1C867.040 C53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T5009.139-2003 代替GB/T16344一1996 饮料中咖啡因的测定 Determination of caffeine in beverages 2003-08-11发布 2004-01-01实艳 中华人民共和因卫生部 发布 中时国家标准化管理委员会 195
ICS 67.040 C 53 遏黔 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T 5009.139-2003 代替 GB/T 16344- 1996 饮料中咖啡因的测定 Determination of caffeine in beverages 2003-08-11发布 2004-01-01实施 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 *， 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 ‘ ’1
G8/T5009.139-2003 前 言 本标准代替GB/T16344一1998（饮料中0摩因的测定方法》. 本然准与GB/T16344一196相比主要修故知下， —按GB/T20001.4一2001《标准编写规则第4第分，化幸分析方然》对原标准的结构进行 了修改。 修改了标在的中文名称，标准中文名称改为（铁料中啡因的测定》。 本标准由中华人园共和国卫生都暖出并归口， 本标准品草单位：上海市食品卫生监智检验所，上海卫生检疫局， 本标准第一法主要起草人：何传琼，那理，方有紫，李媚良， 本标准第二法主要起耳人李绍良，庄慎派、毛星林.阿请琼。 原际准于1的6年首次发有，本次为第一次修订， 197
GB/T 5009.139--2003 前 言 本标准代替 GB/T 16344-1996《饮料中咖啡因的测定方法》。 本标准与GB/丁16344-1996相比主要修改如下: — 按GB/T 20001. 4-2001《标准编写规则 第4部分:化学分析方法》对原标准的结构进行 了修改。 — 修改了标准的中文名称，标准中文名称改为《饮料中咖啡因的测定》。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:上海市食品卫生监督检验所、上海卫生检疫局。 本标准第一法主要起草人:何倩琼、郑理、方有宗、李绍良。 本标准第二法主要起草人:李绍良、庄慎谦、毛显林、何倩琼。 原标准于 19% 年首次发布，本次为第一次修订
GB/T5009.139-2003 引言 咖耳因（©回f加e)义名咖体碱：属甲基黄哪珍化合物，化学名称为1：3,7-三甲基黄哪珍，具有提神属 蓝等刺雀中服神经作用，阳易上复。为此，各国朝定了体因在饮料中的食品卫生标准，美闪，如家大 阿根延、日本，菲律宾规定饮料中如对因的含量不得师过200mg/1,南新拉夫规定不得翻过120m螺/L, 我国列日葡为止审母风仅允许加人到可乐数比料其含量不得耀过150mg/kg,为了如强食品卫生监督 管事，建立咖理因的梅霍测定方法十分必要， 紫外分光光度法和高效液州色谱法《HPLC)是可乐型比料，霜啡和茶叶以及制或品中寒对因含量 的测定方法。简单，快速，准确。 196
GB/T 5009.139- 2003 引 言 咖啡因(caffeine)又名咖啡碱，属甲基黄嗦吟化合物，化学名称为 1,3,7一三甲基黄嗦吟，具有提神醒 脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。为此，各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准，美国、加拿大、 阿根廷、日本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200 mg/L，南斯拉夫规定不得超过120 mg/L, 我国到目前为止咖啡因仅允许加人到可乐型饮料其含量不得超过 150 mg/kg，为了加强食品卫生监督 管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。 紫外分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)是可乐型饮料、咖啡和茶叶以及制成品中咖啡因含量 的测定方法。简单、快速、准确
GB/T5009.139-2003 饮料中咖啡因的测定 1范图 本标准规定了可乐型饮料，塞唯，茶叶及其制成品中华因含量的刻定方法素外分光光度法和高 效液相色增法(HPLC), 本标准适用于可乐仗料、時，茶时及其解成品中咖啡因的测定。 本标准紫外法检出限：可乐塑饮科为3/L:如啡，茶叶及其齿体制品为5mg/100R:对嘘啡和蒸 叶的液体制品为5mg/L. 木标准HPLC法检出限，可乐仗料为0,2g/L:素叶、寓华及其制品为1,8mg/100g 第一法紫外分光光蒲法 2原理 边啡因的三案甲烷溶液在27区，5装长下有最大吸收，其限收值的大小与咖中因旅度成正比，从 前可进行定量， 3试利 3.1无水统酸钠， 32三氧甲统使用前重新薰第， 3.315/L高锰酸钾客液：称取1,5《高锰酸钾，用水酒解并稀释至10的mL, 3.4亚藏酸钠和植氟酸钾泥合溶液：称数108无水亚疏能钠(N物SO,),用水溶解并号释至100mL 另取10g硫家酸钾，用水溶解并稀释至100mL:格后二者均匀提合， 3.515%南酸溶液：吸取15mL磷酸置于100mL容量瓶中，用水解释系刻，程匀， 35200g/L氢氧化钠溶液：称取20g复氧化钠，用水溶解，净却后稀释至100ml, 3.7200g/L酵酸锌帝液：称数20g醋酸锌2n(CH,C00),·2H0]加人3mL沐乙酸，加水密解并 稀释至100mL. 3.8100/L亚铁氰化钾溶液：称取10g亚钱氟化钾[K,Fe(CN)e·3H,O]用水溶解并稀释至 100.mL. 39面峰因标准品：音量95,0%以上， 3.10咖啡因标准铺备液：根据海堆因标准品的含量用重莉三装甲烧配制成每毫开相当干0.5mR咖 碎因的溶液，置于冰箱中保存， 4使器 紫外分光光度计， 5分析步 5,1试样的处豆 5.1.1可乐型仗料：在250mL的分被漏4中，准确移人10.0mL一20.0mL经相声酸气后的均匀可 乐型伏料试样，加人5ml15g/L高锰酸钾溶液，福匀，静置5m临，加人程合得液10ml,韬匀，加人 50mL.重熏三复甲烧。振摇10的次，静止分层，收乘三氧甲烷.水层再加人40mL.重蒸三氯甲统，振摇 199
GB/T 5009.139-2003 饮料中咖啡因的测定 飞 范围 本标准规定了可乐型饮料、咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量的测定方法一紫外分光光度法和高 效液相色谱法(HPLC), 本标准适用于可乐型饮料、咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因的测定。 本标准紫外法检出限:可乐型饮料为3 mg/L;咖啡、茶叶及其固体制品为5 mg/100 g;对咖啡和茶 叶的液体制品为5 mg/L, 本标准 HPLC法检出限:可乐型饮料为。.72 mg/L;茶叶、咖啡及其制品为 1. 8 mg/ 100 g, 第一法 紫外分光光谱法 原理 咖啡因的三氯甲烷溶液在 276. 5 nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从 而可进行定量。 试荆 3.1 无水硫酸钠。 3.2 三抓甲烷 使用前重新蒸馏。 3. 3 15 g/L高锰酸钾溶液:称取 1. 5 g高锰酸钾，用水溶解并稀释至 100 mL. 3.4 亚硫酸钠和硫氰酸钾混合溶液:称取 10 g无水亚硫酸钠(Nat so,)，用水溶解并稀释至 100 mL. 另取 10 g硫氛酸钾，用水溶解并稀释至 100 mL,然后二者均匀混合。 3.5 15%磷酸溶液:吸取15 mL磷酸置于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。 3.6 200 g/L氢氧化钠溶液:称取 20 g氢氧化钠，用水溶解，冷却后稀释至 100 mL. 3.7 200 g/L醋酸锌溶液:称取20 g醋酸锌[Zn(CH,COO)2 . 2H20〕加人3 mL冰乙酸，加水溶解并 稀释至100 mL. 3.8 100 g/L亚铁氛化钾溶液:称取10 g亚铁佩化钾[K, Fe (CN)s·3H,O〕用水溶解并稀释至 100 mL. 3.9 咖啡因标准品:含量98.0%以上。 3.10 咖啡因标准储备液:根据咖啡因标准品的含量用重蒸三氯甲烷配制成每毫升相当于。5 mg咖 啡因的溶液，置于冰箱中保存。 仪器 紫外分光光度计。 5 分析步骤 5.1 试样的处理 5.1.1 可乐型饮料:在250 mL的分液漏斗中，准确移人 10. 0 mL^-20.0 mL经超声脱气后的均匀可 乐型饮料试样，加人 5 mL 15 g/L高锰酸钾溶液，摇匀，静置 5 min，加入混合溶液 10 mL，摇匀，加人 50 ml.重蒸三氯甲烷。振摇 100次，静止分层，收集三氯甲烷。水层再加人 40 ml重蒸三氯甲烷，振摇 I99
GB/T5009.139-2003 100次，静置分层。合并二次三氯甲烷苹家液，并用重燕三氯甲烧定容至100mL,解匀，备用， 5.1.2有暗，茶时及其西体试样，在100mL烧杯中称取经称痒戒低于30目的均匀试样0.5g一2.0g 相人80ml沸水，加三，摇匀，浸卷2h,然后将浸出森余部移入100ml容量瓶中，相人2mL00e/儿 附酸锌溶液，加人2ml103g/1亚铁氟化钾溶液，解匀，用水定客至100mL,解匀，静置沉症，拉速，和 过液5,0m1~20,0mL.按5.1,1绳作选行，制备成100mL三氯甲烷席液，备用， 5.1.3麻律域茶并的藏体试样：在10的mL容量瓶中独确移人10.0mL20,0ml均匀试样，加人 2mL.200g/L醋黎柿溶液，翘匀，加人2m1100g/L亚铁氟化柳溶液，摇匀，用水定容至100mL,摇 匀，静紧悦定，过速。农这液5,0mL一20.0mL获5.上.1操作走行，制备成100mL三氧甲烷溶液， 备用。 5.2标准曲线的喻到 从0.5mg/mL的由啡因标准储备液中，用重装三氧甲税配削成装度分别为0,5,10,15,20g/回L 的标在系列，以0g/mL作参比管，满节军点，用1cm比色杯于276.5nm下测量限光发，作爱光度蜘 非因浓度的标准白线线求出直线回口方程， 5.3西定 在25mL具寒试昏中，知人5g无水硫酸钠，倒人20mL试样的三怎甲烷制备液，将匀，静置。将 泡清的三氯甲烧用1cm比色杯于276.5nm制出其预光度，根据标准曲线（直线同力方程》求出样品的 吸光度相当干如啤因的浓皮（知/mL),同时用重藕三氯甲统作比刻空白。 6结果计算 发下列公式计算： X=-X10×}98器 +时t4+44+44+(】) X--6)×100×100×100 VXm×1000 X,-c=6)x100X100X1000 444444t4na4a口4t44(3】 V,×VX1000 式中， X,一可乐型饮料中寒降因含量，单位为素克每升（回g/1》: X,—咖甲，茶叶及其图体试样中靠华因含景，单位为毫克/每百充(g/门0》： X,如啡、茶时及其流体利或品中电味因含量，单位为毫克相升(mg/儿， —一试样吸光度相当于物啡因浓度，单位为爱克每毫升(g/mL): 一试剂空白吸光度相当于实降因浓度，单位为徽克餐意升《g/mL): m一称数试样的质量，单位为克(g): V-一一移斯试样的体积，单位为毫升(mL)1 V一移数试样处理后水溶液的体积，单位为毫升(mL): 7精密度 可乐做休料：在重复生条件下失得的两次独文测定结果的地对差值不得姬过第术平均值的5⅓：咖 甲，茶叶及其制品：在重复性条作下获得的阿次雅立测定给果的她对差值不得超过算术平均航的15%。 200
GB/T 5009.139- 2003 10。次，静置分层。合并二次三氯甲烷萃取液，并用重蒸三氯甲烷定容至100 mL，摇匀，备用。 5.1.2 咖啡、茶叶及其固体试样:在100 ml烧杯中称取经粉碎成低于30目的均匀试样。.5 g-2.0 g, 加人 80 mL沸水，加盖，摇匀，浸泡2h，然后将浸出液全部移人 100 mL容量瓶中，加人2 mL 200 g/L 醋酸锌溶液，加人2 mL 100 g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，用水定容至 100 MI，摇匀，静置沉淀，过滤。取 滤液 5. 0 mL-20. 0 mL按 5.1.1操作进行，制备成100 mL三氯甲烷溶液，备用。 5.1.3 咖啡或茶叶的液体试样:在 100 mL容量瓶中准确移人 10. 0 mL-20. 0 mL均匀试样，加人 2 ml, 200 g/L醋酸锌溶液，摇匀，加人 2 mL 100 g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，用水定容至 100 mL,摇 匀，静置沉淀，过滤。取滤液 5. 0 mL^-20. 0 mL按 5. 1.1操作进行，制备成 100 mL三氯甲烷溶液， 备用。 5.2 标准曲线的绘制 从。. 5mg/ml一的咖啡因标准储备液中，用重蒸三氯甲烷配制成浓度分别为0,5,10,15,20 pg/mL 的标准系列，以。pg/mL作参比管，调节零点，用 1 cm 比色杯于 276. 5 nm下测量吸光度，作吸光度一咖 啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。 5.3 测定 在25 mL具塞试管中，加人5g无水硫酸钠，倒人20 mL试样的三氯甲烷制备液，摇匀，静置。将 澄清的三氯甲烷用 1 cm 比色杯于 276.5 nm测出其吸光度，根据标准曲线(直线回归方程)求出样品的 吸光度相当于咖啡因的浓度 。(pg/mL)。同时用重蒸三氯甲烷作试剂空白。 结果计算 按下列公式计算: (c一‘。)X 100 V 1 00旦 1 000 (1 ) (c一 c) X 100 X100 X100 V,只m X 1 000 (2 ) (c一 c) X 100 X100 X1000 V, X V X 1 000 .............................. ( 3 ) 式中 : X, - XzX — 可乐型饮料中咖啡因含量，单位为毫克每升(mg/L) ; 咖啡、茶叶及其固体试样中咖啡因含量，单位为毫克/每百克(mg/100 g); 咖啡、茶叶及其液体制成品中咖啡因含量，单位为毫克每升(mg/L) ; 。— 试样吸光度相当于咖啡因浓度，单位为微克每毫升(pg/mL) ; c}— 试剂空白吸光度相当于咖啡因浓度，单位为微克每毫升(pg/mL) ; m— 称取试样的质量，单位为克(9); V一 一移取试样的体积，单位为毫升(mL) ; V,— 移取试样处理后水溶液 的体积 ，单位为毫升(mL) ; 精密度 可乐型饮料:在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 5%;咖 啡、茶叶及其制品:在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%0
GB/T5009.139-2003 第二法高效液相色谱法(HPLC) 8原理 如啡因的甲醇液在86m被长下有量大吸收，其吸收值的大小与布啡因浓发成正比，从面可法行 定量， 9试瓶 9.1甲醇HPLC试剂. 9.2乙端HPLC试剂. 9.3三氯甲烧：分桥纯，本要时需重薰。 3,4超纯水：182M0. 9.5无水流酸钠：分析纯， 9.6氯化钠：分析纯， 9.7如时出标准品：饰度98%以上 10仅特和设备 10.1液相色游. 10.2色进柱Bondapak Ca(30cmX3.9mmd. 10.3预桂R3 AVE Cu, 10.4题声清洗#(CQ250), 10,5混特徽孔就璃， 11分桥步骤 11.1试样处理 11.1.1可乐袋饮料 11.1.1.1酸气：试样用短声清法器在40℃下超声5n。 111,1.2过该：发酸气试样10,0ml.通过混纤债孔德膜过，弃去最初的5mL,保面后5mL奢用。 11.1,2咖啡，茶叶及其前成品：称取2g已经粉碎且小于动目的均匀试样或液体试样被人150mL绕 杯中，先加2ml,一3mL.超纯水，再加50mL三氧甲糖，都匀，在超声处理机上萃取1mn(30￥二次)， 静置30mn,分层。将取液倾人另一150ml烧杯。在试样中再加50mL三氢甲烷，重复上述林取操 作步骤，年去试样，合并二次荐家液，加人少无水硫酸钠和5ml嘘和复化的，过这，辣入100mL客量直 中，用三氧甲烷定容至100mL,最后收10mL此液按11,1.1,2操作过行， 11.2色谱条件 11,2.1汽动相.甲醇+乙物十水=57+29+14（每升流动相中加人0,8ma/L乙酸液50mL)。 11.2.2汽动相的篇速：1.5mL/mn。 11.2.3送杆量，可乐型饮料10L,茶时衡附及其制境品5L一201. 11.3标有因线的按制 用甲醇配利或血附因浓度分划为0,20、50,100,150严/mL的标准系列，然后分别进样10L于人 286m燕量峰医积，作蜂西积血华因依度的标在曲线或求出点线可归方程。 11.4测定 从试粹中吸收可乐比料10μL,减布母，茶叶及其制品10L法样，于2肠m处测其蜂面积，然后限 据标雅由线（或直线同阳方程）得出试样的蜂而积相当于寒恃因的旅度c《g/L》,可时作试剂空白。 201
GB/T 5009.139-2003 第二法 高效液相色谱法(HPLC) 原理 咖啡因的甲醇液在286 nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从而可进行 定量。 9 试剂 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 甲醇 HPLC试剂。 乙睛 HPLC试剂。 三氯甲烷:分析纯，必要时需重蒸。 超纯水:18. 2 Mfl. 无水硫酸钠:分析纯。 氯化钠 :分析纯。 咖啡因标准品:纯度 98%以上。 10 仪器和设备 10.1 液相色谱。 10.2 色谱柱 Bondapak C18(30 cm X3.9 mm id), 10.3 预柱 RESAVE C18, 10.4 超声清洗器(CQ250), 10.5 混纤微孔滤膜。 11 分析步骤 11.1 试样处理 11.1.1 可乐型饮料 11.1.1.1 脱气:试样用超声清洗器在 40℃下超声 5 min, 11.1.1.2 过滤:取脱气试样 10. 0 mL通过混纤微孔滤膜过滤，弃去最初的 5 mL，保留后 5 mL备用。 11.1.2 咖啡、茶叶及其制成品:称取 2g已经粉碎且小于30目的均匀试样或液体试样放人150 mL烧 杯中，先加 2 mL-3 mL超纯水，再加 50 mL三抓甲烷，摇匀，在超声处理机上萃取 1 min(30 s二次)， 静置 30 min，分层。将萃取液倾人另一 150 mL烧杯。在试样中再加 50 mL三氯甲烷，重复上述萃取操 作步骤，弃去试样，合并二次萃取液，加人少无水硫酸钠和5 mL饱和抓化钠，过滤，滤人 100 mL容量瓶 中，用三氯甲烷定容至100 mL。最后取 10 mL滤液按 11.1.1.2操作进行。 11.2 色谱条件 11.2. 1 流动相:甲醇+乙睛+水=57+29十14(每升流动相中加人 0. 8 mol/L乙酸液50 mL), 11.2.2 流动相的流速:1. 5 mL/min, 11.2.3 进样量，可乐型饮料 10 fiL，茶叶咖啡及其制成品5 KL-20 pL, 11.3 标 准曲线 的绘 制 用甲醇配制成咖啡因浓度分别为 。,20,50,100,150 pg/mL的标准系列，然后分别进样 10 t}L于人 286 nm测量峰面积，作峰面积一咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。 11.4 测定 从试样中吸取可乐饮料10 pL或咖啡、茶叶及其制品10 pL进样，于286 nm处测其峰面积，然后根 据标准曲线(或直线回归方程)得出试样的峰面积相当于咖啡因的浓度 。(kg/mL)。同时作试剂空白
GB/T509.139-203 12结果计 式中 13精密度
Gs/T 5009.139-2003 12 结果计算 可乐型饮料中咖啡因含量(mg/ L)=c 咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量(mg/100 g)=cxvx100/(MX1 000) 式 中: ‘— 由标准曲线求得试样稀释液中咖啡因的浓度，单位为微克每毫升(pg/mL) ; V— 试样定容体积，单位为毫升(mL); m— 试样质量，单位为克(g). 13 精密度 可乐型饮料:在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%;咖 啡、茶叶及其制品:在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%