） 脱色：用 20%CuSO4 水溶液洗，再用毛边纸吸干。 （4） 镜检并观察结果：荚膜淡紫色，细胞深紫色