实验二:检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质 、实验目的: 尝试用化学试剂检测生物组织中糖类、脂肪和蛋白质,阐明实验原理一颜色反应,识记和 区分用于可溶性还原糖、脂肪、蛋白质鉴定的试剂及产生的特定颜色,初步掌握鉴定上述 化合物的基本方法,学会描述实验现象,掌握NaOH溶液和CuS04溶液的使用方法 二、实验原理: 某些化学试剂能使生物组织中的有关有机化合物,产生特定的颜色反应。 1、生物组织中普適存在的可溶性糖类较多,有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖。前三种糖的 分子内都含有游离的具还原性的半缩醛羟基,因此叫做还原糖:蔗糖分子内没有,为非 还原糖。实验中所用的斐林试剂,只能鉴定生物组织中可溶性还原糖,而不能鉴定可溶 性非还原糖。 可溶性还原糖(如葡萄糖、果糖、麦芽糖)与斐林试剂发生作用,可生成砖红色的Cu 20沉淀。如: 葡萄糖+2C2+40H加热葡萄糖酸+Cu20↓(砖红色)+H20 即Cu2被还原成Cu:0,葡萄糖被氧化成葡萄糖酸 用斐林试剂鉴定还原糖时,溶液变化过程为:浅蓝色→棕色→砖红色沉淀 定粉遇碘变蓝色(直链)或紫(红)色(支链) 2、脂肪和类脂(磷脂、糖脂、固醇脂等)统称为脂类。它是构成人体组织的正常成分,不 溶于水而易溶于酒精、乙醚、氯仿等脂溶剂中。在化学组成上,脂类属于脂肪酸的酯或 与这些酯有关的物质。脂类的主要功能是氧化供能。 脂肪主要存积于脂肪组织中,并以油滴状的粒存在脂肪细胞浆内 在病理检验中,脂类染色法最常用以证明脂肪变性,脂肪栓子以及肿瘤的鉴别。脂类 染色使用最广泛的染料是苏丹染料,最常用的有苏丹Ⅲ,苏丹Ⅳ,苏丹黑及油红0等 脂肪被染色,实际上是苏丹染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。经研究认为组织 中脂质在液态或半液态时,对苏丹染料着色效果最好。根据这一原理,适当提高温度 (37℃-60℃)对组织切片染色效果是有好处的 脂类染色,用冰冻或石蜡切片,以水溶性封固剂封固,如甘油、明胶和阿拉伯糖胶 脂肪可以被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色或橙红色(或被苏丹Ⅳ染液染成红色),胆脂素呈 淡红色,脂肪酸不着色,细胞核呈蓝色 3、蛋白质与双缩脲试剂发生作用,产生紫色反应。(蛋白质分子中含有很多肽键,在碱 性NaOH溶液中能与双缩脲试剂中的Cu2作用,产生紫色反应。) NH? NH l80℃ H NH 加热 NH NH 双缩脲
H O C=O R-CH CH-R C=O NH R-CH H-R H O 紫色络合物 三、实验材料: 1、做可溶性还原性糖鉴定实验,应选含糖高,颜色为白色的植物组织,如苹果、梨。(因 为组织的颜色较浅,易于观察。)经试验比较,颜色反应的明显程度依次为苹果、梨 白色甘蓝叶、白萝卜 2、做脂肪的鉴定实验。应选富含脂肪的种子,以花生种子为最好,实验前一般要浸泡3~4 小时(也可用蓖麻种子)。 3、做蛋白质的鉴定实验,可用富含蛋白质的黄豆或鸡蛋清 4、淀粉的鉴定:马铃薯匀浆 四、实验用具:双面刀片、试管(最好用刻度试管)、试管夹、试管架、大小烧杯、小 量筒、滴管、酒精灯、三脚架、石棉网、火柴、载玻片、盖玻片、毛笔、吸水纸、显微镜 五、实验试剂: 1.斐林试剂(包括甲液:质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和乙液:质量浓度为0.05g/mL CuS04溶液) 2.苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液 3.双缩脲试剂(包括A液:质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和B液:质量浓度为0.01g Cus04溶液) 4.体积分数为50%的酒精溶液 5.碘液 6.蒸馏水 六、方法步骤: J溶性糖的鉴定 苹果或梨组织液必须临时制 因苹果多酚氧化酶含量 去皮、切块、研磨、过 高,组织液很易被氧化成 滤) 褐色,将产生的颜色掩 取1支试管,向试管内注 内注入1mL新利的应将组成斐林试剂的甲液 斐林试剂很不稳为 斐林试剂,振荡 液分别配制、储存,使用前才乙液混合保存时,生成 将甲、乙液等量混匀成斐林试|的Cu(OH)在70°90° 剂; 下分解成黑色Cu0和水;
甲、乙液分别加入时可能 切勿将甲液、乙液分别加入苹会与组织样液发生反应, 果组织样液 4.试管放在盛有50-65C温最好用试管夹夹住试管上部 管内的溶液冲出试 水的大烧杯中,加热约 使试管底部不触及烧杯底部,管,造成烫伤 冲,观察到溶液颜色:浅蓝试管口不朝向实验者 色→棕色→砖红色(沉也可用酒精灯对试管直接加 缩短实验时间 脂肪的鉴 种子浸泡 切下一些干种 因为浸泡时 不易切片 子叶薄片,将薄片放在载玻片的时,新花生的漫泡时浸泡时间过长,组织较软 水滴中,用吸水纸吸去装片中的间可缩短 片不易成形。切片要尽可能薄 些,便于观察 在子叶薄片上滴23滴苏丹Ⅲ或苏染色时间不宜过长。 用吸水张吸片周国染液 酒精用于洗去浮色,不洗去浮 用50%酒精洗去浮色,吸去酒精。 黄 观察。同时,酒精是脂溶性溶 剂,可将花生细胞中的脂肪颗 溶解成油滴 用吸水纸吸去薄片周围酒精,润 上清水可防止盖盖玻片时产 12滴蒸馏水,盖上盖玻片 生气泡 低倍镜下找到 叶薄片的最装片不宜久放 时间一长,油滴会溶解在乙醇 薄处,可看到细胞中有染成橘黄 色或红色圆形小颗老 三、蛋白质的鉴定 黄豆浸泡1至2天,容易研磨 (浸泡、去皮研磨、过 成浆,也可购新鲜豆浆以节 加样液约2m1于试管A液和B液也要分开配制,储 加入双缩脲试剂A,摇存。鉴定时先加A液后加B白质反应提 性的环 匀:再加入双缩脲试剂B 境。A、B液混装或同时加 液3~4滴,摇匀,溶液变紫 入,会导致Cu变成Cu(OH CusO4溶液不能多加 2沉淀,而失效 否则CuS04的蓝色会遮盖反应 可用蛋清代替豆浆。 蛋清要先稀科 不够,在实验中蛋 清粘在试管壁,与双缩尿试 剂反应后会粘固在试管内壁 上,使反应不容易彻底,并 附:淀粉的检测和观察 碘液不要滴太多 以免影响金色观素 用试管取2m1待測组织样液, 向试管内滴加2滴碘液,观察 1、常见还原性糖与非还原性糖有哪些?答:葡萄糖、果糖、麦芽糖都是还原性糖;淀 粉、蔗糖、纤维素都是非还原性糖 2、还原性糖植物组织取材条件?答:含糖量较高、颜色为白色或近于白色,如:苹果、 梨、白色甘蓝叶、白萝卜等。 3、研磨中为何要加石英砂?不加石英砂对实验有何影响?答:加石英砂是为了使研磨更 充分。不加石英砂会使组织样液中还原性糖减少,使鉴定时溶液颜色变化不明显
4、斐林试剂甲、乙两液的使用方法?混合的目的?为何要现混现用?答:混合后使用; 产生氢氧化铜:氢氧化铜不稳定 5、还原性糖中加入斐林试剂后,溶液颜色变化的顺序为?答:浅蓝色棕色砖红色 6、花生种子切片为何要薄?答:只有很薄的切片,才能透光,而用于显微镜的观察 7、转动细准焦螺旋时,若花生切片的细胞总有一部分清晰,另一部分模糊,其原因一般是 什么?答:切片的厚薄不均匀 8、脂肪鉴定中乙醇作用?答:洗去浮色 9、双缩脲试剂A、B两液是否混合后用?先加A液的目的怎样通过对比看颜色变化?答:不 能混合;先加A液的目的是使溶液呈碱性:先留出一些大豆组织样液做对比 实验三:观察DNA和RNA在细胞中的分布 实验原理: 1、真核细胞的DNA主要分布在细胞核内,RNA主要分布在细胞质中 2、甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同,甲基绿对DNA亲和力强,使DNA显 现出绿色,而吡罗红对RNA的亲和力强,使RNA呈现出红色。用甲基绿、吡罗红的混合染色 剂将细胞染色,可同时显示DNA和RNA在细胞中的分布 3、盐酸的作用 ①盐酸能改变细胞膜的通透性,加速染色剂的跨膜运输 ②盐酸使染色体中的DNA与蛋白质分离,便于DNA与染色剂的结合 实验材料:人的口腔上皮细胞、洋葱鳞片叶表皮细胞 实验用具:大小烧杯、温度计、滴管、消毒牙签、载玻片、盖玻片、铁架台 石棉网、火柴、酒精灯、吸水纸、显黴镜 四、方法步骤: 1、取材* ①滴:在洁净的载玻片上滴一滴质量分数为0.9%的NaC1溶液; ②刮:用消毒牙签在口腔内侧壁上轻轻地刮几下;幸 ③涂:将牙签上的碎屑涂抹在载玻片的生理盐水中;* ④烘:将涂有口腔上皮细胞的载玻片在酒精灯的火焰上烘干。* 2、水解 ①解:将烘干的载玻片放入装有30m1质量分数为8%的盐酸的小烧杯中,进行材料的水解 ②保:将小烧杯放入装有30℃温水的大烧杯中保温5分钟。 3、冲洗涂片 ①冲:用缓缓的蒸馏水冲洗载玻片10秒钟 ②吸:用吸水纸吸去载玻片上的水分 4、染色* ①染:用2滴吡罗红甲基绿混合染色剂滴在载玻片上,染色5分钟 ②吸:吸去多余染色剂 ③盖:盖上盖玻片 5、观察* ①低:在低倍物镜下,寻找染色均匀,色泽浅的区域,移至视野中央,将物像调节清晰; ②高:转到高倍物镜,调节细准焦螺旋,观察细胞核和细胞质的染色情况。 五、考点提示: 1、取口腔上皮细胞之前,应先漱口,以避免装片中出现太多的杂质 2、取洋葱表皮细胞时,尽量避免材料上带有叶肉组织细胞; 3、冲洗载玻片时水的流速要尽量慢,切忌直接用水龙头冲洗 4、用酒精灯烘烤载玻片时,不要只集中于材料处,而应将载玻片在火焰上来回移动,使 载玻片均匀受热,以免破裂 5、烘烤后的载玻片不要马上放入盛有稀盐酸的烧杯中,最好先自然冷却1分钟
实验五:用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体 、实验原理: 1、叶肉细胞中的叶绿体,呈绿色、扁平的椭球形或球形,散布于细胞质中,可以在高倍显 微镜下观察它的形态。 2、线粒体普遍存在于动物细胞和植物细胞中,健那绿染液能使活细胞中的线粒体呈现蓝绿 色。通过染色,可以在高倍显微镜下观察到处于生活状态的线粒体的形态有短棒状、圆球 状、线形、哑铃形等。 二、实验材料:新鲜的藓类的叶、人的口腔上皮细胞、新配制的质量分数为1%的健那 液(将0.5g健那绿溶解于50mL生理盐水中,加温到30-40摄氏度,使其充分溶解) 三、实验用具:显徽镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、消毒牙签 四、方法步骤: 1、观察叶绿体 低倍镜下找到叶片细胞→低倍镜下找到叶片细胞→高倍镜下观察 2、观察线粒体 染色→制片→低倍镜下找到口腔上皮细胞→高倍镜下观察 五、考点提示: 1、观察叶绿体时选择藓类叶的原因:藓类属于低等植物,叶片是绿色的单层细胞,不需加 工即可进行观察。 2、临时装片中的材料要随时保持有水状态的原因:保证细胞器的正常形态并能悬浮在细胞 质基质中,否则,细胞失水收缩,将影响细胞器形态的观察。 实验十一:观察根尖分生组织细胞的有丝分裂 、实验目的: 1、制作洋葱根尖细胞有丝分裂装片。 2、观察植物细胞有丝分裂的过程,识别有丝分裂的不同时期,比较细胞周期不同时期的时 间长短 3、绘制植物细胞有丝分裂简图 二、实验原理: 1、高等植物的分生组织有丝分裂较旺盛 2、有丝分裂各个时期细胞内染色体的形态和行为变化不同,可用高倍显徽镜根据各个时期 3、细胞核内的染色体易被碱性染料(如龙胆紫)染成深色 三、实验材料:洋葱(可用葱.蒜代替),质量分数为15%的盐酸,体积分数为95%的酒 精,质量浓度为0.01g/m1或0.02g/m1的龙胆紫溶液(将龙胆紫溶解在质量分数2%的醋酸溶 液中配制而成)或醋酸洋红液,洋葱根尖细胞有丝分裂固定装片 四、实验用具:显徽镜,载玻片,盖玻片,玻璃皿,剪子,镊子,滴管 五、方法步骤: 1、洋葱根尖的培养在上实验课之前的3-4天,取洋葱一个,放在广口瓶上。瓶内装满清 水,让洋葱的底部接触到瓶内的水面。把这个装置放在温暖的地方培养。待根长约5cm,取 生长健壮的根尖制成临时装片观察。 2、装片的制作
制作流程为:解离一漂洗一染色一制片 方法 时目的 上午10时至下午2时,剪去洋葱根尖2-3mm,立|3-5min用药液使组织中的细胞 解离即放入盛入有盐酸和酒精混合液(1:1)的玻 相互分离开来 璃皿中,在温室下解离 漂洗待根尖酥软后,用镊子取出,放入盛入清水的 洗去药液,防止解离过 玻璃皿中漂洗 约10mi度 染色把根尖放进盛有质量浓度为0.01g/ml 3-5min染料能使染色体着色。 或0.02g/m1的龙胆紫溶液(或醋酸洋红液)的 用镊子将这段根尖取出来,放在载玻片上,加 使细胞分散开来,有利 制片一滴清水,并用镊子尖把根尖能碎,盖上盖玻 于观察 片,在盖玻片上再加一片载玻片。然后,用拇 指轻轻的按压载玻片 3、观察 a低倍镜观察:找到分生区细胞,其特点是细胞呈正方形,排列紧密,有的细胞正在分裂 b高倍镜观察:在低倍镜观察的基础上换高倍镜,直到看清细胞的物象为止 c仔细观察:先到中期,再找其余各期,注意染色体的特点 d移动观察:慢慢移动装片,完整地观察各个时期(如果自制装片效果不太理想,可以观察 洋葱根尖固定装片) 4、绘图 5、记录 六、实验结论: 前期:①出现染色体②核膜核仁消失③纺锤丝出现 中期:①着丝粒位于赤道面②纺锤体明显 未期 染色体分裂成两组子染色体向相反两极运动 ①纺锤体出现②核膜核仁出现
