实训指导书 实验一 光学显微撞的操作及细菌、放线菌和 蓝细菌个体形态的观察 一、目的 (一)掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 (二)观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二、显微镜的结构、光学原理及其操作方法 (一)显微镜的结构（实验图一1）和光学原理 显微镜分机械装置和光学系统两部分。 1.机械装置 (1)镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单 筒有直立式（长度为160mm)和后倾斜式（倾斜45）。双简全是倾斜式的，其 中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离， 以适应两眼宽度 不同者调节使用 (2)转换器：转换器装在镜简的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个 孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。 实验图一1显微镜的结构 (3)载物台：载物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的 两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移 动，移动器的作用是夹住和移动标本用。 (4)镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活 动式（可改变倾斜度）两种。 (5)镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。 (6)调节器：调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。可调节物 镜和所需观察的物体之间的距离 ,调节 器有装在镜臀上方或下方的两种，装在镜 臂上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调焦 距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。 2、光学系统及其光学原理 （1)目镜：每台显微镜备有3个不同规格的目镜，例如，5倍(5×)、10 倍(10×)和15倍(15×)，高级显微镜除了上述三种外，还有20倍(20× 的。 (2)物镜：物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍(8×、10×、20×三种)、 高倍(40×或45×)及油镜(10X)。物镜的性能由数值孔径(Numerical Aperture,.N,A.)决定，数值孔径=n·sina/2,其意为玻片和物镜之间的折 射率乘上光线投射到物镜上的最大夹角的一半的正 光线投射到物镜的角度越 大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。是影响数值 孔径的因素，空气的折射率n=1,水的折射率n=1.33,香柏油的折射率n=1.52, 用油镜时光线入射a/2为60°，则sin60=0.87。从实验图一2可知： 以空气为个质时：N.A.=1X0.87三0.87 以水为介质时： N.A.=1.33×0.87=1.16 以香柏油为介质时： 1.52y 0.87= .32 显微镜的性能还依赖于物镜的分辨率，分辨率即能分辨两点之间的最小距离的能
力。分辨率用8表示， 6=0.61×入/.A.(入为波长)，分辨率与数值孔径城 正比，与波长成反比。增大数值孔径，缩短波长可提高显微镜的分辨率，使日的 物的细微结构更清晰可见。事实上可见光的波长(0.38~0.7μm)是不可能缩短 的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。 物错上标右.NA125.100× 01”、160/017、016等字样 其中NA 1.25为数值孔径， 100×为放大倍数 160/0.17”中160表示镜 简长，0.17表示要求盖玻片的厚度。“0I”表示油镜，（即Oi1 Imnersion), 0.16为工作距离。 显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。 (3)聚光器：聚光器安装在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光 器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，提高物镜的分辨率。聚光器可 下调节，它中间装有光圈可调节光亮度，在看高倍镜和油镜时需调节聚光器，合 理调节聚光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。 (4)反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面 镜，光源为灯光时用凹面镜。它可自由转动方向。反光镜可反射光线到聚光器上。 (5)滤光片：自然光由各种波长的光组成，如只需某一波长的光线，可选 用合适的滤光片 以提高分辨 ,增加反差和清晰 滤光片有紫、青、蓝、绿、 黄、橙、红等颜色。根据标本颜色，在聚光器下加相应的滤光片。 (二)显微镜的操作方法 1.低倍镜的操作 (1)置品倍干固定的卓上。窗外不宣有暗得视线之物 (2)旋动转换器， 将低倍镜移到镜筒】 )转动反光前石光驱处，同时用眼对准目皖对适当政大倍数的霜 镜)仔细观察，使视野亮度均匀。 (4)将标本片成在我物台上，使观察的目的物置于圆孔的正中央 (5)将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转），眼睛注视物镜，以防物 镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.5©m处时停止旋转 (6)左眼向目镜里观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十 分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。 (7)如果粗调节器旋得太快，使超过焦点，必须从第(5)步重调，不应正 视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。 (8)观察时两眼同时睁开（双眼不感披劳）。单筒显微镜应习惯用左眼观 以便于 会图 2.高倍镜的操作 (1)使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移至视野正中处 (2)旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，说明原 来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了， 换高倍镜时基本可以看到目的物。若有点模糊，用细调节器调就清晰可见， 3.油镜的操作 (1)如果用高倍镜目的物末能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查 标本片，将目的物移到视野正中。 (2)在载玻片上滴一演香柏油（或液体石蜡），将油镜移至正中使油镜头 浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细调节器微微向上调（切记不用粗调节器）即 可】
(3)油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油揩净，另用擦镜纸蘸少许二甲 苯搭拭镜头，再用擦镜纸揩干。 (三)目测微尺、物测微尺及其使用方法 1.目测微尺 耳测激尺是一圆形破片，其中央刻有5mm长的、第分为50格（或100热） 的标尺，每格的长度随使用目镜和物镜的放大倍数及镜简长度而定。使用前用物 测微尺标定，用时放在目镜内。 2.物测微尺 物测微尺是一厚玻片，中央有一圆形盖玻片，中央刻有1m长的标尺，等分 为100格，每格为10μm,用以标定目测微尺在不同放大倍数下每格的实际长度。 3.目测微尺的标定 将目测做尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下：把物测微尺放在载物台上使刻 度朝上。用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第 条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。例如实验图一3④中A(目测微尺)上5 格对准B物测微尺上的 2格，B的 格为】 2格的长度为20 测微尺上1小格的长度为4μm,再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长 度。 4.南体大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物的大小，分别找 出菌体的长和宽占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和 宽度。 三、细菌、放线菌及蓝细菌的个体形态观察 (一)仪器和材料 1.显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯 示范片 大肠杆菌（杆状 小球菌（球形） 硫酸盐还原菌（弧形） 浮游球衣菌（丝状）、枯草芽抱杆菌、细菌鞭毛及细菌荚膜。放线菌、颜藻、鱼 腥藻或念味藻。 (二实验内容和操作方法 1,严格按光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序逐个观察杆 状、球状、弧状及丝状的细菌示范片，用铅笔分别绘出各种细南的形态图。 2,同法逐个观察放线菌的示范片 绘出其形态图。 3。同法逐个观察雪颤漠、鱼腥桑或念珠漠，绘出其形态图。 思考题 1.使用油镜为什么要先用低倍和高倍镜检查？ ※ 实验二微生物细胞数的计数
一、目的 了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法。 二、仪器与材料 显微镜、血球计数板、移液管、酵母菌液（不用酵母菌，改用其他微生物作 材料亦可) 三、血球计数板的结构与计算方法 血求计板（实验图一5)是一快比普通载破片厚的特制破片。破片中央刻 有四条 中央两条槽之间的平面比其他平面略低，中央有一小槽，槽的两边的 平面上各刻有9个大方格。中间的一 个大方格为计数室，它的长和宽各为1mm, 深度为0.1m,其体积为0.1mm'。计数室有两种规格：一种是把大方格分成16 中格，每一中格分成25小格，共400小格：另一种规格是把一大方格分成25 中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。计算方法如下： 16×25的计数板计算公式 细胞数/ml= (100小格内的细胞数/100)×400×1000×稀释倍数 2、25×16的计数板计算公式 细胞数/mL=(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数 四、操作步骤 (一）稀释样品 为了便于计数 将样品适当稀释，使每格约含5个细胞 )取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取 少许充分摇匀的待测南液于盖玻片的边缘，南液则自行渗入计数室，静置5一 10min即可计数。 (一)将血球补数板智千截物台上，用低倍箭找到小方格网后换高倍箭观察 计数。需不断地上 下旋动细调节器，以便看到计数室内不同深度的茵体。现以 16×25规格的计数板为例，数四个角（左上、右上、左下、右下 的四中格（即 100小格)的酵母菌数。如果是25×16规格的计数板，除取四个角上四中格外， 还取正中的一个中格（即80小格），对位于大格线上的酵母南只计大格的上方 及左方线上的酵母菌，或只计下方及右方线上的酵母菌。 每个样品重复计数3次，取平均值，再按公式计算每毫升菌液中所含的酵母 南 思考题 为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？ ※ 实验三微生物的染色 一、目的
学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一股染色 法和革兰氏染色法。 二、染色原理 微牛吻（尤其是细菊）的机体是无色诱明的，在显教增下，由干光源是自然 光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差 微生物的形态就可看得清楚。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生 物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液 中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测 定，细菌等电点在pH2~5之间，故细菌在中性(pH7)、碱性(pH>7)或偏 酸性(pH6 7)的溶液中，细菌 电点均 于上述溶液的H值，所以细菌带 负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。碱性染料 有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红等。 微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结 构以便观察。 三、染色方法有简单染色法和复染色法之分 (一)简单染色法 简单染色法又叫普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在 显微镜下看清细南的形态，用简单染色即可。 (二)复染色法 用两种 多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴 染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医 学上采用。此处介绍革兰氏染色法。 革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法。它可将细菌区别为革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性南两大类。它的染色步骤如下：先用草酸铵结晶紫染色 经碘一碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色， 最后用蓄红液复染 如果细 菌能保 持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，用蕃红液复染后仍呈紫色者叫革 兰氏阳性菌。被乙醇脱色用蕃红液复染后呈红色者为革兰氏阴性菊。 四、仪器和材料 一)显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环 载玻片、酒精灯（或煤气灯） 二)石炭酸复红（品红）染液、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、 蕃红染液 (三)菌种：枯草杆菌、大肠杆菌 五、实验内容和步骤 ·)细菌的简单染色步骤 1,涂片 取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号并滴一滴无菌蒸馏水于载 玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从叙面挑取少量菌种（大肠杆菌 或枯草杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布血
不宜过大。（注：活性污泥染色是用滴管取一滴活性污泥于载玻片上铺成一簿层 即可。) 2.干操 最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。但不宜在 高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。 3.固定 将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过2一3次，由于加热使蛋白 质凝固而固者在载玻片上。 4.染色 在载玻片上滴加染色液（石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种），使 染液铺盖涂有细菌的部位作用约lmin。 5.水洗 倾去染液，斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至水呈无色为 止。 G贴王 将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠（注意勿将细菌擦掉） 镜检 用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。 (二)细菌的革兰氏染色步骤 1.取大肠杆菌和枯草杆南（均以无菌操作）分别做涂片（如实验图一6）、 干燥、固定。方法均与简单染色的相同。 2.用草酸铵结晶紫染液染lmin,水洗 3.加革氏碘液媒染1min,水洗。 4.斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 即可，随即水洗。（注：为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30s至45s, 用红液复染1i木洗，染色结果见实轮一7 水洗。) 用吸水纸吸掉水滴，待标本片 后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目 的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色 的结果 染色关键：必须严格掌握乙醇脱色程度，如果脱色过度，阳性菌被误染为阴 性菌：若脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。 思考趣 1.微生物的染色原理是什么？ 2.你用苹兰氏染色法染大肠杆南和枯草杆菌后各得什么结果（包括颜色。 细菌形态、为何种染色反应等)？ 3苹兰氏染色 去中若只做1一4的步骤而不用蕃红染液复染，能否分辨出革 兰氏染色结果？为什么？ 4.微生物经固定后是死的还是活的？ 5.通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实我意义？ 实验四培养基的制备和灭菌
本次实验为实验七微生物纯种分离培养作准备，实验内容主要包括玻璃器 皿的洗涤、包装，培养基的制备及灭菌技术等。 一、目的 (一)熟悉玻璃罂皿的洗涤和灭菌前的准备工作 (二)掌握培养基和无菌水的制备方法 (三)掌握高压蒸气灭菌技术。 二、仪器和材料 (一)培养皿（直径90mm)10套，试管(15mm×150mm)5支、(18mm×180mm) 5支、移液管(10ml)1支、(1ml)2支，锥形瓶(250ml)2个，烧杯(300mL) 1个，玻璃味30粒 (二)纱布、棉花、牛皮纸（或报纸） (三)精密pH试纸6.4~8.4、10附HC1、10%N0H (四)牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、或市售营养琼脂培养基、蒸馏水 (五)高压蒸气灭菌锅、烘箱、煤气灯或酒精灯 三、实验内容 (一)玻璃器皿的洗涤和包装 1。洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加 去污粉洗制并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗制干净 的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用 2.包装 (1)移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成1~1.5cm长的棉塞（以 防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内)。棉塞要塞得松紧适宜，吸时既 能通气，又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的移液管的尖端，放在4~5携 宽的长纸条的一端，程 答上 纸条约成30°夹角， (实验图一8A),用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包 在移液管外面，余下纸头折叠打结。按实验需要，可单支包装或多支包装，待灭 有 (2)用棉塞将试管管口和锥形瓶瓶口都塞 棉塞的制作：按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量 ,将棉花铺成中心厚」 周围逐渐变薄的圆形，对折后卷成卷， 手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶的 口内，棉塞不宜过松或过紧，用手提棉塞，以管、瓶不掉下为准。棉塞四周应紧 贴管壁和瓶壁，不能有皱折，以防空气微生物沿棉塞皱折侵入。棉塞插入2/3， 其余留在管口（或瓶口）外，便于拔塞。试管、锥形瓶塞好棉塞后，用牛皮纸包 并用细绳或橡皮筋捆扎好（实验图一8B)放在铁丝或铜丝篓内待灭菌 3)培养皿由一底一盖组成 套，用牛皮 纸或报纸将10套培养m(皿底 朝里，皿盖朝外，5套、5套相对)包好，见实验图一8C。 （二)培养基的制备 培养基是微生物的繁殖基地。通常根据微生物生长繁殖所需要的各种营养 物配制而成。其中含水分、碳化合物、氨化合物、无机盐等，这些营养物可提供 微生物碳源、能源、氮派等，组成细胞及调节代谢活动。按培养目的不同，或培
养不同种类微生物可配成各种培养基。通常培养细菌是用肉膏蛋白胨培养基，培 养放线菌常用淀粉培养基，用豆芽汁培养得菌，用麦芽汁培养酵母菌。 培养微生物除了满足它们各自营养物要求外，还要给予适宜的H、渗透压 和温度等。 根据研究目的的不同，可配制成固体、半固体和液体的培养基。固体培养 基的成分与液体相同 仅在液体培养基中加入凝固剂使呈固 通常 15g/L~30g/L的琼脂为固体培养基：加入3g/L一5g/L的琼脂为半固休培养基 有的细菌还需用明胶或硅胶。本实验用固体培养基和液体培养基。培养基的制备 过程如下： 1制容液 容量的烧杯盛入定量无菌水 ,按培养基配方逐一称取各种成分，依 次加入水中溶解。蛋白陈、肉膏等可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足因 加热蒸发的水量。注意：在制备固体培养基加热融化琼脂时要不断搅拌，避免琼 脂糊底烧焦。 2.调节H 用精密 试纸测培养基的 l, 体积百分数10%1HCI调整至所需的pH。 按pH的要求用质量浓度100g/LaOH或 3.过滤 用纱布或滤纸或棉花过滤均可。如果培养基杂质很少或实验要求不高，可 不过滤 4。分 按实验图 一9所示，将培养基分装于试管中或锥形瓶中（注意防止培养星 玷污管口或瓶口，避免浸湿棉塞引起杂菌污染)，装入试管的培养基量视试管的 大小及需要而定，一般制斜血培养基时，每支试管装的量为试管高度的1/4一 1/3. 5.斜面培养基的制作 将已灭菌的装有琼脂培养基的试管取出，趁热斜置在木棒（或橡皮管）上 使试管内的培养基斜血长度为试管长度的1/3一1/2之间，待培养基凝固后即 成斜面（如实验图一10）。 (三)本实验用培养基的制备 肉膏蛋白陈琼脂培养基（供测定细菌总数用及细菌纯种分离培养用） 1培其方 牛肉膏0. 75g蛋白胨1.5g氯化钠0.75g琼脂3g蒸馏水150 mlpH=7.6灭菌：1.05kg/cm,20mina 2.操作 (1)取一个300mL的烧杯，装150mL蒸馏水。 (2)在药物天平上依次称取配方中各成分，放入水中溶解，待琼脂完全融 化后停止加执 补足蒸发损失的水量。用10%Na0H调整pl至 本实验省 略过滤。将培养基分装5支试管中，其余的全部倒入250mL的锥形瓶中，分别塞 上棉塞，包好待灭菌。 (四)无菌稀释水的制备 1.取一个250ml的锥形瓶装90（或99）mL蒸馏水，放30颗玻璃珠（用 于打碎活性污泥、菌块或土壤颗粒)于雏形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。 2另取5支18m×180m的试管，分别装9L蒸馏水，塞棉塞、包扎
待灭菌 五)灭菌 灭菌是用物理、化学因素杀死全部微生物的营养细胞和它们的芽孢（或孢 子)。消毒和灭菌有些不同，它是用物理、化学因素杀死致病微生物或杀死全部 微生物的营养细胞及一部分芽孢。 灭菌方法 灭菌方法很多，有过滤除菌法：化学药品消毒和灭菌法，利用酚、含汞药 物及甲醛等使细菌蛋白质凝固变性以达灭菌目的：还有利用物理因素，例如高温、 紫外线和超声波等灭菌的。加热灭菌是最主要的，加热灭菌法有两种：干热灭菌 和高压蒸气灭菌。高压蒸气灭菌比干热灭菌优越，因为湿热的穿透力和热传导都 比干热的强，湿热时微生物吸收高温水分，菌体蛋白很易凝固变性，所以湿热灭 菌效果好。湿热灭菌的温度 般是在121℃， 灭菌15 20 min:而干热灭菌的溢 度则是160℃，灭菌2h,才能达到湿热灭菌121T的同样效果。 (1)干热灭菌法：培养皿、移液管及其他玻璃器皿可用干热灭菌。先将已包 装好的上述物品放入恒温箱中，将温度调至160℃后维持2h,把恒温箱的调节 旋扭调回零处，待温度降到50℃左右，才可将物品取出 者注音 灭菊时温度不得超过170℃，以免包装纸烧焦。灭菌好的器皿应 保存好，切勿弄破包装纸，否则会染菌 (2)高压蒸气灭菌法：该法使用高压灭菌锅（实验图一11），微生物实验 所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）等都可用此法灭南。 高压蒸气灭菌锅是能耐一定压力的密闭金属锅，有立式和卧式两种。灭菌 锅上附有压力表、排气阀、安全阀、加水口、排水口等。卧式灭菌锅还附有温度 计。有的还有蒸气 灭菌锅的加热源有电、煤气和蒸气三种 2。灭菌的操作过程 (1)加水：立式锅是直接加水至锅内底部隔板以下1/3处。有加水口者由 加水口加入至止水线处。 (2)装锅：把需灭南的器物放火锅内（请注意：器物不要装得太满，否则 灭菌不彻底) ，关严锅盖 (对角式均匀拧 紧螺旋) 打开排气阀。 (3)点火：用电源的则启动开关。热源为蒸气的则慢慢打开蒸气进口，避 免蒸气过猛冲入锅内。 (4)关闭排气阀：待锅内水沸腾后，蒸气将锅内冷空气驱净，当温度计指 针指向100℃时，证明锅内已充满蒸气，则关排气阀。如果没有温度计，则视排 气阀排出蒸气相当猛烈且微带蓝色时，可关闭排气阀。 (5)升压、 升温：关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸气不断增多 压力计和温度计的指针上升，当压力达到1.05kg/cm(温度为121℃)即灭菌 开始，这时调整火力大小使压力维持在1.05kg/cm15~30min.除含糖培养基用 0.56kg/cm压力外，一般都用1.05kg/cm压力。 (6)中断执.大到灭若间要求后止加执，任其白降压，当指针回 到0时，打开排气阀 (请注意， 气阀不能过早打开 否则培养基因压力突降 温度没下降面使培养基翻腾冲到棉塞处，既损失培养基又玷污了棉塞)。 (7)揭开锅盖，取出器物，排掉锅内剩余水。 (8)待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h,若无荫生长则放入冰箱 或阴凉处保存备用。 湿热灭菌除加压的以外，还有在常压下灭菌的，这叫间歇灭菌。此法用于
些受高温破坏的培养基的灭菌。它是在连续的3阳内，每天蒸煮一次，100℃煮 30-60min后冷却，置于对37℃培养24h,次日又蒸煮一次，重复前一天的工 作，第三天蒸煮后基本无菌了，为确保无菌仍要置于37℃培养24h,确无菌方可 使用。 思考 1.培养基根据什么原理配制成？肉青蛋白胨琼脂培养基中不同成分各起什 么作用？ 2.为什么湿热比干热灭菌优越 实验五 细菌纯种分离、培养和接种技术 一、目的 (一)掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离培养细 菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。 (二)掌握几种接技术 二、仪器和材料 (一）无菌培养皿（直径90mm)10套、无菌移液管1mL,2支、10ml1支 (二)营养琼脂培养基1瓶、活性污泥或土壤或湖水1瓶、无菌稀释水90mLI 瓶、9mlL的5管。 (三)接种环、酒精灯或煤气灯、恒温箱 三、细菌纯种分离的操作方法 细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。 (一)稀释平板分离法 1.取样 用无南锥形瓶到现场取一定量的活性污泥或土壤或湖水，迅速带回实验 2.稀释水样 将1瓶90mL和5管9mL的无菌水排列好，按10、10、10、10、10 及10依次编号。在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取10mL水样 (或其他样品10g)置于第一瓶90mL无菌水（内含玻璃珠）中，将移液管吹 洗三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为10浓度的南液。用1 菌移液管吸取1mL10'浓度的菌液于一管9L无菌水中，将移液管吹洗三次 摇匀即为10浓度菌液。同样方法，依次稀释到10。稀释过程如实验图一12。 3.平板的制作 取10套无菌培养皿编号，10'、10°、10各3个，另1个为空气对照。取 1支1mL无菌移液管从浓度小的10菌液开始，以10、10、10为序分别吸取 0.5ml.菌液于 相 的 培养 1内 手次吸取前 用移液管在菌液中吹泡 菊液充分混匀)加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养 基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住 皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反 时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30 ℃培养24~48h,然后观察结果。（注：若在无菌室内操作，倒平板按图一13