第二十二拿 常用分子生物学技术的 原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application
第二十二章 常用分子生物学技术的 原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application
第一节 分子杂交与印迹效木术 Molecular Hybridization Blotting Technolo
第 一 节 分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization & Blotting Technology
一、分子杂交与印迹放术的原理 核酸分子杂交(nucleic acid hy6 ridization 在①WA复性过程中，如果把不同①A单链 分子放在同一溶液中，或把①A与RA放在一 起，只要在①A或RA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成染化双链(heteroduplex
核酸分子杂交(nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链 分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理
复性 一 RNA DNA
复性 RNA DNA
(一)印渍技术 Blotting 首先由Edwen Southern在1975年提出。 ■( B0 tting即“印凌”， 指将存在于疑胶中的生物 大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检 测分析的技术，目前广泛应用于①A、RWA、 和蛋白质的检测
（一）印渍技术 Blotting ▪ 首先由Edwen Southern在1975年提出。 ▪ Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物 大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检 测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、 和蛋白质的检测
探升技术 probe ■ 将一小段已和序列的核酸片段用放射性 同酝素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然 后用于分子杂交，杂交后通过放射自显 形、荧光检测或显色技术，使杂交区带 显现出来
探针技术 probe ▪ 将一小段已知序列的核酸片段用放射性 同位素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然 后用于分子杂交，杂交后通过放射自显 影、荧光检测或显色技术，使杂交区带 显现出来
二、印渍艾术的类别及应用 ①WA印迹技术 Southern blotting RMA印迹技术 Northern blotting 蛋白质印迹技术 Western blotting ■ 斑京印迹 Dot blotting 原位杂交 in situ hybridization ①WA点阵 ①VA array ■ ①WA花片技术 DNA chip
二、印渍技术的类别及应用 ▪ DNA印迹技术 Southern blotting ▪ RNA印迹技术 Northern blotting ▪ 蛋白质印迹技术 Western blotting ▪ 斑点印迹 Dot blotting ▪ 原位杂交 in situ hybridization ▪ DNA点阵 DNA array ▪ DNA芯片技术 DNA chip
(一)①A印迹技术 Southern blotting 又称为Southern杂交，即①月-①A朵交 分析。是研究①A图谱的基本技术，主 要用于基因组①A的分析，如在基因组 中特异基因的定阮及检侧等，亦可用于 分析重组质粒和噬菌体。在遗传珍断 ①WA图婚分析及PCR产物分析等方面有 重要价值
（一）DNA印迹技术 Southern blotting ▪ 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交 分析。是研究DNA图谱的基本技术，主 要用于基因组DNA的分析，如在基因组 中特异基因的定位及检测等，亦可用于 分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断 DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有 重要价值
基本方法 将①WA标本用返制性内切薄消化后，经凉首艚疑 胶电泳分离各酶解片段； 经碱变性，Ts缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用 将①A从疑胶中转印至硝酸纤维素旎膜上，烘干 固定，疑胶中①A片段的相对位置在①A片段转 彩到滤膜的过程中继续保特着。 附着在滤膜上的①WA与32标记的深针杂交，利用 放射自显形术确定探针豆补的每条①A带的位置 确定在众多酶解产物中会某一特定序的①片 段的位置和大小
基本方法 ▪ 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝 胶电泳分离各酶解片段； ▪ 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用 将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干 固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转 移到滤膜的过程中继续保持着。 ▪ 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用 放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置， 确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片 段的位置和大小
Southern Blotting 无水乙醇 酚/氯仿 蛋白酶K SDS 离心 tissue 6趴 DNA Cleave with restriction enzymes Nitrocellulose Autoradiography Paper Towels Hybridize with Filter labeled DNA or Nitrocellulose RNA probe:perform paper esis Gel autoradiography Alkaline solution Capillary action transfers DNA from gel to nitrocellulose
Paper Towels Southern Blotting tissue 酚/氯仿 蛋白酶K SDS 无水乙醇 离心