第四章食品添加剂含量的检测 实验一苯甲酸、山梨酸含量的检测 【、气相色谱法 一、目的与要求 1、了解气相色谱仪的基本原理及分析流程。 2、掌握气相色谱分析法操作技术。 3、掌握外标法定量的方法。 二、原理 样品酸化后，用乙醚提取山梨酸、苯甲酸，经浓缩后，用附氢火焰离子化检测器的气相 色谱仪进行分离测定，用外标法与标准系列比较定量。 三、仪器与试剂 1、仪器 (1)气相色谱仪，带有氢火焰离子化检测器： (2)具塞量简： (3)10mL具塞刻度试管或10mL容量瓶： (4)常用玻璃仪器： 2、试剂： (1)乙醚：不含过氧化物。 (2)石油醚：沸程30~60℃。 (3)盐酸(1+1)： (4)石油醚一乙涨(3+1)混合液 (5)氯化钠酸性溶液(40g几)：于氯化钠溶液(40g几)中加少量盐酸(1+1)酸化 (6)无水 酸钠 分析纯)。 (7)苯甲酸、山梨酸标准贮备液： 精密称取苯甲酸、山梨酸各0.2000g,置于100mL容量瓶中，用石油醚一乙醚(3+1) 混合溶剂溶解后并定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于2mg苯甲酸或山梨酸。 (8)材料：饮料 四、测定步骤 1、样品的提取： 吸取10.00mL均匀饮料（如样品中含有二氧化碳，先加热除去），放入150mL分液漏斗中， 加1：1盐酸2mL,用15、10mL乙醚提取两次，每次振摇1min,将上层醚提取液吸入另 个25mL带塞量筒中， 合并乙醚提取液。用3mL氯化钠酸性 40gL)洗涤两次，静止 15min,用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确 吸取5.0mL乙酰提取液于10mL带塞离心管中，置40℃的水浴上挥干，加入2mL石油醚-乙 醚(3+1)混合溶剂溶解残渣，密塞保存备用
第四章 食品添加剂含量的检测 实验一 苯甲酸、山梨酸含量的检测 Ⅰ、气相色谱法 一、目的与要求 1、了解气相色谱仪的基本原理及分析流程。 2、掌握气相色谱分析法操作技术。 3、掌握外标法定量的方法。 二、原理 样品酸化后，用乙醚提取山梨酸、苯甲酸，经浓缩后，用附氢火焰离子化检测器的气相 色谱仪进行分离测定，用外标法与标准系列比较定量。 三、仪器与试剂 1、 仪器 （1）气相色谱仪，带有氢火焰离子化检测器； （2）具塞量筒； （3）10mL 具塞刻度试管或 10 mL 容量瓶； （4）常用玻璃仪器； 2、 试剂： （1）乙醚：不含过氧化物。 （2）石油醚：沸程 30～60℃。 （3）盐酸（1+1）： （4）石油醚－乙醚（3+1）混合液： （5）氯化钠酸性溶液（40g /L）：于氯化钠溶液（40g /L）中加少量盐酸（1+1）酸化。 （6）无水硫酸钠（分析纯）。 （7）苯甲酸、山梨酸标准贮备液： 精密称取苯甲酸、山梨酸各 0.2000g，置于 100mL 容量瓶中，用石油醚－乙醚（3+1） 混合溶剂溶解后并定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于 2mg 苯甲酸或山梨酸。 （8）材料：饮料 四、测定步骤 1、 样品的提取： 吸取 10.00mL 均匀饮料（如样品中含有二氧化碳，先加热除去），放入 150mL 分液漏斗中， 加 1：1 盐酸 2mL，用 15、10mL 乙醚提取两次，每次振摇 1min，将上层醚提取液吸入另一 个 25mL 带塞量筒中，合并乙醚提取液。用 3mL 氯化钠酸性溶液（40g/L）洗涤两次，静止 15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入 25mL 容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确 吸取 5.0mL 乙醚提取液于 10mL 带塞离心管中，置 40℃的水浴上挥干,加入 2mL 石油醚-乙 醚(3+1)混合溶剂溶解残渣,密塞保存备用
2、色谱条件 (1)色谱柱：玻璃柱，内径3mm,长2m,内装涂以质量分数为5%DEGS+1%HPO4固定 液的60 30目chromosorbWAW (2)气体流速：载气为氮气，50 mI/min(氨气和空气、氢气之比按各仪器型号不同选择名 自的最佳比例条件)。 (3)灵敏度：1000 (4)温度：进样口（气化温度）230℃：柱温170℃：监测器230℃ 3、测定 (1)取6支10mL容量瓶，编号，并按下表操作记录。 编号 1 2 3 试剂 取苯甲酸或山梨酸标准0.25 075 100 125 溶液(mL) 相当于苯甲酸或山梨酸50 100 150 200 250 量(ug) 取样品乙醚提取液体积 (mL) 用石油醚定容(mL) 10 10 10 10 10 进样量(L) 2 2 2 2 2 测定峰高值 (2)以苯甲酸或山梨酸量(g)为横坐标，与其对应的峰高值为纵坐标，绘制标准曲线。 (3)用样品测得峰高值与标准曲线比较定量， 五、结果计算 X= A×1000 m×3××100 25 式中 一样品中苯甲酸或山梨酸的含量。 g/kg: A 一测定用样品液中苯甲酸或山梨酸的含量，g: V,一一样品提取液残留物定容的体积，L: V2一一进样体积，L: m一一样品质量.，g或mL: 525.-测定时吸取乙酰提取液的体积(mL)样品乙醚提取液的总体积(mL) 六、注意事项 1、由测得的苯甲酸的量乘以1.18，即为样品中苯甲酸钠的含量。 2、样品处理时酸化可使山梨酸钾、苯甲酸钠转变为山梨酸、苯甲酸。 3、乙醚提取液应用无水硫酸钠充分脱水，进样溶液中含水会影响测定结果 4、气相色谱仪的操作按仪器操作说明进 注意：点火前严禁打开氨气调节阀，以避免氢气逸出引起爆炸：点火后，不允许再转动放大 调零旋钮
2、 色谱条件 （1）色谱柱：玻璃柱，内径 3mm，长 2m，内装涂以质量分数为 5％DEGS+1％H3PO4固定 液的 60～80 目 chromosorbWAW。 （2）气体流速：载气为氮气，50mL/min（氮气和空气、氢气之比按各仪器型号不同选择各 自的最佳比例条件）。 （3）灵敏度：1000 （4）温度：进样口（气化温度）230℃；柱温 170℃；监测器 230℃。 3、测定 （1）取 6 支 10mL 容量瓶，编号，并按下表操作记录。 编号 试剂 1 2 3 4 5 6 取苯甲酸或山梨酸标准 溶液（mL） 0.25 0.5 0.75 1.00 1.25 相当于苯甲酸或山梨酸 量（µg） 50 100 150 200 250 取样品乙醚提取液体积 (mL) 2 用石油醚定容（mL） 10 10 10 10 10 10 进样量（µL） 2 2 2 2 2 2 测定峰高值 （2）以苯甲酸或山梨酸量（µg）为横坐标，与其对应的峰高值为纵坐标，绘制标准曲线。 （3）用样品测得峰高值与标准曲线比较定量。 五、结果计算 X= 1000 25 5 m 1000 1 2 × × × × V V A 式中： X——样品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg； A——测定用样品液中苯甲酸或山梨酸的含量，µg； V1――样品提取液残留物定容的体积，mL； V2――进样体积，µL； m――样品质量，g 或 mL； 5/25-测定时吸取乙醚提取液的体积(mL)/样品乙醚提取液的总体积(mL)。 六、注意事项 1、由测得的苯甲酸的量乘以 1.18，即为样品中苯甲酸钠的含量。 2、样品处理时酸化可使山梨酸钾、苯甲酸钠转变为山梨酸、苯甲酸。 3、 乙醚提取液应用无水硫酸钠充分脱水，进样溶液中含水会影响测定结果。 4、 气相色谱仪的操作按仪器操作说明进行。 注意：点火前严禁打开氮气调节阀，以避免氢气逸出引起爆炸；点火后，不允许再转动放大 调零旋钮
Ⅱ、薄层色谱法 一、目的与要求 1、学习薄层色谱法分离食品中苯甲酸、山梨酸的基本原理。 2、堂握薄层色谱法的基本操作技术。 二、实验原理 试样酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。将试样提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上 展开。显色后，根据薄层板上苯甲酸、山梨酸的比移值。与标准比较定性，并可进行半定量。 三、仪器与试剂 1、仪器 (1)吹风知 (2)层析缸 (3)玻璃板：10cm×18cm: (4)微量注射器：10L、100L: (5)喷雾器。 2、试剂 (1)异丙醇。 (2)正丁醇。 (3)石油醚：沸程30~60℃。 (4)乙醚：不含过氧化物。 (5)氨水 (6)无水乙醇 (7)聚酰胺粉：200目。 (8)盐酸(1+1)：取100mL盐酸，缓慢顺入水中，并稀释至200mL。 (9)氯化钠酸性溶液(401L):于氯化钠溶液(401)中加入少量盐酸(1+1)酸化 (10)展开剂如下 ①正丁醇+氨水+无水乙醇(7+1+2) ②异丙醇+氨水+无水乙醇(7+1+2) (11)山梨酸标准溶液：准确称取0.2000g山梨酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶 中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于2.0mg山梨酸。 (12)苯甲酸标准溶液：准确称取0.2000g苯甲酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶 中，并稀释至刻度 溶液每毫升相当于2.0mg苯甲酸 (13)显色剂：称取溴甲酚紫0.04g以(50%)乙醇溶解并稀释至100mL,用氢氧化钠溶液 (4g/L)调至DH=8。 四、烈定步骤 样品提取：同色谱法“四、1” (1)满层板的制备：称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加约15mL水，研磨3min 5min,立刻倒入涂布器内制成10cm×18cm、厚度0.3mm的薄层板两块，室温干燥后，于
Ⅱ、薄层色谱法 一、目的与要求 1、学习薄层色谱法分离食品中苯甲酸、山梨酸的基本原理。 2、掌握薄层色谱法的基本操作技术。 二、实验原理 试样酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。将试样提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上， 展开。显色后，根据薄层板上苯甲酸、山梨酸的比移值。与标准比较定性，并可进行半定量。 三、仪器与试剂 1、 仪器 （1）吹风机； （2）层析缸； （3）玻璃板：10cm×18cm； （4）微量注射器：10µL、100µL； （5）喷雾器。 2、试剂 （1）异丙醇。 （2）正丁醇。 （3）石油醚：沸程 30～60℃。 （4）乙醚：不含过氧化物。 （5）氨水。 （6）无水乙醇。 （7）聚酰胺粉：200 目。 （8）盐酸（1+1）：取 100mL 盐酸，缓慢倾入水中，并稀释至 200mL。 （9）氯化钠酸性溶液（40g/L）：于氯化钠溶液（40g/L）中加入少量盐酸（1+1）酸化。 （10）展开剂如下： ①正丁醇+氨水+无水乙醇（7+1+2） ②异丙醇+氨水+无水乙醇（7+1+2） （11）山梨酸标准溶液：准确称取 0.2000g 山梨酸，用少量乙醇溶解后移入 100mL 容量瓶 中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于 2.0mg 山梨酸。 （12）苯甲酸标准溶液：准确称取 0.2000g 苯甲酸，用少量乙醇溶解后移入 100mL 容量瓶 中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于 2.0mg 苯甲酸。 （13）显色剂： 称取溴甲酚紫 0.04g 以(50%)乙醇溶解并稀释至 100mL,用氢氧化钠溶液 （4g/L）调至 pH＝8。 四、测定步骤 1、 样品提取：同色谱法“四、1” 2、样品测定 (1)薄层板的制备： 称取 1.6g 聚酰胺粉，加 0.4g 可溶性淀粉，加约 15mL 水，研磨 3min～ 5min，立刻倒入涂布器内制成 10cm×18cm、厚度 0.3mm 的薄层板两块，室温干燥后，于
80℃干燥1h.取出，置于千燥器中保存， (2)点样：在海层板下端2cm的基线上，用微量注射器点10uL,20uL试样液，同时各点10uL 20uL山梨酸 苯甲酸标 (3)展开与显色：将点样后的薄层板放入预先盛有展开剂(10.①或10.②)的展开槽内，周 围贴有滤纸，待溶剂前沿上展至10cm,取出挥干，喷显色剂，斑点成黄色，背景为蓝色。 试样中所含山梨酸、苯甲酸的量与标准斑点比较定量（山梨酸、苯甲酸的比移值依次为0.82、 0.73)。 五、结果计算 试样中苯甲酸或山梨酸的含量按下式进行计算。 A×1000 X=- 10××1000 25V 式中： X一试样中苯甲酸或山梨酸的含量，单位为克每千克(gkg): A一测定用试样液中苯甲酸或山梨酸的质量，单位为毫克(mg): 加入乙醇的体积，单位为亮升(mL): Vz- -测定时点样的体积，单位为毫升(mL), m一试样质量，单位为克(g): 10一测定时吸取乙醚提取液的体积，单位为毫升(mL): 25 一试样乙醚提取液总体积，单位为毫升(mL): 六、注意事项 1、层析用的溶剂系统不可存放太久，否则浓度和极性都会变化，影响分离效果，应新鲜配 用制。 2、在展开之前，展开剂在缸中应预先平衡1h,使缸内蒸气压饱和，以免出现边缘效应。 3、展开剂液层高度不能超过原线高度，约在0.5~1cm,展开至上端，待溶剂前沿上展至 1Ocm时，取出挥干 4、在点样时最好用吹风机边点边吹干，在原线上点，直至点完一定量。且点样点直径不超 过2mm. 思考题 样品处理时，酸化的目的是什么？ 2.气相色谱法定性的依据是什么？用已知物对照法定性时应注意什么？ 3.气相色谱法测定中用外标法定量有何优缺点？ 4.你对薄层色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸的实验有什么体会？ 5.比较两种方法各有什么优缺点？
80℃干燥 1h，取出，置于干燥器中保存。 (2)点样：在薄层板下端 2cm 的基线上，用微量注射器点 10µL，20µL 试样液，同时各点 10µL、 20µL 山梨酸、苯甲酸标准溶液。 (3)展开与显色： 将点样后的薄层板放入预先盛有展开剂（10.①或 10.②）的展开槽内，周 围贴有滤纸，待溶剂前沿上展至 10cm，取出挥干，喷显色剂，斑点成黄色，背景为蓝色。 试样中所含山梨酸、苯甲酸的量与标准斑点比较定量（山梨酸、苯甲酸的比移值依次为 0.82、 0.73）。 五、结果计算 试样中苯甲酸或山梨酸的含量按下式进行计算。 X＝ 1000 25 10 m 1000 1 2 × × × × V V A 式中： X——试样中苯甲酸或山梨酸的含量，单位为克每千克（g/kg）； A——测定用试样液中苯甲酸或山梨酸的质量，单位为毫克（mg）； V1——加入乙醇的体积，单位为毫升（mL）； V2——测定时点样的体积，单位为毫升（mL）； m——试样质量，单位为克（g）； 10——测定时吸取乙醚提取液的体积，单位为毫升（mL）； 25——试样乙醚提取液总体积，单位为毫升（mL）； 六、注意事项 1、 层析用的溶剂系统不可存放太久，否则浓度和极性都会变化，影响分离效果，应新鲜配 制。 2、 在展开之前，展开剂在缸中应预先平衡 1h，使缸内蒸气压饱和，以免出现边缘效应。 3、 展开剂液层高度不能超过原线高度，约在 0.5～1cm，展开至上端，待溶剂前沿上展至 10cm 时，取出挥干。 4、 在点样时最好用吹风机边点边吹干，在原线上点，直至点完一定量。且点样点直径不超 过 2mm。 思考题： 1. 样品处理时，酸化的目的是什么？ 2. 气相色谱法定性的依据是什么?用已知物对照法定性时应注意什么? 3. 气相色谱法测定中用外标法定量有何优缺点？ 4. 你对薄层色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸的实验有什么体会？ 5. 比较两种方法各有什么优缺点?
实验二糖精含量的检测（薄层色谱法） 一、目的与要求 1,学习薄层色谱法测定食品中糖精含量的基本原理 2.掌握薄层色谱法的基本操作技术。 二、原理 在酸性条件下，食品中的糖精钠用乙醚提取，浓缩、薄层色谱分离、显色后，与标准比 较，进行定性和半定量测定。 三、仪器与试剂 1.试剂 (1)盐酸溶液(1：1)为 (2)乙醚（不含过氧化物）： (3)无水硫酸钠：经550℃灼烧4h处理： (4)无水乙醇： (5)展开剂：苯：乙酸乙酯：醋酸=12：7：1： (6)糖精钠标准溶液：称取糖精钠0.1000g,用无水乙醇溶解并定容至100mL。此液含 标准精精钠为1mgmL。 (7)硅酸GF254: (8)羧甲基纤维素纳溶液(0.5%) 2.仪器 (1)玻璃板10×10cm (2)薄层层析装置：（见图4-1） (3)微量吸管及吹风筒： (4)紫外检测仪：波长254nm。 四、测定步骤 1.样品的提取 图41薄层层析装置 (1)饮料、冰棍、汽水： 1一层析缸：2一展开剂气：3一层板： 取10.0mL均匀试样（如试样中含有二氧化碳，先 4一盛液（悠展开剂：一隔 加热除去。如试样中含有酒精，加4%氢氧化钠溶液使其量碱性，在沸水浴中加热除去)， 置于100mL分液漏斗中，加2mL盐酸(1+1)，用30、20、20mL乙醚提取三次，合并乙 提取液，用5mL盐酸酸化的水洗涤一次，弃去水层。乙醚层通过无水硫酸钠脱水后，挥发 乙醚，加2.0mL乙醇溶解残留物，密塞保存，备用， (2)酱油、果汁、果酱等： 称取20.0g或吸取20.0mL均均试样，置于100mL容量瓶中，加水至约60mL,加20mL
实验二 糖精含量的检测(薄层色谱法) 一、目的与要求 1. 学习薄层色谱法测定食品中糖精含量的基本原理。 2. 掌握薄层色谱法的基本操作技术。 二、原理 在酸性条件下，食品中的糖精钠用乙醚提取，浓缩、薄层色谱分离、显色后，与标准比 较，进行定性和半定量测定。 三、仪器与试剂 1. 试剂 （1）盐酸溶液（1:1）； （2）乙醚（不含过氧化物）； （3）无水硫酸钠：经 550℃灼烧 4h 处理； （4）无水乙醇； （5）展开剂：苯：乙酸乙酯：醋酸=12：7：1； （6）糖精钠标准溶液：称取糖精钠 0.1000g，用无水乙醇溶解并定容至 100mL。此液含 标准精精钠为 1mg/mL。 （7）硅酸 GF254； （8）羧甲基纤维素钠溶液（0.5%）。 2. 仪器 （1）玻璃板 10×10cm； （2）薄层层析装置；（见图 4-1） （3）微量吸管及吹风筒； （4）紫外检测仪：波长 254nm。 四、测定步骤 1. 样品的提取 （1）饮料、冰棍、汽水： 取 10.0mL 均匀试样（如试样中含有二氧化碳，先 加热除去。如试样中含有酒精，加 4%氢氧化钠溶液使其量碱性，在沸水浴中加热除去）， 置于 100mL 分液漏斗中，加 2mL 盐酸（1+1），用 30、20、20mL 乙醚提取三次，合并乙醚 提取液，用 5mL 盐酸酸化的水洗涤一次，弃去水层。乙醚层通过无水硫酸钠脱水后，挥发 乙醚，加 2.0mL 乙醇溶解残留物，密塞保存，备用。 （2）酱油、果汁、果酱等： 称取 20.0g 或吸取 20.0mL 均均试样，置于 100mL 容量瓶中，加水至约 60mL，加 20mL 图 4-1 薄层层析装置 1—层析缸；2—展开剂蒸气；3—薄层板； 4—盛液皿（盛展开剂）；5—隔板
硫酸铜溶液(100gL),混匀，再加4.4mL氢氧化钠溶注(40gL),加水至刻度，混匀，静 置30min,过滤，取50mL滤液置于150mL分液漏斗中，以下按上述样品处理中(1)自“加 2ml盐酸(1+1).”起依法操作 (3)固体果汁粉等： 称取20.0g磨碎的均匀试释，置于200mL容量瓶中，加100mL水，加温使溶解，放冷 以下按上述样品处理中(2)自“加20mL硫酸铜溶液(100gL).”起依法操作。 (4)糕点、饼干等蛋白、脂肪、淀粉多的食品： 称取25.0g均匀试样，置于透析用玻璃纸中，放入大小适当的烧杯内，加50mL氢氧化 钠溶液(0.8gL)。调成糊状，将玻璃纸口扎紧，放入盛有200mL氢氧化钠溶液(0.8gL) 的烧杯中，盖上表面皿，透析过液。 量取125mL透析液（相当12.5g试样），加约0.4mL盐酸(1+1)使成中性，加20mL 硫酸铜溶液(100gL),混匀，再加4.4mL氢氧化钠溶液(40gL),混匀，静置30min,过 滤。取120mL(相当10g试样)，置于250mL分液漏斗中，以下按(1)中自“加2mL盐酸 (1+1).”起依法操作。 2.薄层板的制备 ()制板前的预处理 制板前应对玻璃板进引预处理，先用水或洗涤剂充分洗净烘干，在涂料前用无水乙醇或 乙醚的脱脂棉擦净 (2)吸附剂的调制 称1.4g硅胶GF254于小研体中，加入4.5mL,0.5%CMC-Na溶液，充分研匀，但不宜 过于剧烈，以免产生气泡，使固化后薄板上引起泡点。 (3)涂布操作 将研匀的浆液倾注于10×10m玻璃板中间，然后把玻璃板前后左右缓缓倾斜，使浆液 均匀布满整板玻璃板，将其置于水平的位置上让其自然干燥后收入薄板架上。 (4)薄层板的活化和保存 将自然干燥后的薄板放入干燥箱中，在100℃活化1h,然后放于干燥器中保存，供一周 内使用。 3.点样 点样前对薄层板进行修整，然后在兼板下端2©m处（用铅笔轻轻画一直线为原线），用 微量注射器分别点10μL和20L的样液两个点，同时点3.0、5.0、7.0、10μ糖精钠标准 溶，（相当于精钠3、5、7、10ug)各点间距1.5cm。 4.展开与显色 将点好的薄层板放入盛有展开剂的展开槽中，展开剂液层高度不能超过原线高度，（一 般约0.5~1cm),展开至上端约8cm,取出薄层板，挥干展干剂，在紫外光灯下观察，确定 赛点的位置及大小 5.检出 (1)定性薄层板经斑点显色后，根据试样点与标准点的比移值R定性，（见图4一2） 比移值计算如下：
硫酸铜溶液（100g/L），混匀，再加 4.4mL 氢氧化钠溶注（40g/L），加水至刻度，混匀，静 置 30min，过滤，取 50mL 滤液置于 150mL 分液漏斗中，以下按上述样品处理中（1）自“加 2mL 盐酸（1+1）.”起依法操作。 （3）固体果汁粉等： 称取 20.0g 磨碎的均匀试释，置于 200mL 容量瓶中，加 100mL 水，加温使溶解，放冷， 以下按上述样品处理中（2）自“加 20mL 硫酸铜溶液（100g/L）.”起依法操作。 （4）糕点、饼干等蛋白、脂肪、淀粉多的食品： 称取 25.0g 均匀试样，置于透析用玻璃纸中，放入大小适当的烧杯内，加 50mL 氢氧化 钠溶液（0.8g/L）。调成糊状，将玻璃纸口扎紧，放入盛有 200mL 氢氧化钠溶液（0.8g/L） 的烧杯中，盖上表面皿，透析过液。 量取 125mL 透析液（相当 12.5g 试样），加约 0.4mL 盐酸（1+1）使成中性，加 20mL 硫酸铜溶液（100g/L），混匀，再加 4.4mL 氢氧化钠溶液（40g/L），混匀，静置 30min，过 滤。取 120mL（相当 10g 试样），置于 250mL 分液漏斗中，以下按（1）中自“加 2mL 盐酸 （1+1）.”起依法操作。 2. 薄层板的制备 （1）制板前的预处理 制板前应对玻璃板进引预处理，先用水或洗涤剂充分洗净烘干，在涂料前用无水乙醇或 乙醚的脱脂棉擦净。 （2）吸附剂的调制 称 1.4g 硅胶 GF254 于小研钵中，加入 4.5mL，0.5%CMC-Na 溶液，充分研匀，但不宜 过于剧烈，以免产生气泡，使固化后薄板上引起泡点。 （3）涂布操作 将研匀的浆液倾注于 10×10cm 玻璃板中间，然后把玻璃板前后左右缓缓倾斜，使浆液 均匀布满整板玻璃板，将其置于水平的位置上让其自然干燥后收入薄板架上。 （4）薄层板的活化和保存 将自然干燥后的薄板放入干燥箱中，在 100℃活化 1h，然后放于干燥器中保存，供一周 内使用。 3. 点样 点样前对薄层板进行修整，然后在薄板下端 2cm 处（用铅笔轻轻画一直线为原线），用 微量注射器分别点 10μL 和 20μL 的样液两个点，同时点 3.0、5.0、7.0、10μ糖精钠标准 溶，（相当于精钠 3、5、7、10ug）各点间距 1.5cm。 4. 展开与显色 将点好的薄层板放入盛有展开剂的展开槽中，展开剂液层高度不能超过原线高度，（一 般约 0.5～1cm），展开至上端约 8cm，取出薄层板，挥干展干剂，在紫外光灯下观察，确定 斑点的位置及大小。 5. 检出 （1）定性 薄层板经斑点显色后，根据试样点与标准点的比移值 Rf定性，（见图 4－2） 比移值计算如下：
比移值R,= 点至点中心的距离一号 原点至溶剂前沿的距离 溶剂前沿线 原点 图+2比移值测量示意图 (2)定量 ①直接半定量法 在薄层板上测量斑点面积或颜色深浅比较作半定量，本实验条件下，可直接根据试样与 标准的斑点面积大小及颜色深浅比较，记录其点样体积，进行半定量。 ②洗脱定量法 将吸附剂上的斑点刮入小烧杯中，加入适量的碳酸氢钠浸出后，经离心分离，取清液用 比色法、分光光度法等与标准比较定量。 五、结果计算 试样中糖精钠含最计算 X=4x100 式中：X一试样中糖精钠的含量，单位为克每千克或克每升(gkg或gL) A一测定用样液中糖精钠的质量，单位为毫克(mg)》 m -试样质量或体积，单位为克或毫升(g或mL): V -试样提取液残留物加入乙醇的体积，单位为毫升(mL) V2一点样液体积，单位为毫升(mL)。 计算结果保留三位有效数字 六、注意事项 同苯甲酸、山梨酸含量的检测中薄层色谱法“六” 思考题 1.样品处理时，酸化的目的是什么？ 2.薄层板制备前如何进行预处理？为什么？ 3.点样前为什么要对薄层板进行修整？ 4.展开时用展开剂液层高度为什么不能超过原线高度？ 5.你对薄层色谱法测定糖精的实验有什么体会？
b a Rf = = 原点至溶剂前沿的距离 原点至斑点中心的距离 比移值 图 4-2 比移值测量示意图 （2）定量 ① 直接半定量法 在薄层板上测量斑点面积或颜色深浅比较作半定量，本实验条件下，可直接根据试样与 标准的斑点面积大小及颜色深浅比较，记录其点样体积，进行半定量。 ② 洗脱定量法 将吸附剂上的斑点刮入小烧杯中，加入适量的碳酸氢钠浸出后，经离心分离，取清液用 比色法、分光光度法等与标准比较定量。 五、结果计算 试样中糖精钠含量计算 1000 1000 1 2 × × × = V V m A X 式中：X——试样中糖精钠的含量，单位为克每千克或克每升（g/kg 或 g/L）; A——测定用样液中糖精钠的质量，单位为毫克（mg）； m——试样质量或体积，单位为克或毫升（g 或 mL）； V1——试样提取液残留物加入乙醇的体积，单位为毫升（mL）； V2——点样液体积，单位为毫升（mL）。 计算结果保留三位有效数字。 六、注意事项 同苯甲酸、山梨酸含量的检测中薄层色谱法“六” 思考题 1. 样品处理时，酸化的目的是什么？ 2. 薄层板制备前如何进行预处理？为什么？ 3. 点样前为什么要对薄层板进行修整？ 4. 展开时用展开剂液层高度为什么不能超过原线高度？ 5. 你对薄层色谱法测定糖精的实验有什么体会？
实验三亚硝酸盐、硝酸盐含量的检测 I、亚硝酸盐含量的检测（盐酸萘乙二胺法） 一、目的与要求 1.学习肉制品中食品添加剂一亚硝酸盐的检测方法。 2.掌握盐酸萘乙二胺法的基本操作技术。 二、原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氨 化后，再与盐酸萘乙二胺偶合生成紫红色化合物，颜色的深浅与亚硝酸盐含量成正比， 其最大吸收波长为538m,可测定吸光度并与标准比较定量。 三、仪器与试剂 1.仪器 (1)721型分光光度计：（见图43） (2)比色管、各种移液管及常用玻璃仪器： (3)小型胶肉机。 2.试剂 (1)饱和硼砂溶液：溶解5g硼酸钠(NaB,0,·10H,0),于100mL热水中，冷却 后备用。 (2)硫酸锌溶液：溶解30g硫酸锌(ZnS0:·7H,0)于100mL水中。 (3)对氨基苯磺酸溶液(0.4%)：溶解0.4g对氨基苯磺酸于100mL20%盐酸中，避光 保存。 (4)盐酸萘乙二胺溶液(0.2%)：溶解0.2g盐酸萘乙二胺于100mL水中，避光保存。 (5)亚硝酸钠标准溶液：精确称取0.1000g亚硝酸钠（硅胶干燥中干燥24小时） 加水溶解，移入500mL容量瓶，并稀释至刻度，混匀，临用前吸取5.00mL于200mL容 量瓶中，加水至刻度，混匀，此溶液每毫升相当5μg亚硝酸钠。 (6)材料：午餐肉或腊肠。 四、测定步骤 1.样品中亚硝酸钠的提取 (1)称取2.50g经绞碎混匀的样品，于50mL烧杯中，加硼砂饱和溶液6.3mL,搅拌均 匀。 (2)以70℃左右的热水约150mL将样品全部洗入250mL容量瓶中，置沸水浴加热 15mine (3)取出冷却至室温，一面转动，一面滴加1.3mL硫酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至 刻度，混匀，放置30min
实验三 亚硝酸盐 、硝酸盐含量的检测 Ⅰ、亚硝酸盐含量的检测（盐酸萘乙二胺法） 一、目的与要求 1. 学习肉制品中食品添加剂——亚硝酸盐的检测方法。 2. 掌握盐酸萘乙二胺法的基本操作技术。 二、原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮 化后，再与盐酸萘乙二胺偶合生成紫红色化合物，颜色的深浅与亚硝酸盐含量成正比， 其最大吸收波长为 538nm，可测定吸光度并与标准比较定量。 三、仪器与试剂 1. 仪器 （1）721 型分光光度计；（见图 4-3） （2）比色管、各种移液管及常用玻璃仪器； （3）小型胶肉机。 2．试剂 （1）饱和硼砂溶液：溶解 5g 硼酸钠（Na2B4O7·10H2O），于 100mL 热水中，冷却 后备用。 （2）硫酸锌溶液：溶解 30g 硫酸锌（ZnSO4·7H2O）于 100mL 水中。 （3）对氨基苯磺酸溶液(0.4%)：溶解 0.4g 对氨基苯磺酸于 100mL20%盐酸中，避光 保存。 （4）盐酸萘乙二胺溶液(0.2%)：溶解 0.2g 盐酸萘乙二胺于 100mL 水中，避光保存。 （5）亚硝酸钠标准溶液：精确称取 0.1000g 亚硝酸钠（硅胶干燥中干燥 24 小时）， 加水溶解，移入 500mL 容量瓶，并稀释至刻度，混匀，临用前吸取 5.00mL 于 200mL 容 量瓶中，加水至刻度，混匀，此溶液每毫升相当 5μg 亚硝酸钠。 （6）材料：午餐肉或腊肠。 四、测定步骤 1. 样品中亚硝酸钠的提取 （1）称取 2.50g 经绞碎混匀的样品，于 50mL 烧杯中，加硼砂饱和溶液 6.3mL，搅拌均 匀。 （2）以 70℃左右的热水约 150mL 将样品全部洗入 250mL 容量瓶中，置沸水浴加热 15min。 （3）取出冷却至室温，一面转动，一面滴加 1.3mL 硫酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至 刻度，混匀，放置 30min
(4)除去上层脂肪，用滤纸过滤，弃去最初20mL,滤液备用。 2.样品测定 (1)取6支25mL比色管，编号，按下表顺序加入各试剂及操作 管号 0 1 2 3 4 NaNO,标准溶液/ml 0.20 0.40 0.60 0.80 (5μg/mL) 相当于亚硝酸钠 μg 样品提取滤液/ml 20.00 0.4%对氨基苯横酸溶液 1.0 1.00 1.00 1.00 100 1.00 /mL 混匀3~5min 0.2%盐酸茶乙二胺溶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 /mL 吸光度 (2)加水至25.00mL,混匀，静置15min,用2cm比色皿，以零号管调节零点，于波 长538nm处测吸光度，记录。 (3)绘制标准曲线 以亚硝酸钠量（μg)为横坐标，与其对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 (4)用样品提取滤液的吸光度，在以上亚硝酸钠标准曲线上查出亚硝酸钠的量（μg) 五、结果计算 X=- A×1000 式中：X一样品中亚硝酸盐的含量，mgkg: A 一测定用滤液中亚硝酸钠的含量，μg m- -样品的质量，g 20/250 一测定用样液体积mL试样处理液总体积mL。 六、注意事项： 1.本法适用肉制品中硝酸盐的测定。其方法是把沉淀蛋白质、除脂肪的溶液通过镉柱 使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，按此法测得总量B减去试样中亚硝酸盐含量C, 即得试样中硝酸盐（以硝酸钠计）含量(gkg)=(B-C)×1232 1.232一一亚硝酸钠换算到硝酸钠的系数
（4）除去上层脂肪，用滤纸过滤，弃去最初 20mL，滤液备用。 2. 样品测定 （1） 取 6 支 25mL 比色管，编号，按下表顺序加入各试剂及操作。 管号 0 1 2 3 4 5 NaNO2 标准溶液/mL （5μg/mL） 0 0.20 0.40 0.60 0.80 相当于亚硝酸钠量 /μg 0 1 2 3 4 样品提取滤液/mL 20.00 0.4%对氨基苯横酸溶液 1.0 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 /mL 混匀 3～5min 0.2%盐酸萘乙二胺溶液 /mL 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 吸光度 （2）加水至 25.00mL，混匀，静置 15min，用 2cm 比色皿，以零号管调节零点，于波 长 538nm 处测吸光度，记录。 （3）绘制标准曲线 以亚硝酸钠量（μg）为横坐标，与其对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （4）用样品提取滤液的吸光度，在以上亚硝酸钠标准曲线上查出亚硝酸钠的量（μg）。 五、结果计算 1000 250 20 1000 × × × = m A X 式中：X——样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg- ； A——测定用滤液中亚硝酸钠的含量，μg； m——样品的质量，g 20/250——测定用样液体积 mL/试样处理液总体积 mL。 六、注意事项： 1. 本法适用肉制品中硝酸盐的测定。其方法是把沉淀蛋白质、除脂肪的溶液通过镉柱， 使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，按此法测得总量 B 减去试样中亚硝酸盐含量 C， 即得试样中硝酸盐（以硝酸钠计）含量（g/kg）=（B-C）×1.232 1.232——亚硝酸钠换算到硝酸钠的系数
2.样品提取时，也可用亚铁氰化钾溶液2.5mL和乙酸锌溶液2.5mL代替1.3mL硫酸锌 溶液，以沉淀蛋白质，配法： (1)亚铁氰化钾溶液：称取106g亚铁化钾K4F®(CN⅓·3HO],溶于水交稀释至 1000mL (2)乙酸锌溶液：称取220g乙酸锌[Z(CHC00h·2H,加30mL冰乙酸溶于水 并稀释至1000mL。 3.本法与国标方法大同小异，只是用实验室现有的25mL比色管，所有试剂相应减少。 4.当亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将偶氮化合物氧化变成黄色，而使红色 消失，这时可以采取先加入试剂，然后滴加样液，从而避免亚硝酸盐过量。 附：721型分光光度计操作步骤 1.在仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于“0”刻线上，若不是这种情况，则可 以用电表上的校止螺丝进行调节。 2.将仪器的电源开关接通，打开比色皿暗 箱盖，选择需用的单色波长，调节“0”位旋 钮，使电表指“0”，然后将比色皿暗箱盖合日 使比色皿座中的蒸馏水进入光程中，旋转 100%(满度)旋钮使屯表指针指到满度刻度附 近，并让仪器预热约20分钟 3.灵敏度有五挡，是逐步增加的，“1”， 挡最低。其选择原则是：保证使空白档良 图4321分光光度计结构 好调到“100”的情况下，尽可能采用灵敏 1一指示灯：2一电源开关：3一灵每度选择旋 度较低档，这样对测量的稳定性和延长仪 一比色座定位位 :一透光率100电位旋银 6一透光率0电位器旋细：7一波长调竹旋银：8一波长示 器使用寿命都有好处。在灵敏度不够时再 逐步升高，但改变灵敏度后必须重新校止“0”和“100%”。 4.预热后，一般按“2”档连续几次调整“0”和“100%”，即可将比色皿座的样品溶 液推入光程，读取电表上的指示数。 5.仪器测定完毕后，应关闭电源开关。 Ⅱ、硝酸盐含量的检测（镉柱法） 一、原理 试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱，使其中的硝酸根离子还原成亚硝 酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氨化后，再与盐酸恭乙二胺偶
2. 样品提取时，也可用亚铁氰化钾溶液 2.5mL 和乙酸锌溶液 2.5mL 代替 1.3mL 硫酸锌 溶液，以沉淀蛋白质，配法： （1）亚铁氰化钾溶液：称取 106g 亚铁氰化钾[K4Fe (CN)6·3H2O]，溶于水交稀释至 1000mL。 （2）乙酸锌溶液：称取 220g 乙酸锌[Zn (CH3COO)2·2H2O]，加 30mL 冰乙酸溶于水， 并稀释至 1000mL。 3. 本法与国标方法大同小异，只是用实验室现有的 25mL 比色管，所有试剂相应减少。 4. 当亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将偶氮化合物氧化变成黄色，而使红色 消失，这时可以采取先加入试剂，然后滴加样液，从而避免亚硝酸盐过量。 附：721 型分光光度计操作步骤 1. 在仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于“0”刻线上，若不是这种情况，则可 以用电表上的校止螺丝进行调节。 2. 将仪器的电源开关接通，打开比色皿暗 箱盖，选择需用的单色波长，调节“0”位旋 钮，使电表指“0”，然后将比色皿暗箱盖合上 使比色皿座中的蒸馏水进入光程中，旋转 100%(满度)旋钮使屯表指针指到满度刻度附 近，并让仪器预热约 20 分钟。 3. 灵敏度有五挡，是逐步增加的，“1”， 挡最低。其选择原则是：保证使空白档良 好调到“100”的情况下，尽可能采用灵敏 度较低档，这样对测量的稳定性和延长仪 器使用寿命都有好处。在灵敏度不够时再 逐步升高，但改变灵敏度后必须重新校止“0”和“100%”。 4. 预热后，一般按“2”档连续几次调整“0”和“100%”，即可将比色皿座的样品溶 液推入光程，读取电表上的指示数。 5. 仪器测定完毕后，应关闭电源开关。 Ⅱ、硝酸盐含量的检测（镉柱法） 一、原理 试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱，使其中的硝酸根离子还原成亚硝 酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶 图 4-3 721 分光光度计结构 1—指示灯；2—电源开关；3—灵每度选择旋钮； 4—比色皿座定位位杆；5—透光率 100 电位旋钮； 6—透光率 0 电位器旋钮；7—波长调节旋钮；8—波长示窗；