第六章基因分析的基本策略 从上世纪70年代以来，与DNA、RNA操作相关的各 种分子生物学技术不断发展，到目前已经形成了一个 庞大而复杂的技术体系。基因操作已成为医学研究的 重要手段。简单地说，基因操作就是所有涉及到DNA、 RNA操作的技术。 本章主要讨论如何对基因进行定性、定量分析；在随 后的2章里分别介绍基因功能研究的技术和基因工程的 有关内容
从上世纪70年代以来，与DNA、RNA操作相关的各 种分子生物学技术不断发展，到目前已经形成了一个 庞大而复杂的技术体系。基因操作已成为医学研究的 重要手段。简单地说，基因操作就是所有涉及到DNA、 RNA操作的技术。 本章主要讨论如何对基因进行定性、定量分析；在随 后的2章里分别介绍基因功能研究的技术和基因工程的 有关内容。 第六章 基因分析的基本策略
对一个已知或未知基因的内容进行研究步骤： 1、需要进行基因的DNA序列分析：序列测定 2、基因的染色体上定位：原位杂交技术 3、研究基因在基因组中的拷贝数：Southern Blot 4、研究基因表达水平：Northern Blot、.逆转录 实时PCR技术 5、研究基因表达产物的水平：Vestern Blot、 流式细胞仪（FACS)
1、需要进行基因的DNA序列分析:序列测定 2、基因的染色体上定位：原位杂交技术 3、研究基因在基因组中的拷贝数：Southern Blot 4、研究基因表达水平：Northern Blot、逆转录 实时PCR技术 5、研究基因表达产物的水平：Western Blot、 流式细胞仪（ FACS ） 对一个已知或未知基因的内容进行研究步骤：
第一节利用DNA定性、定量分析可从不同角度 对基因和基因组进行研究 DNA序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化 DNA测序技术： 1、双脱氧链终止法(Sanger法) 2、化学裂解法 3、PCR测序技术 4、全自动DNA测序仪 这些技术的发明，都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术
第一节 利用DNA定性、定量分析可从不同角度 对基因和基因组进行研究 一、DNA序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化 DNA测序技术： 1、双脱氧链终止法(Sanger法) 2、化学裂解法 3、PCR测序技术 4、全自动DNA测序仪 这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术
双脱氧测序方法原理 Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸 (2·,3-ddNTP)作为链终止剂。2·，3·-ddNTP脱氧 核糖的3·位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3·羟基 形成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致 多核苷酸链的延伸终止。 如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP,则多 核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短 不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加 入4种不同的ddNTP,结果生成的4组核苷酸链将分别终止 于各个A,G,C,T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分 辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列
Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸 （2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧 核糖的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基 形成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致 多核苷酸链的延伸终止。 如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多 核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短 不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加 入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止 于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分 辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。 双脱氧测序方法原理
p dATP dGTP 5 OH OHOH 引物链 000 A T G C G 0-P-0-P-0-p-0-CH40 碱基 0 0 0 3 A C GG C TACT H H H H 模板链 HH oo0eoOeOo 双脱氧核苷三磷酸类似物 (a) (b) 引物 5 OH 3 CTAAGCTCGACT 模板
引物 5 OH 3 CTAAGCTCGACT 模板 dCTP.dGTP.dATP.dTTP ddATP ddCTP +ddGTP ddTTP GATTCGAGCTGddA GATTCGAGadc GATTCGAGCTddG GATTCGAGCddT GATTCGddA GATTddC GATTCGAddG GATddT GddA GATTCddG GAddT ddG G T 210987654321 m4H UU 40 U HH 4 O 电泳凝胶的放射自显影图 互补链顺序 (c)
化学裂解法(Maxam-Gilbert) 1977 基本步骤： 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素(32P、35S), 2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、 不完全的化学修饰； 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断 开DNA链； 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺 凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况， 直接读出DNA序列
◼ 基本步骤： 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、 35S）， 2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、 不完全的化学修饰； 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断 开DNA链； 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺 凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况， 直接读出DNA序列。 化学裂解法（Maxam-Gilbert） 1977
反应体系 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点 试剂 反应 试剂 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 c/T C 肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C 在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有 一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量
反应体系 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点 试剂 反应 试剂 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C/T C 肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C 在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有 一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量
5-GATCACTACTG-3 硫酸二甲酯 5'*-GATCACTACTG-3 G G+A 甲酸 C+T 肼 C肼 (加盐) 5 *GATCACTACT 5 *GATCACTACTG 5*GATCACTAC 5*GATCACTACTG 5*GATCACTA 5 *GATCACTAC 5 *GATCACT 5*G 5*GATCA 5 *GATCAC 5*GATCAC 5 *GA 5*GATC 5*GATC 5*G 5*GAT 5'*GATCACTACTG 5 *GATCACTACT 5*GATCACTAC 5*GATCACTA 5*GATCACT 5*GATCAC 5*GATCA 5*GATC 5*GAT 5*GA 5*G G A/G
5`-GATCACTACTG-3` 5`*-GATCACTACTG-3` 5`*G 5`* GATCACTACTG 5`*G 5`*GA 5`*GATCA 5`*GATCACTA 5`*GATCACTACTG 5`*GAT 5`*GATC 5`*GATCAC 5`*GATCACT 5`*GATCACTAC 5`*GATCACTACT 5`*GATC 5`*GATCAC 5`*GATCACTAC G G+A C+T C G A/G C/T C 5`*G 5`*GA 5`*GAT 5`*GATC 5`*GATCAC 5`*GATCACTAC 5`*GATCA 5`*GATCACT 5`*GATCACTA 5`*GATCACTAC 5`*GATCACTACT 5`* GATCACTACTG 硫酸二甲酯 甲酸 肼 肼（加盐）
DNA自动测序仪 上述两种方法都不适应大规模DNA测定需要。存在操作 步骠繁琐、效率低、速度慢的缺点，特别是读结果的读 片过程。 1987年发明了一种准确快速的DNA测序方法，即激光测 序法和配套的自动测序仪。（用荧光染料结合引物）。 随后又发明了终止标记系统法
DNA自动测序仪 上述两种方法都不适应大规模DNA测定需要。存在操作 步骤繁琐、效率低、速度慢的缺点，特别是读结果的读 片过程。 1987年发明了一种准确快速的DNA测序方法，即激光测 序法和配套的自动测序仪。（用荧光染料结合引物）。 随后又发明了终止标记系统法