高效液相色谱知识收藏 Agilent0高压液相色谱仪基本操作步骤 Agilent1100液相基本操作 步骤 Agilent 11100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项: 高压液相色谱HPIC常见故障及排除方法 液相色谱柱使用及保养 高压液相色谱HPIC培训教程() 高压液相色谱HPLC培训教程(七) 高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生 HPLC对流动相的基本要求 高效液相色谱 Waters600E-2487HPLC系统 SOPWaters高效液相色谱系统操作规程 高效液相色谱仪( Agilent1100操作注意事项 色谱扫盲班
e 高效液相色谱知识收藏 Agilent1100 高压液相色谱仪基本操作步骤 Agilent1100 液相基本操作 步骤 Agilent1100 高压液相色谱仪维护保养知识保养事项： 高压液相色谱 HPLC 常见故障及排除方法 液相色谱柱使用及保养 高压液相色谱 HPLC 培训教程(一) 高压液相色谱 HPLC 培训教程(七) 高效液相色谱仪中反相 HPLC 柱子的清洁和再生 HPLC 对流动相的基本要求 高 效 液 相 色 谱 Waters 600E-2487 HPLC 系统 SOPWaters 高效液相色谱系统操作规程 高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事项 色谱扫盲班
Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤 Agilent1100液相基本操作 步骤 (一)、开机: 1、打开计算机,进入 Windows nt(或 Windows2000)画面, 并运行 Bootp server程序 2、打开1100LC各模块电源 3、待各模块自检完成后,双击 Instrument 1 online图标, 化学工作站自动与1100LC通讯,进入的工作站画面。 4、从“View”菜单中选择“ Method and run control”画面, 单击”view”菜单中的“ Show Top Toolbar”,“ Show status toolbar”, “ System diagram”,” Sampling diagram”,使其命令前有“√”标 志,来调用所需的界面。 5、把流动相放入溶剂瓶中。 6、打开 Purge阀。 7、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击 Setup pump选项, 进入泵编辑画面。 8、设Flow:5ml/min,单击OK。 9、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击 Pump control选 项,选中On,单击OK,则系统开始 Purge,直到管线内(由溶剂瓶到 泵入口)无气泡为止,切换通道继续 Purge,直到所有要用通道无气泡 为止 10、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击 Pump Control 选项,选中Off,单击0k关泵,关闭 Purge valve
2 Agilent1100 高压液相色谱仪基本操作步骤 Agilent1100 液相基本操作 步骤 (一)、开机： 1、打开计算机,进入 Windows NT （或 Windows 2000）画面, 并运行 Bootp Server 程序。 2、打开 1100 LC 各模块电源。 3、待各模块自检完成后，双击 Instrument 1 Online 图标， 化学工作站自动与 1100LC 通讯，进入的工作站画面。 4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”， “System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标 志，来调用所需的界面。 5、把流动相放入溶剂瓶中。 6、打开 Purge 阀。 7、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Setup pump 选项， 进入泵编辑画面。 8 、设 Flow：5ml/min，单击 OK。 9、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Pump control 选 项，选中 On，单击 OK，则系统开始 Purge，直到管线内（由溶剂瓶到 泵入口）无气泡为止,切换通道继续 Purge，直到所有要用通道无气泡 为止。 10、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Pump Control 选项，选中 Off，单击 Ok 关泵， 关闭 Purge valve
11、单击Pum图标,出现参数设定菜单,单击 Setup pump选项, 进入Pump编辑画面,设Flow:1.0ml/min 12、单击泵下面的瓶图标,输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可 输入停泵的体积。单击Ok (二)数据采集方法编辑: 开始编辑完整方法 ●从“ Method”菜单中选择“ Edit entire method”项, 如上图所示选中除“ Data analysis”外的三项,单击Ok,进入下 一画面。 2、方法信息: ●在“ Method comments”中加入方法的信息(如:方法的 用途等)。 ●单击0k进入下一画面 3、泵参数设定:(以二元泵为例) ●在“Flow”处输入流量,如1ml/min,在“ Solvent b” 处输入70.0,(A=100-B),也可 Insert一行” Timetable”,编辑梯度。 在“ Pressure limits max”处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。 ●单击Ok进入下一画面 4、自动进样器参数设定 ●选择合适的进样方式,进样体积1.0u1,洗瓶位置为6 号。“ Standard Injection”一—只能输入进样体积,此方式无洗针 功能。“ Injection with Needle Wash”-—可以输入进样体积和洗
3 11、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Setup pump 选项， 进入 Pump 编辑画面，设 Flow：1.0ml/min。 12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可 输入停泵的体积。单击 Ok。 （二）数据采集方法编辑： 1、开始编辑完整方法： ●从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项， 如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项，单击 Ok，进入下 一画面。 2、方法信息： ●在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的 用途等）。 ●单击 Ok 进入下一画面。 3、泵参数设定：（以二元泵为例） ●在“Flow”处输入流量,如 1ml/min，在“Solvent B” 处输入 70.0,(A=100-B) ,也可 Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。 在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 ● 单击 Ok 进入下一画面。 4、自动进样器参数设定: ●选择合适的进样方式, 进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为 6 号。“Standard Injection”----只能输入进样体积，此方式无洗针 功能。“Injection with Needle Wash”----可以输入进样体积和洗
瓶位置,此方式针从样品瓶抽完样品后,会在洗瓶中洗针。“Use inJector program”-—-可以点击Edit键进行进样程序编辑 ●点击0k进入下一画面 5、柱温箱参数设定: ●在” Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中 它,点击”more>”键,如图所示,选中” Same as left”-—使柱温箱 的温度左右一致。 ●点击ok进入下一画面。 6、VwWD检测器参数设定 ●在” Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长, 如254nm,在” Peak width( Response time)”下方点击下拉式三 角框,选择合适的响应时间,如>0.1min(2s)。 ●在 Timetable中可以“ Insert”一行,输入随时间 切换的波长,如1min,波长=300nm。点击ok进入下一画面。 7、DAD检测器参数设定 ●检测波长:254nm,BW=30nm, 参比波长 =350nm,BW=100nm; ●检测波长:一般选择最大吸收处的波长。样品带宽 BW:一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长:一般选择在 靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW:至少要与样品信 号的带宽相等,许多情况下用100nm作为缺省值。 Peak width( Response time):其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit一狭缝窄,光谱分辨
4 瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injector program”---可以点击 Edit 键进行进样程序编辑。 ●点击 Ok 进入下一画面。 5、柱温箱参数设定: ●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中 它,点击”more>>” 键,如图所示,选中”Same as left”---使柱温箱 的温度左右一致。 ●点击 ok 进入下一画面。 6、VWD 检测器参数设定: ●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长, 如 254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式三 角框,选择合适的响应时间, 如>0.1min (2s)。 ●在 Timetable 中可以“Insert”一行，输入随时间 切换的波长，如 1min ，波长=300nm。点击 ok 进入下一画面。 7、DAD 检测器参数设定: ●检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长 =350nm,BW=100nm; ●检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽 BW： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在 靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽 BW：至少要与样品信 号的带宽相等，许多情况下用 100nm 作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit—狭缝窄，光谱分辨
率高;宽时,噪音低。同时可以输入采集光谱方式,步长,范围,阈 值。选中所用的灯 点击0k进入下一画面。 8、RID检测器参数设定 ●色谱条件 进样体积:20ul 光学单元温 度:Off。 极性:正。 峰宽(响应时 间) 4 ●“0 ptical Unit Temperature”-—若环境温度控制 在±2℃,设定为Off,若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为 高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。“ Peak width”-大多数 分析设为4S,只有在高速分析下设为更短。“ Automatic recycling after analysis”--在不进行分析时可以让流动相循环,节省流动相, 检测器连续运行,可随时投入使用。 ●点击RID图标,选择 RId Control: Heater设为 On,若要循环流动相,必须将“ Recycling valve”设为ON。手动 purge 参比池,将其设为On,并输入 Purge时间。 9、FLD检测器参数设定: 色谱条件: 样品:P/N01018-68704用甲醇稀释为 1:10。 进样体积:5u1
5 率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈 值。选中所用的灯。 ●点击 Ok 进入下一画面。 8、RID 检测器参数设定: ●色谱条件: 进样体积: 20ul 。 光学单元温 度: Off 。 极性: 正 。 峰宽(响应时 间) : 4s 。 ●“Optical Unit Temperature”---若环境温度控制 在±2℃,设定为 Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为 高于环境温度 5 度,以防样品在池中沉淀。“Peak width”---大多数 分析设为 4S，只有在高速分析下设为更短。“Automatic recycling after analysis”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相， 检测器连续运行，可随时投入使用。 ●点击 RID 图标，选择 RID Control ：Heater 设为 On，若要循环流动相，必须将“Recycling Valve”设为 ON。手动 purge 参比池，将其设为 On，并输入 Purge 时间。 9、FLD 检测器参数设定: 色谱条件： ● 样品：P/N 01018-68704 用甲醇稀释为 1:10。 ● 进样体积：5ul
柱温箱:30℃。 EX=246nm EM=317nm,PMT=10。 响应时间=4s. 停止时间:出峰 完毕。 Excitation a:激发波长:200-700nm,步 长为1nm,或 Zero order Emission:发射波长:280-900nm,步 长为1nm,或 Zero order PMT:大多数应用适当的设定值为10,若 高浓度样品峰被切平头,则减少PMT值 ●“ Peak width”:大多数应用设为4s,只有 快速分析采用小的设定值。 Multi ex:多波长及光谱(激发)。 Multi em:多波长及光谱(发射) 同时可以输入范围 Range、步长step、采 集光谱。 10、在“ Run time checklist”中选中“Data acquisition”,单击Ok 11、单击“ Method”菜单,选中“ Save me thod as”,输 入一方法名,如“test”,单击Ok。 12、从菜单“View”中选中” Online signal”,选中 Windows1,然后单击 Change钮,将所要绘图的信号移到右边的框中, 点击Ok.(如同时检测二个信号,则重复12,选中 Windows2)
6 ● 柱温箱: 30℃ 。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 ● 响应时间=4s. 停止时间： 出峰 完毕。 ● Excitation A: 激发波长:200-700nm,步 长为 1nm,或 Zero Order。 ● Emission: 发射波长: 280-900nm, 步 长为 1nm,或 Zero Order。 ● PMT: 大多数应用适当的设定值为 10,若 高浓度样品峰被切平头,则减少 PMT 值。 ● “Peak width”：大多数应用设为 4s，只有 快速分析采用小的设定值。 ● Multi Ex ： 多波长及光谱（激发）。 ● Multi Em：多波长及光谱（发射）。 ● 同时可以输入范围 Range、步长 step、采 集光谱。 10、在“ Run time checklist ”中选中“Data acquisition”，单击 Ok。 11、单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输 入一方法名，如“test”，单击 Ok。 12、从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中 Windows 1,然后单击 Change 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中, 点击 Ok.(如同时检测二个信号,则重复 12,选中 Windows 2)
13、从“ Run control”菜单中选择“ Sample info” 选项,如上图所示,输入操作者名称,在“ Data file”中选择“ Manual” 或“ Prefix 区别: Manua1-每次做样之前必须给出新名字,否则仪 器会将上次的数据覆盖。 Prefix一在 Prefix框中输入前缀,在 Counter框中输入计数器的起始位,仪器会自动命名,如vwd0001, vwd0002………。 14、从 Instrument菜单选择 System on。 15、等仪器 Ready,基线平稳,从 Method菜单中选择“Run method”,进样。 (三)、数据分析方法编辑: 1、从“View”菜单中,单击“ Data analysis”进入数据分析 画面。 2、从“File”菜单选择“ Load signal”,选中您的数据文件 名,如下图所示。单击Ok。 3、做谱图优化,从“ Graphics”菜单中选择“ Signal options” 选项,。从 Ranges中选择 Auto scale及合适的显示时间,单击ok, 或选择” Use ranges”调整。反复进行,直到图的比例合适为止 4、积分 (1)、从“ Integration”中选择“ Auto integrate”, 如积分结果不理想,再从菜单中选择“ Integration Events”选项
7 13、从“Run control ”菜单中选择“Sample info” 选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual” 或“Prefix”。 区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪 器会将上次的数据覆盖。Prefix—在 Prefix 框中输入前缀，在 Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如 vwd0001， vwd0002……。 14、从 Instrument 菜单选择 System on。 15、等仪器 Ready，基线平稳，从 Method 菜单中选择“Run method”，进样。 （三）、数据分析方法编辑: 1、从“View”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析 画面。 2、从“File”菜单选择“Load signal”，选中您的数据文件 名，如下图所示。单击 Ok。 3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signal options” 选项，。从 Ranges 中选择 Auto scale 及合适的显示时间，单击 ok, 或选择”Use Ranges” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。 4、积分: (1)、从“Integration”中选择 “Auto integrate”, 如积分结果不理想,再从菜单中选择“Integration Events”选项
选择合适的 Slope sensitivity, Peak width, Area reject, Height reject。 2)、从“ Integration”菜单中选择“ Integrate”选项, 则数据被积分 (3)、如积分结果不理想,则修改相应的积分参数,直到 满意为止 (4)、单击左边“√”图标,将积分参数存入方法 5、打印报告 (1)、从“ Report”菜单中选择“ Specify report”选项, 进入如上画面。 (2)、单击“ Quantitative Results”框中 Calculate 右侧的黑三角,选中 Percent(面积百分比),其它选项不变 (3)、单击Ok (4)、从“ Report”菜单中选择“ Print report”,则报 告结果将打印到屏幕上,如想输出到打印机上,则单击 Report底部 的“ Print”钮 (四)、关机: ●关机前,用100%的水冲洗系统20分钟,然后用有 机溶剂冲洗系统10分钟(如ACN),然后关泵,(适于反相色谱柱)。 [正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]
8 选择合适的 Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。 (2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项， 则数据被积分。 (3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到 满意为止。 (4)、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。 5、打印报告: (1)、从“Report”菜单中选择“Specify report”选项， 进入如上画面。 (2)、单击“Quantitative Results”框中 Calculate 右侧的黑三角，选中 Percent（面积百分比），其它选项不变。 (3)、单击 Ok. (4)、从“Report”菜单中选择“Print report”，则报 告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击 Report 底部 的“Print”钮。 (四)、关机: ● 关机前，用 100%的水冲洗系统 20 分钟，然后用有 机溶剂冲洗系统 10 分钟（如 ACN），然后关泵，（适于反相色谱柱）。 [正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]
●退出化学工作站,及其它窗口,关闭计算机(用shut down关 关掉 Agilent1100电源开关。 Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项 1、色谱柱长时间不用,存放时,柱内应充满溶剂,两端封死(如ACN 适于反相色谱柱,正相色谱柱用相应的有机相) 2、对于手动进样器,当使用缓冲溶液时,要用水冲洗进样口,同时搬 动进样阀数次,每次数毫升。 3、流动相使用前必须过滤,不要使用多日存放的蒸馏水(易长菌)。 4、带seal-wash的1100,要配制90%水+10%异丙醇,以每分2—3滴 的速度虹吸排出,溶剂不能干涸。 5、其它主意事项见说明书,或由现场工程师介绍。 维护知识问答 、为什么溶剂和样品要过滤? 溶剂和样品过滤非常重要,它会对色谱柱、仪器起到保护作用, 消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱:由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和样品中的细小 颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞 仪器:溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损,同时也 会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 样品过滤头的类型
9 ● 退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用 shut down 关）。 关掉 Agilent 1100 电源开关。 Agilent1100 高压液相色谱仪维护保养知识保养事项： 1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如 ACN 适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相） 2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬 动进样阀数次，每次数毫升。 3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。 4、带 seal-wash 的 1100，要配制 90%水+10%异丙醇，以每分 2—3 滴 的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。 5、其它主意事项见说明书，或由现场工程师介绍。 维护知识问答 1、为什么溶剂和样品要过滤? 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用， 消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小 颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也 会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 样品过滤头的类型：
30mm内径:适用于大进样量的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格, 材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。 13mm内径:适用于范围广的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格,材 料为纤维素。 3m内径:适用于小进样量的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格 处理样品体积为7μ1。 滤膜类型: 聚四氟乙烯滤膜:适用于所有溶剂,酸和盐,并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜:不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶液,推荐用于 蛋白质和其相关样品 尼龙66滤膜:适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可用于强酸,70% 乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜:具有蛋白吸收低,同样适用水溶性样品和有机溶剂 2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项? HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现 象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杄上,随着蓝宝石 活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现 象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲 盐的浓度在0.lmol或大于0.lmol时,必须使用该在线冲洗选项 清洗液配制:90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长 和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下,不能干涸。 3、为什么 Agilent110oLC的流动相管路非常细?
10 30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由 0.2μm 和 0.45μm 两种规格, 材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于 50μl。 13mm 内径：适用于范围广的过滤，由 0.2μm 和 0.45μm 两种规格,材 料为纤维素。 3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由 0.2μm 和 0.45μm 两种规格。 处理样品体积为 7μl。 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于 蛋白质和其相关样品。 尼龙 66 滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70% 乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。 2、为什么 HPLC 用缓冲盐时要加在线 Seal-wash 选项？ HPLC 用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现 象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石 活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现 象。在线 Seal-wash 选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲 盐的浓度在 0.1mol 或大于 0.1mol 时,必须使用该在线冲洗选项. 清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长 和减小水的表面张力。以 2-3 滴/min 的速度虹吸流下，不能干涸。 3、为什么 Agilent 1100LC 的流动相管路非常细?