第六章食品中污染物、有害残留物含量的检测 实验一 食用油中黄曲霉毒素B的测定 一、目的要求 学习薄层层析法分离检测食用油黄曲霉毒素的实验方法，了解做好本实验的操作要点。 二、实验原理 样品中黄曲霉毒素B,经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365mm紫外光下产生蓝紫色 荧光，根据其在薄层上显示的荧光的最低检出量来测定含量。 三、仪器和试剂 (一)试剂 1、三氯甲烷。 2、甲醇。 3、苯。 4、乙腈。 5、硅胶G:海层色谱用 6、无水硫酸钠。 7、苯乙腈混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混匀。 8、甲醇水溶液：55mL甲醇，加45mL水，混匀. 9、黄曲霉毒素B,标准溶液。 ()仪器校正：测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素。准 确称取25mg经干燥的重铬酸钾（基准级），用硫酸(0.5+1000)溶解后并准确稀释至200mL, 相当于[c(KzCr00.0004mol/L]。再吸取25mL此稀释液于50mL容最瓶中，加硫酸 (0.5+1000)稀释至刻度，相当于0.0002molL溶液。再吸取25mL此稀释液于50mL溶量 瓶中，加硫酸(0.5+1000)稀释至刻度，相当于0.0001molL溶液。用1cm石英杯在最大吸收 峰的波长（接近350m处）用硫酸(0.5+1000)作空白，测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸
第六章 食品中污染物、有害残留物含量的检测 实验一 食用油中黄曲霉毒素 B1的测定 一、目的要求 学习薄层层析法分离检测食用油黄曲霉毒素的实验方法，了解做好本实验的操作要点。 二、实验原理 样品中黄曲霉毒素 B1 经提取、浓缩、薄层分离后，在波长 365mm 紫外光下产生蓝紫色 荧光，根据其在薄层上显示的荧光的最低检出量来测定含量。 三、仪器和试剂 （一）试剂 1、三氯甲烷。 2、甲醇。 3、苯。 4、乙腈。 5、硅胶 G：薄层色谱用。 6、无水硫酸钠。 7、苯乙腈混合液：量取 98mL 苯，加 2mL 乙腈，混匀。 8、甲醇水溶液：55mL 甲醇，加 45mL 水，混匀。 9、黄曲霉毒素 B1 标准溶液。 （1）仪器校正：测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素。准 确称取 25mg 经干燥的重铬酸钾（基准级），用硫酸（0.5+1000）溶解后并准确稀释至 200mL， 相当于[c(K2Cr2O7)=0.0004mol/L]。再吸取 25mL 此稀释液于 50mL 容量瓶中，加硫酸 （0.5+1000）稀释至刻度，相当于 0.0002mol/L 溶液。再吸取 25mL 此稀释液于 50mL 溶量 瓶中，加硫酸(0.5+1000)稀释至刻度，相当于 0.0001mol/L 溶液。用 1cm 石英杯在最大吸收 峰的波长(接近 350nm 处)用硫酸(0.5+1000)作空白，测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸
光度，并按式)计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。 式中E,一重铬酸钾溶液的摩尔消光系数： A—测得重铬酸钾溶液的吸光度； c一重铬酸钾溶液的摩尔浓度。 再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值3160比较，即求出使用仪器的校正因素， 按式(2)进行计算。 /=3160 E 式中 ∫一使用仪器的校正因素 E—测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。 若∫大于0.95或小于1.05，则所用仪器校正因素可略去不计。 (2)黄曲霉毒素B1标淮溶液的制备：准确称取1L.2mg黄曲霉毒素B1标淮品，先加 入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL,避光，置于4℃冰箱保存。该标准液约为10μgmL。 用紫外分光光度计测标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值。 结果计算：黄曲霉毒素B,标准溶液的浓度计算按下式： X=4xMx1000×5 上3 式中X一黄曲霉毒素B1标准溶液的的浓度(gmL): A—测定的吸光值； ∫—所使用仪器的校正因素： M一黄曲霉毒素B1的分子量312： E2一黄曲毒素B,在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系数19800， 根据计算，用苯一乙腈混合液调到标准溶液浓度恰为10.0μgmL,并用分光光度计核 对其浓度
光度，并按式(1)计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。 c A E1 = - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (1) 式中 E1——重铬酸钾溶液的摩尔消光系数； A——测得重铬酸钾溶液的吸光度； c——重铬酸钾溶液的摩尔浓度。 再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值 3160 比较，即求出使用仪器的校正因素， 按式（2）进行计算。 E f 3160 = - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (2) 式中 f ——使用仪器的校正因素； E——测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。 若 f 大于 0.95 或小于 1.05，则所用仪器校正因素可略去不计。 （2）黄曲霉毒素 B1 标准溶液的制备：准确称取 1~1.2 mg 黄曲霉毒素 B1 标准品，先加 入 2mL 乙腈溶解后，再用苯稀释至 100mL，避光,置于 4℃冰箱保存。该标准液约为 10μg/mL。 用紫外分光光度计测标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值。 结果计算：黄曲霉毒素 B1 标准溶液的浓度计算按下式： 2 1000 E A M f X × × × = 式中 X——黄曲霉毒素 B1 标准溶液的的浓度（µg/mL）； A——测定的吸光值； f ——所使用仪器的校正因素； M——黄曲霉毒素 B1 的分子量 312； E2——黄曲霉毒素 B1 在苯–乙腈混合液中的摩尔消光系数 19800。 根据计算，用苯―乙腈混合液调到标准溶液浓度恰为 10.0μg/mL，并用分光光度计核 对其浓度
(3)黄曲霉毒素样纯度测定：取10μL/mL黄曲霉毒素标准溶液5μL,滴加于涂层厚 度0.25mm的硅胶G薄层板上，用甲醇-三氯甲烷(4+96)与丙桐-三氯甲烷(8+92)展开 剂展开，在紫外光灯下观察光的产生，应符合以下条件 在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质的荧光点：原点上没有任何残留的荧光物质。 10、黄曲霉毒素B,标准使用液。 准确吸取1mL标准溶液(10μgmL)于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混 匀。此溶液每毫升相当于1.0μg黄曲霉毒素B1。吸取1.0mL此稀释液，置于5mL容量瓶中， 加苯-乙腈混合液至刻度，此溶液每毫升相当于0,2μg黄曲霉毒素B1。再吸取黄曲霉毒素 B,标准溶液(0.2μgmL)1.0mL置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度。此溶 液每毫升相当于0.04μg黄曲霉毒素B1。 (二)仪器 1、全玻璃浓缩器。 2、玻璃板：5cm×20cm。 3、展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm。 4、紫外光灯：100W~125W,带有波长365nm滤光片。 5、微量注射器或血色素吸管 四、实验步骤 1、样品处理：称取油样4.00g置于小烧杯，用20mL正乙烷或石油醚将试样移于125ml 分液漏斗中。用20mL甲醇水溶液分次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，振摇2min,静置分 层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5mL甲醇水溶液重复振摇提取一次， 提取液并入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏中加入20mL三氯甲烷，振摇2min,静置 分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲 烷湿润的无水硫酸钠的定最慢速滤纸过滤于50mL燕发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏 斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗
（3）黄曲霉毒素样纯度测定：取 10μL/mL 黄曲霉毒素标准溶液 5μL，滴加于涂层厚 度 0.25mm 的硅胶 G 薄层板上，用甲醇–三氯甲烷（4+96）与丙酮–三氯甲烷（8+92）展开 剂展开，在紫外光灯下观察光的产生，应符合以下条件： 在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质的荧光点；原点上没有任何残留的荧光物质。 10、黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 准确吸取 1mL 标准溶液（10μg/mL）于 10mL 容量瓶中，加苯–乙腈混合液至刻度，混 匀。此溶液每毫升相当于 1.0μg 黄曲霉毒素 B1。吸取 1.0mL 此稀释液，置于 5mL 容量瓶中， 加苯–乙腈混合液至刻度，此溶液每毫升相当于 0.2μg 黄曲霉毒素 B1。再吸取黄曲霉毒素 B1 标准溶液（0.2μg/mL）1.0mL 置于 5mL 容量瓶中，加苯–乙腈混合液稀释至刻度。此溶 液每毫升相当于 0.04μg 黄曲霉毒素 B1。 （二）仪器 1、 全玻璃浓缩器。 2、 玻璃板：5cm×20cm。 3、 展开槽：内长 25cm、宽 6cm、高 4cm。 4、 紫外光灯：100W~125W，带有波长 365nm 滤光片。 5、 微量注射器或血色素吸管。 四、实验步骤 1、样品处理：称取油样 4.00g 置于小烧杯， 用 20mL 正乙烷或石油醚将试样移于 125mL 分液漏斗中。用 20m L 甲醇水溶液分次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，振摇 2min，静置分 层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用 5m L 甲醇水溶液重复振摇提取一次， 提取液并入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏中加入 20m L 三氯甲烷，振摇 2min，静置 分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约 10g 预先用三氯甲 烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于 50m L 蒸发皿中，再加 5m L 三氯甲烷于分液漏 斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗
液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜于65℃水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却 2mim~3min后，准确加入1mL苯-乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后， 准确加入1mL苯-乙腈混合液)。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结品 析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，品体即消失，再用此滴管吸取上清液转移 于2mL具塞试管中。 2、单向展开法测定 (1)薄层板的制备：称取3g硅胶G,加相当于硅胶量2倍3倍左右的水，用力研磨 1min-2min至成糊状后立即倒入5cm×20cm玻璃板上，均匀铺占整块玻璃板。在空气中干 燥15min后，在100℃活化2h,取出，放于干燥器保存。一般可保存2~3天，若放置时间 较长，可再活化后使用。 (2)点样：将薄层板边缘附若的吸附剂刮净，在距薄层板下端3Cm的基线上，用微量 注射器均匀点4个样点，样点距边缘和点间距约为1cm,点直径约3mm。在同一块板上滴 加点的大小应一致，点样时可借助吹风机用冷风边吹边点。 各样点的样液成分如下： 第一点：10m黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04gmL)。 第二点：20叫待测样液。 第三点：20L待测样液+10L0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液 第四点：20L待测样液+104L0.2gmL黄曲霉青素B1标准使用液。 (3)展开：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm,取出挥干。再于另一展开槽内 10mL丙相-三氯甲烷(8+92)，展开10cm-12cm取出. (4)结果观察： 在365m紫外灯下观察样点结果。由于待测样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准使用液， 可使黄曲霉毒素B,的标准点与样液中的黄曲霉毒素B,荧光点重叠。如待测样液为阴性，薄 层板上的第三点中黄曲霉毒素B,多0.0004g,可用作检查在样液内黄曲霉毒素B,最低检出
液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜于 65℃水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却 2min~3min 后，准确加入 1m L 苯–乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后， 准确加入 1m L 苯–乙腈混合液）。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶 析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移 于 2mL 具塞试管中。 2、单向展开法测定 （1）薄层板的制备：称取 3g 硅胶 G，加相当于硅胶量 2 倍~3 倍左右的水，用力研磨 1min~2min 至成糊状后立即倒入 5cm×20cm 玻璃板上，均匀铺占整块玻璃板。在空气中干 燥 15min 后，在 100℃活化 2h，取出，放于干燥器保存。一般可保存 2~3 天，若放置时间 较长，可再活化后使用。 （2）点样：将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm 的基线上，用微量 注射器均匀点 4 个样点，样点距边缘和点间距约为 1cm，点直径约 3mm。在同一块板上滴 加点的大小应一致，点样时可借助吹风机用冷风边吹边点。 各样点的样液成分如下： 第一点：10µL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液（0.04µg/mL）。 第二点：20µL 待测样液。 第三点：20µL 待测样液+10µL 0.04µg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 第四点：20µL 待测样液+10µL 0.2µg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 （3）展开：在展开槽内加 10mL 无水乙醚，预展 12cm，取出挥干。再于另一展开槽内 10mL 丙酮–三氯甲烷（8+92），展开 10cm~12cm 取出。 （4）结果观察： 在 365nm 紫外灯下观察样点结果。由于待测样液点上加滴黄曲霉毒素 B1标准使用液， 可使黄曲霉毒素 B1 的标准点与样液中的黄曲霉毒素 B1 荧光点重叠。如待测样液为阴性，薄 层板上的第三点中黄曲霉毒素 B1 多 0.0004µg，可用作检查在样液内黄曲霉毒素 B1 最低检出
量是否正常出现：如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1为0.002g 主要起定位作用， (5)确正实验：若第二点在与黄曲霉青素B标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表 示试样中黄曲霉毒素B,含量在5gkg以下：如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确 证试验。具体操作如下： 为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B,产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉 毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点。 第一点：0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液10-叫L。 第二点：204样液。 于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min后， 使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃，再于薄层板上滴加以下两点。 第三点：0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液10mL。 第四点：20L样液。 再按上法展开后，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B标准点相同的衍 生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。 (6)稀释定量：样液中的黄曲霉毒素B荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B标准点 的最低检出量(0.0004g)的荧光强度一致，则试样中黄曲霉毒素B1含量即为5gkg。如样 液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不 同微升数，直到样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：10mL黄曲需毒素B1标准使用液(0.04gmL)。 第二点：根据情况滴加10L样液。 第三点：根据情况滴加15L样液。 第四点：根据情况滴加20μL样液。 五、结果计算：
量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素 B1 为 0.002µg， 主要起定位作用。 （5）确正实验：若第二点在与黄曲霉毒素 B1 标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表 示试样中黄曲霉毒素 B1含量在 5µg/kg 以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确 证试验。具体操作如下： 为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素 B1产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉 毒素 B1 的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在 0.1 左右。于薄层板左边依次滴加两个点。 第一点：0.04µg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液 10µL。 第二点：20µL 样液。 于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应 5min 后，用吹风机吹热风 2min 后， 使热风吹到薄层板上的温度不高于 40℃，再于薄层板上滴加以下两点。 第三点：0.04µg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液 10µL。 第四点：20µL 样液。 再按上法展开后，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素 B1 标准点相同的衍 生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。 （6）稀释定量：样液中的黄曲霉毒素 B1 荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素 B1 标准点 的最低检出量（0.0004µg）的荧光强度一致,则试样中黄曲霉毒素 B1 含量即为 5µg/kg。如样 液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不 同微升数，直到样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：10µL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液（0.04µg/mL）。 第二点：根据情况滴加 10µL 样液。 第三点：根据情况滴加 1５µL 样液。 第四点：根据情况滴加 20µL 样液。 五、结果计算：
X=0.0004x5xD1000 V 式中 X一试样中黄曲霉毒素B1的含量(gkg: V一加入苯-乙腈混合液的体积(mL): V一出现最低荧光时滴加样液的体积(mL): D—样液的总稀释倍数： m一加入苯-乙腈混合液溶解时相当试样的质量(g): 0.0004一黄曲霉毒素B1的最低检出量(g)。 结果表示到测定值的整数位。 六、注意事项及说明 1、实验后污染的玻璃仪器可用10gL次氯酸钠溶液浸泡半天或用50gL次氯酸钠溶液 浸泡片刻后，即可达到去毒效果.消毒用次氯酸钠溶液的配制如下：取100g漂白粉，加500mL 水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(NaCO3.10HO)溶于500mL温水中，再将两液混 合，搅拌，澄清后过滤。此溶液含次氯酸钠浓度约为25gL。若用漂粉精制备，则碳酸钠的 量可以加倍，所得溶液的浓度约为50gL. 2、黄曲霉毒素B标准液的保存方法：将标准液保存于具塞试管中，将塞密闭并封严 避光，贮于4℃冰箱。用后在标准液的液面处作记号，用前检查标准液在贮存期的体积有否 改变，若有明显的减少，则应准确补充溶剂到记号处后再用。必要时重做其浓度及纯度测定。 3、如用单向展开法展开后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素B,的荧光强度 需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚作横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边而黄 曲霉毒素B1不动，然后再用丙酮-三氯甲烷(8+92)作纵向展开，试样在黄曲霉毒素B1相 应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法灵敏度。如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂 质干扰时，则可改用滴加一点法。检测方法可参照GB/T500922一2003标准方法进行。 七、思考题
X = V m V D 1000 0.0004 2 1 × × × 式中 X——试样中黄曲霉毒素Ｂ1 的含量（µg/kg）； V1——加入苯–乙腈混合液的体积（mL）； V2——出现最低荧光时滴加样液的体积（mL）； Ｄ——样液的总稀释倍数； m——加入苯–乙腈混合液溶解时相当试样的质量(g)； ０.0004——黄曲霉毒素 B1 的最低检出量（µg）。 结果表示到测定值的整数位。 六、注意事项及说明 1、实验后污染的玻璃仪器可用 10g/L 次氯酸钠溶液浸泡半天或用 50g/L 次氯酸钠溶液 浸泡片刻后，即可达到去毒效果。消毒用次氯酸钠溶液的配制如下：取 100g 漂白粉，加 500mL 水，搅拌均匀。另将 80g 工业用碳酸钠（Na2CO3.10H2O）溶于 500mL 温水中，再将两液混 合，搅拌，澄清后过滤。此溶液含次氯酸钠浓度约为 25g/L。若用漂粉精制备，则碳酸钠的 量可以加倍，所得溶液的浓度约为 50g/L。 2、黄曲霉毒素 B1 标准液的保存方法：将标准液保存于具塞试管中，将塞密闭并封严， 避光，贮于 4℃冰箱。用后在标准液的液面处作记号，用前检查标准液在贮存期的体积有否 改变，若有明显的减少，则应准确补充溶剂到记号处后再用。必要时重做其浓度及纯度测定。 3、如用单向展开法展开后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素 B1 的荧光强度， 需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚作横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边而黄 曲霉毒素 B1不动，然后再用丙酮–三氯甲烷（8+92）作纵向展开，试样在黄曲霉毒素 B1 相 应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法灵敏度。如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂 质干扰时，则可改用滴加一点法。检测方法可参照 GB/T5009·22—2003 标准方法进行。 七、思考题
1、薄层层析点样操作时，为何要控制点样的直径大小？ 2、单向展开法测定中“稀释定量”操作步骤的目的是什么？ 3、要使测定结果比较准确，操作中应注意哪些问题？ 实验二肉制品中苯并(a)花的测定方法 方法一荧光分光测定法 一、目的要求 学习分析检测苯并(a)花的原理和方法。 二、实验原理 苯并(a)花是多环芳烃类化合物中一种主要的食品污染物。 粮食谷物在烟道中直接烘干或熏制鱼、肉等制品，特别是熏烤时食品直接和炭火接触 即可受到苯并(a)花的污染或产生苯并(a)花。 检测时试样先用有机溶剂提取，或经皂化后提取，再将提取液经液-液分配或色谱柱净 化，然后在乙酰化滤纸上分离苯并(a)芘，因苯并(a)芘在紫外光照射下呈蓝色荧光斑点， 将分离后有苯并()花的滤纸部分剪下，用溶剂浸出解吸后，用荧光分光光度计测定荧光 强度与标准比较定量。 三、试剂与仪器 (一)试剂 1、苯：重蒸馏。 2、环已烷（或石油酷，沸程30℃一60℃）重蒸馏或经氧化铝柱处理至无荧光。 3、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。 4、无水乙醇：重蒸馏 5、无水硫酸钠。 6、展开剂：95%乙醇-二氯甲烷(2：1)
1、薄层层析点样操作时，为何要控制点样的直径大小？ 2、单向展开法测定中“稀释定量”操作步骤的目的是什么？ 3、要使测定结果比较准确，操作中应注意哪些问题？ 实验二 肉制品中苯并（a）芘的测定方法 方法一 荧光分光测定法 一、目的要求 学习分析检测苯并（a）芘的原理和方法。 二、实验原理 苯并（a）芘是多环芳烃类化合物中一种主要的食品污染物。 粮食谷物在烟道中直接烘干或熏制鱼、肉等制品，特别是熏烤时食品直接和炭火接触， 即可受到苯并（a）芘的污染或产生苯并（a）芘。 检测时试样先用有机溶剂提取，或经皂化后提取，再将提取液经液–液分配或色谱柱净 化，然后在乙酰化滤纸上分离苯并（a）芘，因苯并（a）芘在紫外光照射下呈蓝色荧光斑点， 将分离后有苯并（a）芘的滤纸部分剪下，用溶剂浸出解吸后，用荧光分光光度计测定荧光 强度与标准比较定量。 三、试剂与仪器 （一）试剂 １、苯：重蒸馏。 ２、环已烷（或石油醚，沸程 30℃～60℃）重蒸馏或经氧化铝柱处理至无荧光。 ３、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。 ４、无水乙醇：重蒸馏。 ５、无水硫酸钠。 ６、展开剂：95％乙醇–二氯甲烷（２：1）
7、硅镁吸附剂：将60目~100目筛孔的硅镁吸附剂经水洗四次（每次用水量为吸 附剂质量的4倍)于垂融漏斗上抽滤干后，再以等量的甲醇洗（甲醇与吸附剂量克数相等）： 抽滤干后，吸附剂铺于干净瓷盘上，在130℃干燥5h后，装瓶贮存于干燥器内，临用前加 5%水减活，混匀并平衡4h以上，最好放置过夜。 8、层析用氧化铝（中性）：120℃活化4h. 9、乙酰化滤纸：将中速层析用滤纸裁成30cm×4cm的条状，逐条放入盛有乙酰 化混合液(180mL苯、130mL乙酸酐、01mL硫酸)的500mL烧杯中，使滤纸充分地接 触溶液，保持溶液温度在21℃以上，时时搅排，反应6，再放置过夜。取出滤纸条，在通 风橱内吹干，再放入无水乙醇中浸泡4h,取出后放在垫有滤纸的干净白瓷盘上，在室温内 风干压平各用，一次可处理滤纸15-18条。 10、苯并(a)花标准溶液：精密称取10.0mg苯并(a)花，用苯溶解后移入100mL 棕色容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于苯并()花100g。放置冰箱中保存。 11、苯并(a)花标准使用液：吸取1.00mL苯并(a)花标准溶液置于10mL容最瓶 中，用苯稀释至刻度，同法依次用苯稀释，最后配成每毫升相当于1.0及0.1g苯当()花两 种标准使用液，放置冰箱中保存。 (二)仪器 1、脂肪抽提器 2、层析柱：内径10mm,长350mm,上端有内径25mm,长80mm~100mm内径漏 斗，下端具有活塞。 3、层析缸 4、K-D全玻璃浓缩器。 5、紫外光灯：带有波长为365nm,或254nm的滤光片。 6、回流皂化装置：锥形瓶磨口处接冷凝管。 7、荧光分光光度计
７、硅镁吸附剂：将 60 目～100 目筛孔的硅镁吸附剂经水洗四次（每次用水量为吸 附剂质量的４倍）于垂融漏斗上抽滤干后，再以等量的甲醇洗（甲醇与吸附剂量克数相等）； 抽滤干后，吸附剂铺于干净瓷盘上，在 130℃干燥５h 后，装瓶贮存于干燥器内，临用前加 ５％水减活，混匀并平衡 4h 以上，最好放置过夜。 ８、层析用氧化铝（中性）：120℃活化４h。 ９、乙酰化滤纸：将中速层析用滤纸裁成 30cm×４cm 的条状，逐条放入盛有乙酰 化混合液（180mＬ苯、130mL 乙酸酐、０.1mL 硫酸）的 500mL 烧杯中，使滤纸充分地接 触溶液，保持溶液温度在 21℃以上，时时搅拌，反应 6h，再放置过夜。取出滤纸条，在通 风橱内吹干，再放入无水乙醇中浸泡 4h，取出后放在垫有滤纸的干净白瓷盘上，在室温内 风干压平备用，一次可处理滤纸 15~18 条。 10、苯并（a）芘标准溶液：精密称取 10.0mg 苯并（a）芘，用苯溶解后移入 100mL 棕色容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于苯并（a）芘 100µg。放置冰箱中保存。 11、苯并（a）芘标准使用液：吸取 1.00mL 苯并（a）芘标准溶液置于 10mL 容量瓶 中，用苯稀释至刻度，同法依次用苯稀释，最后配成每毫升相当于 1.0 及 0.1µg 苯当(a)芘两 种标准使用液，放置冰箱中保存。 （二）仪器 1、脂肪抽提器。 2、层析柱：内径 10mm，长 350mm，上端有内径 25mm ，长 80mm~100mm 内径漏 斗，下端具有活塞。 3、层析缸。 4、K-D 全玻璃浓缩器。 5、紫外光灯：带有波长为 365nm，或 254nm 的滤光片。 6、回流皂化装置：锥形瓶磨口处接冷凝管。 7、荧光分光光度计
四、实验步骤 1、样品制备：称取50.0g60.0g切碎混匀的熏肉，再用无水硫酸钠搅（样品与无水硫酸 纳的比例为1：1或1：2，然后装入滤纸筒内，接好脂肪提取器，加入100mL环已烷于90 ℃水浴上回流提取6h一8h,然后将提取液倒入250mL分液漏斗中，再用6m1一8mL环乙烷淋 洗滤纸筒，洗液合并于250L分液漏斗中，以环己烷饱和过的二甲基甲酰胺提取三次，每次 40mL,振摇1min,合并二甲基甲酰胺提取液，用40mL经二甲基甲酰胺饱和过的环已烷提取 一次，弃去环已烷液层。二甲基甲酰胺提取液合并于预选装有240mL硫酸钠溶液(20g/儿L) 的500mL分液漏斗中，混匀，静置数分钟后，用环己烷提取两次，每次100mL,振摇3min, 环已烷提取液合并于第一个500mlL分液漏斗。 2、样品提取液的净化处理： (1)于层析柱下端填入少许玻璃棉，先装入5Cm-6cm的氧化铝，轻轻敲管壁使氧化铝 层填实、无空隙，顶面平齐，再同样装入5cm~6cm的硅镁型吸附剂，上面再装入5cm~6cm 无水硫酸钠，用30L环已烷淋洗装好的层析柱，待环已烷液面流下至无水硫酸钠层时关闭 活塞。 (2)将试样环已烷提取液倒入层析柱中，打开活塞，调节流速为每分钟1mL,必要时 可用适当方法加压，待环已烷液面下降至无水硫酸钠层时，用30mL苯洗脱，此时应在紫外 光灯下观察，以蓝紫色荧光物质完全从氧化铝层洗下为止，如30mL苯不足时，可适当增加 苯量。收集苯液于50C-60C水浴上减压浓缩至0.1mL~0.5mL可根据试样中苯并(a)花含 量而定，应注意不可蒸干]。 3、样品提取液的分离： (1)在乙酰化滤纸条上的一端5cm处，用铅笔划一横线为起始线，吸取一定量净化后 的浓缩液，点于滤纸条上，用电吹风从纸条背面吹冷风，使溶剂挥散，同时点20μL苯并 (a)花的标准使用液(1μgmL),点样时斑点的直径不超过3mm,层析缸内盛有展开剂， 滤纸条下端浸入展开剂约1cm,待溶剂前沿至约20cm时取出阴干
四、实验步骤 1、样品制备：称取 50.0g~60.0g 切碎混匀的熏肉,再用无水硫酸钠搅拌(样品与无水硫酸 钠的比例为 1：1 或 1：2)，然后装入滤纸筒内，接好脂肪提取器，加入 100mL 环已烷于 90 ℃水浴上回流提取 6h～8h，然后将提取液倒入 250mL 分液漏斗中，再用 6ml～8mL 环乙烷淋 洗滤纸筒，洗液合并于 250mL 分液漏斗中，以环已烷饱和过的二甲基甲酰胺提取三次，每次 40mL，振摇 1min，合并二甲基甲酰胺提取液，用 40mL 经二甲基甲酰胺饱和过的环已烷提取 一次，弃去环已烷液层。二甲基甲酰胺提取液合并于预选装有 240mL 硫酸钠溶液（20g/L） 的 500mL 分液漏斗中，混匀，静置数分钟后，用环已烷提取两次，每次 100mL，振摇 3min， 环已烷提取液合并于第一个 500mL 分液漏斗。 2、样品提取液的净化处理： （1）于层析柱下端填入少许玻璃棉，先装入 5cm~6cm 的氧化铝，轻轻敲管壁使氧化铝 层填实、无空隙，顶面平齐，再同样装入 5cm ~6cm 的硅镁型吸附剂，上面再装入 5cm~6cm 无水硫酸钠，用 30mL 环已烷淋洗装好的层析柱，待环已烷液面流下至无水硫酸钠层时关闭 活塞。 （2）将试样环已烷提取液倒入层析柱中，打开活塞，调节流速为每分钟 1mL，必要时 可用适当方法加压，待环已烷液面下降至无水硫酸钠层时，用 30mL 苯洗脱，此时应在紫外 光灯下观察，以蓝紫色荧光物质完全从氧化铝层洗下为止，如 30mL 苯不足时，可适当增加 苯量。收集苯液于 50℃~60℃水浴上减压浓缩至 0.1mL~0.5mL[可根据试样中苯并（a）芘含 量而定，应注意不可蒸干]。 3、样品提取液的分离： （1）在乙酰化滤纸条上的一端 5cm 处，用铅笔划一横线为起始线，吸取一定量净化后 的浓缩液，点于滤纸条上，用电吹风从纸条背面吹冷风，使溶剂挥散，同时点 20μL 苯并 （a）芘的标准使用液（1μg/mL），点样时斑点的直径不超过 3mm，层析缸内盛有展开剂， 滤纸条下端浸入展开剂约 1cm，待溶剂前沿至约 20cm 时取出阴干
(2)在365nm或254nm紫外光灯下观察展开后的滤纸条，用铅笔划出标准苯并(a) 花及与其同一位置的试样的蓝紫色斑点，剪下此斑点分别放入小比色管中，各加4mL苯加 盖，插入50℃-60℃水浴中不时振摇，浸泡15min。 4、样品测定： (1)将试样及标准斑点的苯浸出液移入荧光分光光度计的石英比色皿中，以365m为 激发光波长，在365nm460nm波长范围进行荧光扫描，所得荧光光谱与标准苯并(a)芘的 荧光光谱比较定性。 (2)与试样分析的同时做试剂空白，包括处理试样所用的全部试剂同样操作，分别读 取试样、标准及试剂空白于波长406nm、(406+5)nm、(406-5)nm处的荧光强度，按基线 法由下式计算得的数值，为定量计算的荧光强度： F=Faos-(F4o1+F)/2 五、结果计算 试样中苯并(a)芘含量按下式计算。 X=[SF×(F-F2)X1000]/(mXVV,) 式中 X—试样中苯并(a)芘的含量(gkg): S一苯并(a)芘标准斑点的质量(g): F一标准的斑点浸出液荧光强度(mm) F,—试样斑点浸出液荧光强度(mm) F一试剂空白浸出液荧光强度(mm): V,一试样浓缩液体积毫升(mL): V一点样体积(mL): m一试样质量(g): 计算结果表示到一位小数。 六、注意事项及说明
（2）在 365nm 或 254nm 紫外光灯下观察展开后的滤纸条，用铅笔划出标准苯并（a） 芘及与其同一位置的试样的蓝紫色斑点，剪下此斑点分别放入小比色管中，各加 4mL 苯加 盖，插入 50℃~60℃水浴中不时振摇，浸泡 15min。 4、样品测定： （1）将试样及标准斑点的苯浸出液移入荧光分光光度计的石英比色皿中，以 365nm 为 激发光波长，在 365nm~460nm 波长范围进行荧光扫描，所得荧光光谱与标准苯并（a）芘的 荧光光谱比较定性。 （2）与试样分析的同时做试剂空白，包括处理试样所用的全部试剂同样操作，分别读 取试样、标准及试剂空白于波长 406nm、（406+5）nm、（406-5）nm 处的荧光强度，按基线 法由下式计算得的数值，为定量计算的荧光强度： F = F405 − (F401 + F411 )/ 2 五、结果计算 试样中苯并（a）芘含量按下式计算。 X= [ S/F×（F1-F2）×1000 ] /（m×V2/V1） 式中 X——试样中苯并（a）芘的含量（µg/kg）； S——苯并（a）芘标准斑点的质量（µg）； F——标准的斑点浸出液荧光强度（mm）； F1——试样斑点浸出液荧光强度（mm）； F2——试剂空白浸出液荧光强度（mm）； V1——试样浓缩液体积毫升（mL）； V2——点样体积（mL）； m——试样质量（g）； 计算结果表示到一位小数。 六、注意事项及说明