·498· 压口2形2四5年，H2L&月11md里s21 口腔黏膜病· 致病性口腔白色念珠菌耐药株和药物敏感株 的ITS基因型比较 质曾同·，赵民 (上海第二医科大学对属第九.人民医院口腔内科上海200011) [钩要】日的：探时致刺件口腔之殊能1TT2区城进化中变异的序列是否与拔受放化疗刚关，是否与卤 杭对抗真能阿物的嫩感性州关。方法牧巢丙讯头漂留种嗜饮化行步者合并念床角感奥组和单地山慰念珠南感 臭)性宋满棕，依都NCL5的M2下2标准方案测定两讯两抹对四种抗真两药物的最荆俩浓度：浸取萧林的 D州A,气CR扩增1TS-1T2风域，出较丙讯1TS11TS2序列的之异井比轻药物最域株和酯药林该区域核苷数碱杯 序列的产异，抽果：个部满株对子氧家座府轻多，21%时两性莲素县最嘴，饮化疗阻和单生白含城处对氯唐 型的药比侧分测为267%和87%对伊曲废壁约耐特比制分别为0%和13%：卤株T5T2序列的差异与 分阅和两物敏感卧无明显相关。结论发精性口腔之依角TT红区城进化中变异的序列与是否核受敏化了无 胡显相关，与伪株对抗直的特物的敏感性无明景柑关。 【关键可」山整白色念珠两，阿物娘艺性实检，1T5水因型 1中图分类号引R38 1文就标识码引A 1文章实号11003.1634200310s-048.05 Compris0国Isr知u水联s bet ween antutgal drug snsitive and aatiful山累esi由at ptbrgcuie oral C hicans isnbtes ZIOU Zengtong.ZHAO Mte Department of Oral Medsclo.The Niuth Affilteated Hapital gf Simgom Send Medieal Umitrrriy.Shanghw 200011. [Abstract (bjeelive To compire seqa es of ITSFITS2 regions of ocal C.isolated from two gmoups Thead and neck cancer potients le年v and Oeal Canid山xspd2ms;TD compare刘ence ch山s o ITsI-IT2 eaons of amifunaal drug solates and antifunal drug resistant rolates. Methed:The in vitns sphbilities of 38 eral 5-feyline(5-FC), ion of ITSI-ITS2 regors and 叫ercing analysis to ITS-ITS2 regons bes ates Rd:All air were oefo进end and chemotherpy.Coehins Seqence chages of ITS-ITS2 regions dring elution of pagere oralCallehde' olious oeration uith anifg sstibility ad radnthpy or chemotherpy [ry words]oral candd由，a减四I suscptibility te女ig:ITS genoty风 白色念珠南(Cd)属于条件致柄真菊。近年，的念珠南在致柄性和刚药性方而他存在整异。ITS区 来，以念珠南为代表的真菊感染呈明显上升他的。口 战是真荷鈿胞内DNA编码核糖体RNA(RNA)的内 念珠南远染与各种口控苹限病有关，而且与各种免 转录间深，非锅码区(intern过tranxribied pace女rre 疫缺陷害者的深部真两缓染密切相关同时备床怜出 onl。编玛rRNA基因是一个中连的重复单位。目 了大量的耐药南株。临床研究表男：不仅不同和念殊 前常按用米进行真南的鉴定，分平。本文采用NC 菌在改剂性和附药性方面存在差异而且同一和群内 CI.S (The National Committee for Clinicnl I.nboratory Srandards最新公布的M2下A2微量稀释法标准方案， ·越金项日：上到有卫生局4拉发展林金项日0440四5) 检测头颈部肿治放化疗遭者合并念珠菌感染姐、单纯 ··通讲T名周管可Erul :zhouenpore0l.0nT 口腔念球菌感染组的感染菌株对四种抗真笛药氟展 021-60s706 1995-2005 7rmgham Tovgfang Opticol Dasc Co.Lnd.AW ngius reserved
3 基金项目 :上海市卫生局科技发展基金项目(044005) 3 3 通讯作者 周曾同 Email :zhouzengtong @hotmail. com Tel : 021 - 63087076 ·口腔黏膜病· 致病性口腔白色念珠菌耐药株和药物敏感株 的 ITS 基因型比较3 周曾同 3 3 , 赵 民 (上海第二医科大学附属第九人民医院口腔内科 上海 200011) [摘要] 目的 :探讨致病性口腔念珠菌 ITS12ITS2 区域进化中变异的序列是否与接受放化疗相关 ,是否与菌 株对抗真菌药物的敏感性相关。方法 :收集两组(头颈部肿瘤放化疗患者合并念珠菌感染组和单纯口腔念珠菌感 染组) 临床菌株 ,依据 NCCL S的 M272A2 标准方案测定两组菌株对四种抗真菌药物的最低抑菌浓度 ;提取菌株的 DNA ,PCR 扩增 ITS12ITS2 区域 ,比较两组 ITS12ITS2 序列的差异并比较药物敏感株和耐药株该区域核苷酸碱基 序列的差异。结果 :全部菌株对 52氟胞嘧啶敏感 , 92. 1 %对两性霉素 B 敏感 ,放化疗组和单纯白念感染组对氟康 唑的耐药比例分别为 26. 7 %和 8. 7 % ,对伊曲康唑的耐药比例分别为 40 %和 13 % ;菌株 ITS12ITS2 序列的差异与 分组和药物敏感性无明显相关。结论 :致病性口腔念珠菌 ITS12ITS2 区域进化中变异的序列与是否接受放化疗无 明显相关 ,与菌株对抗真菌药物的敏感性无明显相关。 [关键词] 口腔白色念珠菌 ;药物敏感性实验 ; ITS 基因型 [中图分类号] R378 [文献标识码] A [文章编号] 1003 - 1634 (2005) 08 - 0498 - 05 Comparison of ITS genotypes between antifungal drug sensitive and antifungal drug resistant pathogenic oral C. al2 bicans isolates ZHOU Zeng2tong , ZHA O Min. Depart ment of Oral Medicine , The Ninth A f f ilicated Hospital of S hanghai Second Medical U niversity . S hanghai 200011 , China [Abstract ]Objective :To compare sequence changes of ITS12ITS2 regions of pathogenic oral C. albicans isolated from two groups (head and neck cancer patients treated with radiothrapy or chemotherapy and Oral Candidasis patients) ; To compare sequence changes of ITS12ITS2 regions of antifungal drug sensitive isolates and antifungal drug resistant isolates. Method :The in vitro susceptibilities of 38 oral C. albicans to amphoteritinB (AmB) , 52flucytosine (52FC) ,itraconazole (ICZ) and fluconazole were determined by NCCL S M272A2 method. Using PCR amplification of ITS12ITS2 regions and sequencing analysis to compare sequence changes of ITS12ITS2 regions of the two groups and explored sequence changes of ITS12ITS2 regions between antifungal drug sensitive isolates and antifungal drug resistant isolates. Result : All strains were sensitive to 52flucytosine ,92. 1 % stains were sensitive to amphoteritin B , 26. 7 % and 40 % stains isolated from head and neck cancer patients treated with radiothrapy or chemotherapy were resistant to fluconazole and itraconazole respectively , 8. 7 % and 13 % stains isolated from Oral Candidasis patients were resistant to fluconazole and itraconazole respectively ; sequence changes of ITS12ITS2 regions of stains hadn’t obvious correlation with antifugal susceptibility and radiothrapy or chemotherapy. Conclusion :Sequence changes of ITS12ITS2 regions during evolution of pathogenic oral C. albicans hadn’t obvious correlation with antifugal susceptibility and radiothrapy or chemotherapy. [ Key words] oral candida ; antifugal susceptibility testing ; ITS genotype 白色念珠菌 (Candida) 属于条件致病真菌。近年 来 ,以念珠菌为代表的真菌感染呈明显上升趋势。口 腔念珠菌感染与各种口腔黏膜病有关 ,而且与各种免 疫缺陷患者的深部真菌感染密切相关 ,同时临床检出 了大量的耐药菌株。临床研究表明 :不仅不同种念珠 菌在致病性和耐药性方面存在差异 ,而且同一种群内 的念珠菌在致病性和耐药性方面也存在差异。ITS 区 域是真菌细胞内 DNA 编码核糖体 RNA (rRNA) 的内 转录间隔、非编码区 (internal transcribied spacer re2 gion) 。编码 rRNA 基因是一个串连的重复单位。目 前常被用来进行真菌的鉴定、分型[1 ] 。本文采用 NC2 CL S ( The National Committee for Clinical Laboratory Standards) 最新公布的 M272A2 微量稀释法标准方案 , 检测头颈部肿瘤放化疗患者合并念珠菌感染组、单纯 口腔念珠菌感染组的感染菌株对四种抗真菌药氟康 · 894 · 临床口腔医学杂志 2005 年 8 月第 21 卷第 8 期 J Clin Stomatol ,Aug ,2005 ,Vol. 21 ,No. 8 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
生u5鱼之3K午D绕L老里1 n Somnol Aue达2Lh ·499 坠两性得素书、子氟的感吃和伊由康生的药物敏感 板计数，儒浓度为1一3×1P两高形成单位(CFU/d),用 性，在此基础上进一步对两组口臣念珠雀感索首株以 RPMI164液格培苏减稀释为1一51CVml,两备于年浓 及耐药株和极远株的1TS~1TS2区境核甘酸碱基序列 度20. 进行测序，比较其差异，知察致病性口腔念珠菌1T5 2,4微量棉释法药锁以验按用NC门SM27A2推存的 TS2区蚁进化中变异的序列是个与接既皮化疗相关， 醇琴菊做最程驿法抗点两药物最线试的方法讲行川。样后 含或前置5湿容有在， 以及是否与菌株对抗真能药物的傲感性相关。 2,5结受汽定于培养24h观察受试西生长情况。钉步 材料和方法 州断用样登注人立判定终立，最路用记贯板读森计京法是， AMB以完全生长抑制为最任抑蘭来度，乡℃及座类药句以 1材料 0%生长拘制为银低其岂策度.每次试整以AT258和 1.】际准品及情存清制各氧谢中（上米二淮侧药有限 ATC2019标准候作为质控角林，其MC植位予2下A2规 公)，伊挂疑程两性霉素日，和5：氯的座定女南白美日g 定的黄粥圆认为蔬次试验提作有效，重题3次测试药物均 @公可， MC值家半均效做为该回的MC值+对药物们附药程度判 1.2认验南株43候口2忽县南商株均采白上周第二医 斯分界值参果文献12一4]见表》。 科大学附属葛九人民医统口左乱腹病专科数论去者包括单纯 表【抗真芍物地感住验禁界点 lug'ml) 口弦老珠葡移豪23制23号).头源部静霜汉疗或化疗患者 龙耳间物览感 利量的性地成中度标蓝献蓝 口控制膜含床首感典15例(2梯号)月棉以行端法采集。菌 构性.雷有B 2-4 路 林竖图CT1指1餐定为白色老株情， 5靴型唯呢 16-32 1 1.3周控首株标准株ATCC2019和ATCC6259由第 伊唐束座 .115 0.240.5 二不医人学长买除肽科康船， 氧T程 16-2 354 1.4者养帮RPM11640液体写养基民M11640(含容 2.6像据药最试险结果豫取卡F8和C1-C9共1T株满 氢武花，不合柴酸名初10.4兴L,三氨四年琳丙睛要(30路， 株，~「。这白放化疗划CC9远白个刘白多感豪组， Hua道口分装)34.3L,以1N的NaOH国节H至？.0用 2,7增齿挤养指的床按响于YD因体痛养整37培 Mre花过火自（怨装02m)置4球节备月。成良沙 经琼暗省萄塘2%蛋白陈1%琼后2%加氧着本0.5m吧 养4招，描取单满深移冲于YD体养基，37《都动店养 m,高压天首 24h. 之.8必珠回基因妇DNA的泊提参报文献[5].自浓奥 1.51TS1T52湖用引物引物序列为MIT51:5- GCAAGTAAAAGICGTAACAAGG3 心后，用1M的山梨群汽一次用Lya(美国s公可)清 1T2.5-CT(CGTICTICA1CGAT3'(上料M亚公 化，获或夏生康体，用1%的飞要解，苄卧氢物强合提或达 是报NA, 司合成) 2.方法 2,9Ts1T52CR反立落系总体积为50，包括10 之.1念珠菌分瘦纯化，整定和保存标：本接种于沙保罗 ×R湲冲液52OμMNTP2UT四所引物MIT子1和 氏享后平板，侍齿落出现后超取单菌落移种于沙保罗民琼脂 [T这各2叫，燕馏本补至0叫。代家反应在热新环仅上连行， T反反复王次，达到分高化的日的，深用浓体石轴覆盖保 温度箱环是9所度壮0×.50灵火0￥2江年30×.4 存法保存研究菌株各用。 个第环，格后2保特3n美伸，P℃R产物品1.5%现侧 2.2消量西轮板制条将配制打的抗真两药销行流用 凝腹检测以INA Marerr为分子量标记电林结果在紫外灯 RM1160夜体好养基做稀条液进行10级倍比稀释，控氟康 下夏扇并团化记，录， 叶和夕氟歌唇定的民始浓度为128时，终米质量浓度为 2.10DNA碱基序列测定ITs-I12区城的代家扩W 0.25可m,内性惹发B伊由享壁起焰德度为2gm终求 产物达行地化及NA城甚序列，定， 质丘流度为0.06g。以上各药质盆浓度均为2信应测试 2.I1DNA就基序列分析使用Yr序分所款斜对 药物质度，用，中花重到(M90)备们扩真回药化存覆 22抹两株的1T5T2区晚碱杯序讲行出封，分析两耐問 经RPM11640稀帮后，DM5E锋体积分数不超过1%，经对用 株和节物最感株1Ts:[包区域核普酸或基序列的整异， 试种代体职分世不打制屏母两的生长，蒋隔开钉的药灌对应 结 果 在无葡猫孔版中，从第1孔至第10孔浓度山高到低，每孔 10川，第1112孔.打不含药滚的RPM11640液体给求杯，其 !.成化疗电和单妇白必多染粗对4种抗真菌西物药敏调 中第11孔为生长对粮第2孔为空白对用，加毕西敏投用 定的MC分布情况，见23，法是表明全部海株对5·氯胞 钾管纸密时后放置·80保藏卷用川。 突敏感，且M汇范围较窄，民3个后量浓度梯度：35株 2.3回多波制备将试卤在丝风培移基上连续您种 (见.1)两件器素B最，M1C板国小较竿，4个周量求 2次，以保狂我纯度和活力。取单伪落在沙量长洛养整上5℃ 度棉度，面氟康悦和伊由班理的MC范围控室政化疗组和单 好养24山用0.5%的共水度满是液，调称注度异士附计 纯1含感条组对氯桌型的射巧化例分炉.为26.7和8了%，对 e 1995-2005 Trimglua TongGm:Opica Due Co..i.M AW ngker neirwd
唑、两性霉素 B、52氟胞嘧啶和伊曲康唑的药物敏感 性 ,在此基础上进一步对两组口腔念珠菌感染菌株以 及耐药株和敏感株的 ITS12ITS2 区域核苷酸碱基序列 进行测序 ,比较其差异 ,观察致病性口腔念珠菌 ITS12 ITS2 区域进化中变异的序列是否与接受放化疗相关 , 以及是否与菌株对抗真菌药物的敏感性相关。 材料和方法 1. 材料 1. 1 标准品及储存液制备 氟康唑 (上海三维制药有限 公司) ,伊曲康唑、两性霉素 B、和 5 - 氟胞嘧啶均购自美国 Sig2 ma 公司。 1. 2 试验菌株 43 株口腔念珠菌菌株均采自上海第二医 科大学附属第九人民医院口腔黏膜病专科就诊患者 ,包括单纯 口腔念珠菌感染 23 例 (1223 号) ,头颈部肿瘤放疗或化疗患者 口腔黏膜念珠菌感染 15 例(23238 号) ,用棉拭涂擦法采集。菌 株经 YBC Test Kit 鉴定为白色念株菌。 1. 3 质控菌株 标准株 A TCC22019 和 A TCC6258 由第 二军医大学长征医院皮肤科惠赠。 1. 4 培养基 RPMI1640 液体培养基 RPMI 1640 (含谷 氨酰胺 ,不含碳酸氢钠) 10. 4 g/ L ,三氮吗啡琳丙磺酸 (MOPS , Fluka 进口分装) 34. 53 g/ L ,以 1 N 的 NaOH 调节 p H 至 7. 0 ,用 Millipore 滤过灭菌(滤膜 0. 22μm) ,置 4 ℃冰箱备用。改良沙 堡琼脂 :葡萄糖 2 % ,蛋白胨 1 % ,琼脂 2 % ,加氯霉素 0. 05 mg/ ml ,高压灭菌。 1. 5 ITS12ITS2 通用引物 引物序列为 MITS21 : 5’2 GGAA GTAAAA GTCGTAACAA GG23’ ITS2 : 5’2GCTGCGTTCTTCA TCGA TGC23’(上海博亚公 司合成) 2. 方法 2. 1 念珠菌分离、纯化、鉴定和保存 标本接种于沙保罗 氏琼脂平板 ,待菌落出现后 ,挑取单菌落移种于沙保罗氏琼脂 平板 ,反复 3 次 ,以达到分离纯化的目的 ,采用液体石蜡覆盖保 存法保存研究菌株备用。 2. 2 微量药敏板制备 将配制好的抗真菌药储存液用 RPMI 1640 液体培养基做稀释液 ,进行 10 级倍比稀释 ,使氟康 唑和 52氟胞嘧啶的起始浓度为 128μg/ ml ,终末质量浓度为 0. 25μg/ ml ,两性霉素 B、伊曲康唑起始浓度为 32μg/ ml ,终末 质量浓度为 0. 06μg/ ml。以上各药质量浓度均为 2 倍应测试 药物质量浓度。用二甲基亚砜(DMSO) 制备的抗真菌药储存液 经 RPMI 1640 稀释后 ,DMSE 终体积分数不超过 1 % ,经对照 试验此体积分数不抑制酵母菌的生长。将稀释好的药液对应 加在无菌 96 孔板中 ,从第 1 孔至第 10 孔浓度由高到低 ,每孔 100μl。第 11、12 孔加不含药液的 RPMI1640 液体培养基 ,其 中第 11 孔为生长对照 ,第 12 孔为空白对照。加毕 ,药敏板用 铝箔纸密封后放置 - 80 ℃保藏备用[ 2～4 ] 。 2. 3 菌悬液制备 将受试菌在沙堡氏培养基上连续移种 2 次 ,以保证其纯度和活力。取单菌落在沙堡氏培养基上 35 ℃ 培养 24 h ,用 0. 85 %的盐水制成菌悬液 ,调整浊度 ,经血细胞计 数板计数 ,菌浓度为 1～5 ×106 菌落形成单位 (CFU/ ml) ;用 RPMI 1640 液体培养基稀释为 1～5 ×103CFU/ ml ,两倍于终浓 度[ 2～4 ] 。 2. 4 微量稀释法药敏试验 按照 NCCL SM27 A2 推荐的 酵母菌微量稀释法抗真菌药物敏感试验方法进行[ 3 ] 。加样后 念珠菌置 35 ℃湿盒孵育[ 2～4 ] 。 2. 5 结果判定 于培养 24 h 观察受试菌生长情况。初步 判断用视觉法大致判定终点 ,最终用记数板读取和计算结果。 AMB 以完全生长抑制为最低抑菌浓度 ,52FC 及唑类药物以 80 %生长抑制为最低抑菌浓度。每次试验以 A TCC6258 和 A TCC22019 标准株作为质控菌株 ,其 MIC 值位于 M272A2 规 定的范围 ,则认为该次试验操作有效。重复 3 次测试药物的 MIC值 ,取平均数做为该菌的 MIC 值。对药物的耐药程度判 断分界值参照文献[2～4 ] (见表 1) 。 表 1 抗真菌药物敏感性实验临界点 (μg/ ml) 抗真菌药物 敏感 剂量依赖性敏感 中度耐药 耐药 两性霉素 B ≤1 2～4 ≥8 52氟胞嘧啶 16～32 ≥64 伊曲康唑 ≤0. 125 0. 25～0. 5 ≥1 氟康唑 ≤8 16～32 ≥64 2. 6 依据药敏试验结果选取 F12F8 和 C12C9 共 17 株菌 株。F12F8 选自放化疗组 ,C12C9 选自单纯白念感染组。 2. 7 增菌培养 将菌株接种于 YPD 固体培养基 ,37 ℃培 养 48 h。挑取单菌落移种于 YPD 液体培养基 ,37 ℃摇动培养 24 h。 2. 8 念珠菌基因组 DNA 的抽提 参照文献[ 5 ] ,菌液离 心后 ,用 1M 的山梨醇洗一次 ,用 Lyticase (美国 Sigma 公司) 消 化 ,获取原生质体。用 1 %的 SDS 裂解 ,苯酚氯仿混合提取法 提取 DNA。 2. 9 ITS12ITS2 PCR 反应体系总体积为 50μl ,包括 10 ×PCR 缓冲液 5μl ,200μMdN TP ,2 U Taq 酶 ,引物 MITS21 和 ITS2 各 2μl ,蒸馏水补至 50μl。PCR 反应在热循环仪上进行 , 温度循环是 95 ℃变性 30 s ,50 ℃退火 30 s ,72 ℃延伸 30 s ,40 个循环 ,然后 72 ℃保持 3 min 延伸。PCR 产物经 1. 5 %琼脂糖 凝胶检测 ,以 DNA Marker 为分子量标记 ,电泳结果在紫外灯 下观察并照相记录。 2. 10 DNA 碱基序列测定 ITS12ITS2 区域的 PCR 扩增 产物进行纯化及 DNA 碱基序列测定。 2. 11 DNA 碱基序列分析 使用 Vector 序列分析软件对 22 株菌株的 ITS12ITS2 区域碱基序列进行比对 ,分析两组耐药 株和药物敏感株 ITS12ITS2 区域核苷酸碱基序列的差异。 结 果 1. 放化疗组和单纯白念感染组对 4 种抗真菌药物药敏测 定的 MIC 分布情况 ,见表 2、3。结果表明全部菌株对 5 - 氟胞 嘧啶敏感 ,且 MIC 范围较窄 ,仅 3 个质量浓度梯度 ; 35 株 (92. 1 %) 对两性霉素 B 敏感 ,MIC 范围亦较窄 ,仅 4 个质量浓 度梯度 ;而氟康唑和伊曲康唑的 MIC 范围较宽 ,放化疗组和单 纯白念感染组对氟康唑的耐药比例分别为 26. 7 %和 8. 7 % ,对 临床口腔医学杂志 2005 年 8 月第 21 卷第 8 期 J Clin Stomatol ,Aug ,2005 ,Vol. 21 ,No. 8 · 994 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
÷500. 悠步0的假学2力5生8日511经8且Ln3 ortd Au 10053hL11a3 伊扫废性的耐药比例分别为0%和15务.，放化疗组明显高于单炮白色多株儒（简将白）穷绕组 表2放化疗组和单纯门忽墨组件说测比的MC分的 物与公细 南株显 MC围 CO处布慎柱包 19 4 030252九125 氧废理 酸化厅讯 19 64-025 白念够组 23 64-0.125 SFC 校化行组 5 0.5-0.125 白含男州 23 0.5-0.12s 16 表3教化疗用和单吨白之多柔烟药镇测定能MC分作 Ir升在（校数的 西尚力分阻 体数 MDE展 [Fp'm) 0.50250.120.050.03 丙性秀素川 纹化它行阻 15 2-0.25 门意8军阳 2-0.39 伊食桌唑 收化疗阻 4-0,05 日之多柔州 25 4-0.d时 2 2.ITS-IT2PR,惊君NC1s的M2下A2标性方有娱 CI CEC/085 C4CS C2 CI M 定狗抗真使药物嫩感性实修界点和两酸测定的MC值途取 FF3C(9共1万株南林，F小F烧白故化疗组，其中F 「)为顺度型和伊由卓连的药物绩B株「和5为伊由痉壁射药 株，F取F为氧康哇和伊佳成唑交叉形药株：CV速自单地白 念承癸组，C1C4为属城叶利伊盐城个的5卷最R,5为伊 由傲坐耐特依，C必C9为氟唑和伊佳求生文又耐两株。F卜F8 C9南饮1T1T边代3的电袜法墨见图1.17床白念 IT 1716 F5 F463 F2 F1 的HS11S2CR产物均为20p左右， 1DNA城基序列分析图2是示F-F5和C-C0的 图1F-F移和C-C前核ITs-T5登CR的电朱结是 ITS1T2区城的DNA限基序列比的法果。 10 20 30 50 F ---GTTGAAAGTTTTCACTATTANGTAKTAATCTOGTSTCACAAGTTAATAAAAAFTTGGTTGTAAGTTTAGACCTCTG THIRTTAL-RTTTTRACTATTA-RTAKTAATETARTIFACLAFTTGATAALAAITIGFTTILAFITTARACITCTR ---GTTGAMAGIITEGNCTATTA-GIAKTAATCTGGICIGACAAGTIGATAAANAFTIGGTIGIAAGTTTNGACCICTS GITTEGACIATIA-GLAKTANTCIGGIGIGACAAGTIGATAAAATIGGTTGIAAGITTNGACCICTG --RTTTFRACTATTA-RTALTAATCTOSTEGACLARTTGATAAAAASTTGETTIANTTTACACT.TOTG GIITIGNCIATIA-GIAKTAATCIGGIGIGACAAGIIGATAAAAFIIGGTIGLAAGTTIAGMCCICIG -GTTTTGACTATTA-GTARTAATCTOGTOTGACAAGTIGATAAAAAFTIGGITGIAAGTETAGACCICTG TTTFRAGTATTA-TAKTANTCT的TIGALAGIRATAAALAITIEGTTGILNGTTTATIT哈 GTIGAANGITTEGNCIATIA-GLAKTAATCIOGIGIGACANGIIGATAAAMTIGGTTGIAAGTTTNGACCICTS -TTTCACTATIA-GTARTAATCTOGTGTGACAAGTICATAAAAATTGGTTGTAAGTTTAGACCTCTG CUTIGTTGAAAGIITEGACTATIA-GLAKTAATCIDGTGIGACANGIDGATAAAMTIGGTTGIALGTTLAGCCICIS A-GTARTAATCTRSTEIGACANTIGATAALTTGTTGTAGTTTAGNTICTG GACIATIA-GLAKTAAICIGGLGIGACAAGTDGKTAAAAAFTTGGTIGIAAGTTLAGACCICIG ---TAATCIOGTOTGACAAGTTAATAAAAAFTTCGTTGTAAGTETAGACCTCTG -TIA-GIAKTANTCIGGIGIGACAAGTIGNTAAAMTIGGITGIANGTTLNGCCICIG GGET AIGACAATIGATAAAAATTOTTCTAAGTTTAGACCTCTG Coreso GTTTTCACTATIA GTAATAATCTOGTCTGACAATCATAAATTOGTTGTAACTTEAGACCTCTG eJ9.205.g如Tate0 ng Cphco圆0ka.iAd AN rg的
伊曲康唑的耐药比例分别为 40 %和 13 % ,放化疗组明显高于 单纯白色念株菌(简称白念) 感染组。 表 2 放化疗组和单纯白念感染组药敏测定的 MIC 分布 药物与分组 菌株数 MIC 范围 (μg/ ml) MIC(μg/ ml) 分布(菌株数) ≥64 32 16 8 4 2 1 0. 5 0. 25 ≤0. 125 氟康唑 放化疗组 15 64～0. 25 4 1 2 1 4 2 1 白念感染组 23 64～0. 125 2 1 2 3 6 5 2 1 52FC 放化疗组 15 0. 5～0. 125 1 3 11 白念感染组 23 0. 5～0. 125 2 5 16 表 3 放化疗组和单纯白念感染组药敏测定的 MIC 分布 药物与分组 菌株数 MIC 范围 (μg/ ml) MIC(μg/ ml) 分布(菌株数) ≥16 8 4 2 1 0. 5 0. 25 0. 125 0. 06 ≤0. 03 两性霉素 B 放化疗组 15 2～0. 25 1 10 3 1 白念感染组 23 2～0. 25 2 17 3 1 伊曲康唑 放化疗组 15 4～0. 06 3 2 1 4 2 2 1 白念感染组 23 4～0. 03 1 2 3 11 3 2 1 2. ITS12ITS2 PCR 依据 NCCL S 的 M272A2 标准方案规 定的抗真菌药物敏感性实验临界点和药敏测定的 MIC 值 ,选取 F12F8 和 C12C9 共 17 株菌株。F12F8 选自放化疗组 ,其中 F12 F3 为氟康唑和伊曲康唑的药物敏感株 ,F42F5 为伊曲康唑耐药 株 ,F62F8 为氟康唑和伊曲康唑交叉耐药株 ;C12C9 选自单纯白 念感染组 ,C12C4 为氟康唑和伊曲康唑的药物敏感株 ,C5 为伊 曲康唑耐药株 ,C62C9 为氟康唑和伊曲康唑交叉耐药株。F12F8 和 C12C9 菌株 ITS12ITS2 PCR 的电泳结果见图 1。17 株白念 的 ITS12ITS2 PCR 产物均为 200 bp 左右。 3. DNA 碱基序列分析 图 2 显示 F12F8 和 C12C10 的 ITS12ITS2 区域的 DNA 碱基序列比对的结果。 图 1 F12F8 和 C12C9 菌株 ITS12ITS2 PCR 的电泳结果 · 005 · 临床口腔医学杂志 2005 年 8 月第 21 卷第 8 期 J Clin Stomatol ,Aug ,2005 ,Vol. 21 ,No. 8 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
玉口的思鲶叠意1年。上宽机克，厘11a9aL国5L的 ·501+ 0 100 山o 10 130 40 50 GGCGOCADOCTOGICDCADOGCAAAGCAABTTTGTTTCHAACAMAANCACATGTGGIGCAA-TTANDCAATCA-CTAAT 4阳AA-TT-TAT AD AAAR ANTUISITICMLAAATTG GGCGOCAGGCTGGEDCCACCGOCAAAGCANGITIGTTICMACRAAAACACATGIGGIGCAA-TTAGCAANTCA-DTAAT GOCGOCACOCTCOLDCCAOAANGCAGITIGITICAAACAAAAACACAIGIGUIGCAA-TIMGCAAATCA-CTAAT F7(GOCGOCNGOCTGOCOCCACCOOCAAAGCANTTGTTTCAMAGAAALACACKTGIGGIGCAA-TTMAGCAAATCA-CTAAT 月谓-- ALAATA ATRTD从-TAARP AATTA-GT灯 GGCBCAGBCTOOCCCCACEOCLAAAGCAAITTTGTTTCAAAGAAAACACATCTOGIGCAA-TENNGCAAXTCA-GTAXT GGCOGCAGOCTGSOCCCACCOCCAAAGCAAGTITGITTCAANGAAMAMCACATCTOCICCAA-TTMBCAATCA-GTAXT GGCOOCAGGCTOOCCCCACCOCCAAAGCAAGTTIGTTTCMAAGAAANCACATGTOCIGCAA-TTA SCAATCA-GTAKT COOCLAAAGCMGTTIGITTCIALGALANCACATCTOCIGCAA-TTMSCAATCA-GTAKT GGCGGCABGCTOGOCDCACDOCCAAAGCAAGITIGTTTCMNGAMAMACATGTCCIGCAA-TTAGCAAKTCA-GTAT 9 GOCROCAGGCTOGECDCACDOCCAAAGCAACTTT 190 0 210 220 230 FI:GTICACCTACGCAAADCTTGITACGACTTTLACTI-CCA N:.TNARLAANTTITTMYTITACTI-CARG TRTCLTCCGC5.ΠCACCTACCCAAACLTTGIT买CITTINCITIOCA FA1 TGATOCTICOGCAGGTICACCTACOGAAACCTTGTLNCGACTTTTACTI-CCAMTCMAAATTTMATENCCA RAANYTTRTTMTACTTTIA:TI-ATILATTTMLTTWTA- GATOCTTOCGCMOGTICACCTACOCAAACETIGTIACGNGTTTIACTI-CCNTACATDNTTIMEKTTCCCONC Q TAARETTEADETICRRALACITTETTACANTTTTAL-CA ICATOCTICEGCABSTTCAOCUACOCAAACCTTCTTACLACTTTTALTT-CCA HA TGATOCTTCCCCALGTTCADCTACGGAANCCTTGTTACCACTTT-ACT TOATOCTICCOCACGTICAOCTICGGAAACCTIGTTACOACTTTTACTI-CCKT T TTTCAIGTICATAGALAETIETTACRNTTTTACT-CAT TGATCCTICCGCAIGITCNOCTICGGALACCTEGTIACCACTTTTACTI-CCA TGATOCTTCOOCACCTICACETAOGGAMADCTTGTTACGACTTTEACTI-CCACAA GATOCTTCDOCALOTICACCTACGGAAADCTTGTTADGACTTTENCTI-CCXT- TRXTN.TTDAACAFRETCATTATRAAATTTFTTADANCTTITLTICTAYTAETETININKATTTTTAMMKTMCTTC TGATOCTICOCCACGTICACLIACGRAAACCTIGTTAOGACTTTINCTI OCA 啊2T飞2区减们口NA禁基序列比3纳果 叶的耐药比例分别为26.7%和8.7%.对伊曲康唑的 讨论 耐药比例分数为40%和13%放化疗组的时药比例明 实验采用NC门.S的M2?A2微量稀释法标准方 显高于单纯白念感染组：而菌株TSTS2序列的差 案，对两株标准株ATCC22019和ATCC6258的氯 异与分组和物植：感性无明朵相关。因此致纳性口花 隆、两性毒煮B、复密定和伊曲康唑的三次重复药 念珠商ITS-【TS2区或进化中变异的序列.与是否接 测定，结果显示：MC波动能田不超过一个药物幅 受做化疗无明显和关，与南株对抗其南药物的收运性 量浓度梯度，且均在NOCLS的2下A2中公布的药饭 也无明暴相关。 分界点标准范国内正实了N1S的M2下A2力案的 【参考文献1 可重复性和结果的一致性，并适用于口控念珠自的药 第实验。 Il1Fias到，5山Y,Nakanu山s,sd.Mu.ples ICI mirg in园 有研究表明，不同基因型的念味黄在致病性 tnr发bed spoce1同2t6 e rapid detectio3fdfk士 anc减yw14orm中J1 ir Memhol0l391):3617-2拉 和时药性方面有仟着差异，密着分了生物学技术的发 21NCLs.cferenexe axtlod fur bouth且aon ufuzd3op.ia山y 根，各种素因分亚方法正在不断被改进。真茵的 enE6d6Y5:pot司gnr企0fdcn.NCLS16 NC7-A (ISIN56218464)XCY1S440 Wder Raad Sme S1112部分是最新发更的区域问时含有进化中 140,作r,a190gr18%L5A20位. 保守和变异的序列，目前常用干箱种的签定和分型。 13】存密强水检月，李莉等.1国杭整米公离致瑞服昏体外的能实 依帮ITS小1Ts2区域碱止，不列的整异可以将白色念埃 的分所和1.中￥店米朵减，200,33()3]3.35. 商分成不的基因型。本实验探时不问1TS1基 14】龙中张水1，个尺，等.校念珠h则新型形这角对冈件抗 真离药的确感性日】，中国抗生发条志2位27(5》：刘5-3除. 因型的菌株其致病性和附药性是香打在差异。实验结 (5]Muro:G.Smgin M,Fractuo B,e.lenfiulion of Vui 果表明：全部菌株对夕氯甩密定傲远，92.1%粕株对 0 s Medclly lrpect Card占Speces in C微t4sy 两性荐素B敏感，皮化疗组和单纯白含感梁组对氟康 代R-Rerction Ereyne Au小us1 Cn Mcmol,w7353) 的7.过 eJ205 glun Tongng Opuleal女a.Lsd.AN rig的rd
图 2 ITS12ITS2 区域的 DNA 碱基序列比对结果 讨 论 实验采用 NCCL S 的 M272A2 微量稀释法标准方 案 ,对两株标准株 A TCC22019 和 A TCC6258 的氟康 唑、两性霉素 B、52氟胞嘧啶和伊曲康唑的三次重复药 敏测定 ,结果显示 : M IC 波动范围不超过一个药物质 量浓度梯度 ,且均在 NCCL S 的 M272A2 中公布的药敏 分界点标准范围内 ,证实了 NCCL S 的 M272A2 方案的 可重复性和结果的一致性 ,并适用于口腔念珠菌的药 敏实验。 有研究[6～7 ]表明 ,不同基因型的念珠菌在致病性 和耐药性方面存在着差异。随着分子生物学技术的发 展 ,各种基因分型方法正在不断被改进。真菌的 ITS12ITS2 部分是最新发现的区域 ,同时含有进化中 保守和变异的序列 ,目前常用于菌种的鉴定和分型。 依据 ITS12ITS2 区域碱基序列的差异可以将白色念珠 菌分成不同的基因型。本实验探讨不同 ITS12ITS2 基 因型的菌株其致病性和耐药性是否存在差异。实验结 果表明 :全部菌株对 52氟胞嘧啶敏感 , 92. 1 %菌株对 两性霉素 B 敏感 ,放化疗组和单纯白念感染组对氟康 唑的耐药比例分别为 26. 7 %和 8. 7 % ,对伊曲康唑的 耐药比例分别为 40 %和 13 % ,放化疗组的耐药比例明 显高于单纯白念感染组 ;而菌株 ITS12ITS2 序列的差 异与分组和药物敏感性无明显相关。因此致病性口腔 念珠菌 ITS12ITS2 区域进化中变异的序列 ,与是否接 受放化疗无明显相关 ,与菌株对抗真菌药物的敏感性 也无明显相关。 [参 考 文 献] [ 1 ] Fujita SI , Senda Y , Nakaguchi S ,et al. Multiplex PCR using internal transcribed spacer 1 and 2 regions for rapid detection and identifica2 tion of yeasu strains[J ] . J Clin Microbiol ,2001 ,39 (10) :3617 - 22. [2 ] NCCLS. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts ;approved standard2second edition. NCCLS document M272A2 ( ISBN1256238246924) . NCCLS , 940 Western Road , Suite 1400 ,Wayne ,Pennsylvania 1908721898 USA ,2002. [ 3 ] 章强强 ,苏逸丹 ,李 莉 ,等. 100 株临床分离致病酵母体外药敏实 验分析[J ] . 中华皮肤科杂志 ,2000 ,33 (5) :333 - 335. [ 4 ] 龙 丰 ,张永信 ,李 民 ,等. 248 株念珠菌和新型隐球菌对四种抗 真菌药的敏感性[J ] . 中国抗生素杂志 ,2002 ,27 (5) :305 - 308. [5 ] Morace G , Sanguinetti M , Posteraro B ,et al. Identification of Vari2 ous Medically Important Candida Species in Clinical Specimens by PCR2Restriction Enzyme Analysis[J ] .J Clin Microbiol ,1997 ,35 (3) : 667 - 72. 临床口腔医学杂志 2005 年 8 月第 21 卷第 8 期 J Clin Stomatol ,Aug ,2005 ,Vol. 21 ,No. 8 · 105 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
·502w 越k口区学杂大1m8年&且2L单且I Din Soonedl Aue 10052L 扁平苔藓患者血小板聚集和血液流变学研究 张延琳，王嘉陵2丁蕾逢爱慧李明郭三兰 (1.华中科技大李同济医学院附属同济口腔医学中心口腔内科湖北武汉43050： 2.华中科技大学同济医学院药理系) 摘要】日的研究口驶扁平花韩(CL卧发作期，垫定期和清退期的血小餐聚第和直表流变学变化探时CLP 微循环障群和类建反应的机制。方法：观察65例LP发作期治疗后稳定期和清退期的自小版聚集和直液流变学 湘标的变化与翰例量度老屋者进行对凰，结果：见P发作用，治疗后拉定期和清思用的血小板聚集率(1,5 和量大聚集)明显增强{P<Q0),全血粘度低切高切)、血案粘度红细胞压积、直沉和红饵胞聚集指数好 推蛋白元等直浓流变学籍标均商干对周组(P<0.5)。且发作期的霜标查干帝疗后稳定期和消退期。而虹相胞刚 性智数，红阳图变形相数变化明暴，结论：风P妻者的直小板聚氧和直液流变学粉标增理，提捏示LP的发病机制 和疾病就变与直小板聚集和血液流变学政变有关： 关健润】自平首群：血小服聚集：血流流变学 【中图分类号】81.5【文就标码]A 【文章编号】1003.163442005)08-052.02 search on向et地egtins and hemoerhedlugy of oral lichen由as2 HANG Yarlo,WANG Jirlog [Abotrct Objeethe To investigte the pathogeneis of platelet aggregition and hemorrhoology on ond lichen planu (CPy.lethod by survey pla减let aggregation and hemorrho②on actneduty and rel与a减on of the6 S patients with CL.P (25--65 years old)were sed and the 30 som for omra go.Resut :On ctiveduty and reaulion of the 65 patierts with 0.P,planekt aggregdion (13,5 minue and the mose)are sgrificantly inereied (<0.01).The whole biod visosity.plasmotic visoosity Erythrocyte Epress Amess.ESR Erythcyle Aggregation Exponent and uere markedly inereed (P<.05)which hd ifcanee compared with the omrl goup.Oa activeduty are significanby increased oompaed with rdasation.The Boythrocyte Rigdity Exponent.Erythrcyle Dcformati Expo em were markedly chang Concln This resuts d tha Ol.P is imolved in many fcors,pllelel ageregion and hemorhalogy are reeaed with activeduy d rdaution and ply an inporart mke in pathogneis of Ol.P. Key words]oral lichen planus:pltelet aggregation hemorrhoology 口粒扁平苔藓(Oral lichen planus,OLP)是一种冢 材料和方法 因不明的非感染性口粒黏膜慢性浅表性炎症，近年来 发病率有增高和年轻化的趋势"一引。目前认为OLP 1,村料这排199.1-2003.6同济医候口腔医学中心口 与微循环障骨精神因素、内分泌免疫感染及遗传等 2内科门豫双豫的0笔P患者65例，女42例，男23例：年静25 因素有关。本文从微循环障得和炎醒反应的角度探 -65岁，平均47.9±山1.9岁：病程60-70d,平均将程81.1 讨其发病机制 出43.9d,餐据往状，体征即细照学检查等综合分析.作出疾 病发作用治疗后拉定用和消忍期的诊断明。正常对盟相为同 ·瑟金则日：湖式省料枝厅料技及关新金货肤4A431C1回 期这择无口腔整限病相的健峡自总者动例女2】例，男9例： 年静2565岁.平均48.29.5岁. 6】ge Vardetbauche,lano Vancoc如te,tarleen Vandrverne,t TSarcho四reLe,ngph加Yung Jemrweng Han用，.ai 道Suscepilry tesong of fuoo raole与1eNC间shxr cersdaes of amfutgdl mocrodltion s线cptiblty1tgek网 laten mcthed,ETed,ard dik dffuoon fbe application is the ror eTA田S paticntx with星were candid量octions treted wth flur 1 ie laboro0U1.J①nMet.202.40(3》:91B.92I. oonnle[J ]Amimicrobed Ageets and Cherstheropy,2000.44 (1002力5-8. 收编日期：2005.05.20 1995-2005 Tsimgkse Tougfog Optical Dise Co.Lnd AN righes reered
扁平苔藓患者血小板聚集和血液流变学研究3 张延琳1 ,王嘉陵2 ,丁 蕾1 ,逄爱慧1 ,李 明1 ,郭三兰1 (1. 华中科技大学同济医学院附属同济口腔医学中心口腔内科 湖北 武汉 430030 ; 2. 华中科技大学同济医学院药理系) [摘要] 目的 :研究口腔扁平苔藓(OL P) 发作期、稳定期和消退期的血小板聚集和血液流变学变化 ,探讨 OL P 微循环障碍和炎症反应的机制。方法 :观察 65 例 OL P 发作期、治疗后稳定期和消退期的血小板聚集和血液流变学 指标的变化 ,与 30 例健康志愿者进行对照。结果 :OL P 发作期、治疗后稳定期和消退期的血小板聚集率 (1 min、3 min 和最大聚集) 明显增强 ( P < 0. 01) , 全血粘度(低切、高切) 、血浆粘度、红细胞压积、血沉和红细胞聚集指数、纤 维蛋白元等血液流变学指标均高于对照组( P < 0. 05) 。且发作期的指标高于治疗后稳定期和消退期。而红细胞刚 性指数、红细胞变形指数变化明显。结论 :OL P 患者的血小板聚集和血液流变学指标增强 ,提示 OL P 的发病机制 和疾病演变与血小板聚集和血液流变学改变有关。 [关键词] 扁平苔藓 ;血小板聚集 ;血液流变学 [中图分类号] R781. 5 [文献标识码] A [文章编号] 1003 - 1634 (2005) 08 - 0502 - 02 Research on platelet aggregation and hemorrheology of oral lichen planus ZHA N G Yan2lin , W A N G Jia2ling , DIN G L ei , PA N G A i2huei , L I Ming , GUO S an2lan. Depart ment of Oral Medicine of S tom atology , Tongji Hospital , Tongji Medical College of Huaz hong U niversity of Science and Technology , W uhan 430030 , China [Abstract ]Objective :To investigate the pathogenesis of platelet aggregation and hemorrheology on oral lichen planus (OL P) . Method : by survey platelet aggregation and hemorrheology on activeduty and relaxation of the 65 patients with OL P (25～65 years old) were studied ,and the 30 nomal for contrast group . Result :On activeduty and relaxation of the 65 patients with 0L P , platelet aggregation (1 ,3 ,5 minute and the most) are significantly increased ( P < 0. 01) . The whole blood viscosity , plasmatic viscosity , Erythrocyte Express Amass , ESR , Erythrocyte Aggregation Exponent and were markedly increased ( P < 0. 05) , which had statistical significance compared with the control group. On activeduty are significantly increased compared with relaxation. The Erythrocyte Rigidity Exponent , Erythrocyte Deformation Expo2 nent were markedly chang. Conclusion :This results suggested that OL P is involved in many factors , platelet aggregation and hemorrheology are realeated with activeduty and relaxation ,and play an important role in pathogenesis of OL P. [ Key words] oral lichen planus ; platelet aggregation ;hemorrheology 口腔扁平苔藓(0ral lichen planus ,OL P) 是一种原 因不明的非感染性口腔黏膜慢性浅表性炎症 ,近年来 发病率有增高和年轻化的趋势[1～3 ] 。目前认为 OL P 与微循环障碍、精神因素、内分泌、免疫、感染及遗传等 因素有关。本文从微循环障碍和炎症反应的角度 ,探 讨其发病机制。 3 基金项目 :湖北省科技厅科技攻关基金资助(2004AA301C100) 材料和方法 1. 材料 选择 1999. 1～2003. 6 同济医院口腔医学中心口 腔内科门诊就诊的 OL P 患者 65 例 ,女 42 例 ,男 23 例 ;年龄 25 ～65 岁 ,平均 47. 9 ±11. 9 岁 ;病程 60～720 d ,平均病程 81. 1 ±143. 9 d。依据症状、体征和细胞学检查等综合分析 ,作出疾 病发作期、治疗后稳定期和消退期的诊断[ 3 ] 。正常对照组为同 期选择无口腔黏膜病损的健康自愿者 30 例 ,女 21 例 ,男 9 例 ; 年龄 25～65 岁 ,平均 48. 2 ±9. 3 岁。 [ 6 ] Inge Vandenbossche , Mario Vaneechoutte , Marleen Vandevenne , et al. Susceptibility testing of fluconazole by the NCCLS broth macrodi2 lution method , E2Test , and disk diffusion for application in the rou2 tine laboratory[J ] . J Clin Microbiol , 2002 ,40 (3) : 918 - 921. [ 7 ] Sai2cheong Lee , Chang2phone Fung ,Jen2seng Huang , et al. Clinical correlates of antifungal macrodilution susceptibility test results for Non2AIDS patients with severe candida infections treated with flu2 conazole[ J ] . Antimicrobial Agents and Chemotherapy , 2000 , 44 (10) :2715 - 8. 收稿日期 :2005 - 05 - 20 · 205 · 临床口腔医学杂志 2005 年 8 月第 21 卷第 8 期 J Clin Stomatol ,Aug ,2005 ,Vol. 21 ,No. 8 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved