他味▣22字条20年1第19壶笔置an5如ulem1d1线如 +491· 口腔黏膜病· 白斑癌变相关基因的表达谱研究” 周同陶覆，张庆华，杜艳姿郑培蒸 摘要引的运用DNA菊阵利挂术研究口腔白页组积和口胶解摩组织的基闲表达谱的度化，为家时口 腔自疑瘤变基因提供初多椅选绕料。方法对修床切除的5例口腔自斑和口腔穆组帆进行总NA挂提，逆转录 制备限针，炮化后与含有424个基因的微阵列染交，象交后的信号经山福收检测和计算机分析后膏选出与白面整 变朝美的精因，结墨对口2有我和口腔隋精因表达请建行分所，发现存在0个差异表达的基国，它们可能与自 斑啼变有美，垫论采用州A微阵列技术能成功检洲出两种不同相帆中多个基因的差异表达为研究白斑脑变 机制圆侯有价值的简选资鲜。 【关键到小自无：啼变：整因表达：微济列 【中图分类号1R71.5【文献标洞码引A1文章编号11003.1634(200阳)08.0491.04 9小国长hhhG销ree4aess。rh北Igene expressios ly eDNA位r司Za在wg.T0ag, Zang Qinghus.Du Yon:t.Zhng Fizlng.Drpartear of Oral Mediciae.School f Siomatdogy.Sbangha Second Medieal Ueirerry.Shanghar 200011.Chine IAbvireell Ohiectise To复u小the dfference in gene expreson between orl leukoplaka tissues and orl对r mous cell carcinoma tiswee by micmarrry so as in investigate the mechanism of leuleelakia caecirogeresis.Methed We studed novel gere expressoa by cDA micmoarmy method.The PCR products of 4124 genes was spotted onto a kind of chemical,materid-maled-山es side in arrry,Soth the total INA from 5 casesof onl对us cell ca口o四tiswes dCTP to the hy pabes.Afer hbridzation.DNA micmoary were caaned for the fluoescert inter profiles.Besr Among 4124 target genes ,there are 30 penes whose expressom leve differed from leukoplakia and carc mm lisues.Therefoe,They might be asociled with leakplakia creinness Cardusun eDNA micmary tec nique can simaltanoousy sereen the diferent exaesons of genes fmm 2 deferert limds of tiswe.Further aralyas of thee diferemily expresed gnes will be helpful understanding the molar mechanism of leuiplake carinness. |yrd圳eulplakiaceeis,ene epeesion,mt四a0 口腔白斑是国际公认的常见口控密前病变。由 异序列的基因连接在因相线体的特异位点上而成探 于从癌前病变发晨到癌是一个循序渐进的变化过程， 针根据生物样本中的目标核苷酸面确定，相关的反应 放积极采取措能阻断白斑癌变对早期防癌尤为重要。 结果被监测与分析川。因其允许月时进行成干上万 近20年来人们对口腔癌发病机制中基因调挖问题进 个基因表达分析使做助生物学通路水平的质的变化 行了深入酥究，发现由癌前病麦发展到肿瘤是一个沙 观察疾病的发离机制、治疗反应成为可能。骁近有关 及多基因的复条过程，对于白斑在基因水平上的某些 DNA微库列应用于峰床研究的报道渗及多种疾病的 改变也作了研究，发现与口腔白斑癌麦有关的基因都 分类危险评估，治疗反应和肿瘤诊断等，目复习国内 不是单鞋起作用的，因此探索与癌变相关的基因群及 外资料未见用于白斑毫变的临床研究报告。 其网洛关系显得格外重要。 本研究运用DNA微阵列检测技术，酥究和深素 DNA数阵列(DNA Microarray)是近年米发展起 导致口腔白宽癌变的可疑基因群期级发现一些与白 来的应国手分子生物学研究的一项新兴技术，它由特 斑密变相关的未如功陵的新基因，为今后研究防治白 “瑟金溪日：国家料学技术家瑟确研究同斯叠2间， 斑和某些黏膜上皮来雨的肿箱提供新的彩点。同时希 作着单位201川上为，上海龙二医科大学口整属学院口腔内科 复发现与白癌变相关的己知功能的基因，为进一步 周管同：上海第二医料大学口腔医学院口腔峰价科 研究白斑癌变分子模型和开发中药的基因干顶治疗提 (测证)：上海第二区科大学附属璃全医院直液疾好充 供实验依据。 用（程天平七相宽，影常惑） CI95-i005万imh@Togfing Opvical Dise Co.,dnmg的nnd
·口腔黏膜病· 3 基金项目 :国家科学技术部基础研究司基金(2000 - 026) 作者单位 :200011 上海 ,上海第二医科大学口腔医学院口腔内科 (周曾同) ;上海第二医科大学口腔医学院口腔综合科 (陶 疆) ;上海第二医科大学附属瑞金医院血液病研究 所(张庆华 ,杜艳姿 ,郑培蒸) 白斑癌变相关基因的表达谱研究3 周曾同 ,陶 疆 ,张庆华 ,杜艳姿 ,郑培蒸 [摘 要] 目的 运用 cDNA 微阵列技术研究口腔白斑组织和口腔鳞癌组织的基因表达谱的变化 ,为探讨口 腔白斑癌变基因提供初步筛选资料。方法 对临床切除的 5 例口腔白斑和口腔癌组织进行总 RNA 抽提 ,逆转录 制备探针 ,纯化后与含有 4124 个基因的微阵列杂交 ,杂交后的信号经扫描仪检测和计算机分析后筛选出与白斑癌 变相关的基因。结果 对口腔白斑和口腔癌基因表达谱进行分析 ,发现存在 30 个差异表达的基因 ,它们可能与白 斑癌变有关。结论 采用 cDNA 微阵列技术能成功检测出两种不同组织中多个基因的差异表达 ,为研究白斑癌变 机制提供有价值的筛选资料。 [关键词] 白斑 ;癌变 ;基因表达 ;微阵列 [中图分类号] R781. 5 [文献标识码] A [文章编号] 1003 - 1634 (2003) 08 - 0491 - 04 Study on leukoplakia carcinogenesis - related gene expression by cDNA microarray Zhou Zengtong , Tao Jiang , Zhang Qinghua , Du Yanzi , Zheng Peiz heng. Depart ment of Oral Medicine , School of S tom atology , S hanghai Second Medical U niversity , S hanghai 200011 , China [ Abstract] Objective To study the difference in gene expression between oral leukoplakia tissues and oral squa2 mous cell carcinoma tissue by microarray so as to investigate the mechanism of leukoplakia carcinogenesis. Method We studied novel gene expression by cDNA microarray method. The PCR products of 4124 genes was spotted onto a kind of chemical - material - coated - glass slide in array. Both the total RNA from 5 cases of oral squamous cell carcinoma tissues and 5cases of oral leukoplakia tissues were reversely transcribed to cDNA with the incorporation of fluorescent - labeled dCTP to prepare the hybridization probes. After hybridization , cDNA microarray were scanned for the fluorescent intensi2 ty. Leukoplakia carcinogenesis - related gene expression was screened through the analysis of difference in gene expression profiles. Result Among 4124 target genes ,there are 30 genes whose expression level differed from leukoplakia and carci2 noma tissues. Therefore , They might be associated with leukoplakia carcinogenesis. Conclusion cDNA microarray tech2 nique can simultaneously screen the different expressions of genes from 2 different kinds of tissue. Further analysis of these differentially expressed genes will be helpful for understanding the molecular mechanism of leukoplakia carcinogenesis. [ Key words] leukoplakia ;carcinogenesis ; gene expression ; microarrays 口腔白斑是国际公认的常见口腔癌前病变。由 于从癌前病变发展到癌是一个循序渐进的变化过程 , 故积极采取措施阻断白斑癌变对早期防癌尤为重要。 近 20 年来人们对口腔癌发病机制中基因调控问题进 行了深入研究 ,发现由癌前病变发展到肿瘤是一个涉 及多基因的复杂过程。对于白斑在基因水平上的某些 改变也作了研究 ,发现与口腔白斑癌变有关的基因都 不是单独起作用的 ,因此探索与癌变相关的基因群及 其网络关系显得格外重要。 DNA 微阵列 (DNA Microarray) 是近年来发展起 来的应用于分子生物学研究的一项新兴技术 ,它由特 异序列的基因连接在固相载体的特异位点上而成 ,探 针根据生物样本中的目标核苷酸而确定 ,相关的反应 结果被监测与分析[1 ] 。因其允许同时进行成千上万 个基因表达分析 ,使借助生物学通路水平的质的变化 观察疾病的发病机制、治疗反应成为可能。晚近有关 DNA 微阵列应用于临床研究的报道涉及多种疾病的 分类、危险评估、治疗反应和肿瘤诊断等 ,但复习国内 外资料未见用于白斑癌变的临床研究报告。 本研究运用 DNA 微阵列检测技术 ,研究和探索 导致口腔白斑癌变的可疑基因群 ,期望发现一些与白 斑癌变相关的未知功能的新基因 ,为今后研究防治白 斑和某些黏膜上皮来源的肿瘤提供新的靶点。同时希 望发现与白斑癌变相关的已知功能的基因 ,为进一步 研究白斑癌变分子模型和开发中药的基因干预治疗提 供实验依据。 临床口腔医学杂志2003 年 8 月第 19 卷第 8 期 J Clin Stomatol ,Aug ,2003 ,Vol. 19 ,No. 8 · 194 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
·492· 他生2的h20i生&日的19生绕8且LDn Srdl Ar3m33h19☒ 山容白西沉凯的A、M。花常视步骤禄作，社摄物督需外分 材料和方法 析及电体检测是示达到高顾量。 1组织标本收律收您我宽！年经压检辆理证实为▣ 62针制备用Cy3标记口腔密组拟总NA.Cy5怀 臣2结膜白斑的于术幻摩组帆标本见表》， 记口他白商组汉总RNA。按常规操作步程制备溪针，经GFX 表1口鬯门现际本情况 柱的化后计算探针的标记卓。将探针盐干至0，混合，打入 齿号性别年整白直太山位 感饭 20Xsx60,14gt【DNA100,1 g'mt polyA2川， 1 真的 1灯 右石表 是·中度界滑塔生 1 HEPES1川.I0sDg1,95℃2ain65C10in,以备 2 72 齿许 :唐蜂常蝴小 杂交.构次实叁鞋立进行。 女 45 1.30.5右渣 经使异常增生 6.3杂文及洗德将DNA微库列和象交探针分别在 4 男49 33 右领 轮。中度异常饼生 5T冰常中交性5mn海深针加在NA微许列上用望求片 15汉 五 传号常增生■ 时片，置于6s℃涂交14.抽来后，将我片浸在3x55+0 收集我民们1年行领领领联奔怅竹于术切除的短名组织 1%D%中509，去盖寝片，再于以上落体中没汽10n4 标木5例（见表2）。姨撞组阅为承中果发灶阳识的耳证实分 次.然后浸在0.2xsC中（室型10min×4次，5mm×5 饭为【饭触擦，标本切收后立即液氨珠存备用， in离心甩千. 表！规想标本物况 6.4图像应摆处耳 齿号性年龄州控大个©n#巴斐 理分级 圣象处理：用Ar闻aner扫描花片。ArayVion我料走 行图象处马， 】女 90.5030.$ 无 效据处理：用GeneSpring软件对数据过行标准化处理，别 无 登y1和05信号条度均小干400的甚达表达数出· 4 650.50.505: 从因墨若性军异表达的判定标准为：o>2爱1e<0. 及女4级】5通5☒无 5到m·C分C引。月时要求帝这出米的基因的表达数据 之.NA微来列所用的纪基因NA克室由中回虎力甚 在历样本中功管币复， 因中心和上海市直浪舒究所含作规供。 结 果 2.】DNA免序的客定用于点样的克降个部测序用其 序列文件与NBI的整据库过行A8T分析，得到克杀的相 1,总RNA挂提结果 关后息， 1.1ARNA紫外光0D/0Dn月260nu和283国 2.2DNA克隆的制备酒用引物进行风家扩塔日目的 敛长的光测00值.民o值介于1.-2.0间， DNA通过瑰防德凝校电体检刺℃重产物反丘，经地化和定量 1,2总NA电常电处结果有清南的2线8,18s餐花5 120.400W0量后湖解450DMS0新清中，·2D限 S条市个明显，旦将8策市的充度的为8$蕾的内倍：（见周 存。 2.多点样用Ar啊阿er椅H的NA点在FM心孩片 上，鼓叶经新外交联园定，干镜器中保存。每个克隆在花片上 甲复点样，共有4124个天。 3实验试剂Tt试剂(GoBL》:FB暖片(Tm er Deag6公可)：Cy3·dCTP [Amersham Bioocience;Cy3- dCTP(Amersham Bicecieno动；n,Cy3减gike·Q5(颜控 物，Amershem Bi如ma:迎转读试剂金()d·1 2 (Gbcrol ;CigodlT,A80. 4 Miroplate Sounring Spoctrophokmcter Power We￥.nIm·TEK INSTRUMINTS,NC:Arn Spotter (Cenention IlI Modd MSPOT 3,Serill MS0267 Moleeu r Dynames te.),金X件(mershom3e交ences Anay Soam nerl Modd a MSCAN 3.Senal MR076,Moleeuar Dytamics 同. 5款件ArnyVison就f件(oculr Dyramics公可)： saeC=l软件(Meed细uis公可》，ereSpring林杆 (lo0e(金c. 司I总NA电港刻果 6.方法 2,微件列会交技术体系险让 61总民NA址费和衡定用T箱提口腔窗组祝和 1995-2005 Tringhu TongGng Oplical Due Co iu AN ngls renwd
材料和方法 1. 组织标本收集 收集我院 2001 年经活检病理证实为口 腔黏膜白斑的手术切除组织标本(见表 1) 。 表 1 口腔白斑标本情况 编号 性别 年龄 白斑大小(cm) 部位 病理分级 1 女 69 3 ×1 右舌腹 轻 - 中度异常增生 2 男 72 2 ×1 舌背 轻度异常增生 3 女 45 1. 5 ×1. 5 右舌缘 轻度异常增生 4 男 49 3 ×3 右颊 轻 - 中度异常增生 5 男 40 1. 5 ×2 舌背 轻度异常增生 收集我院 2001 年行颊颌颈联合根治手术切除的颊癌组织 标本 5 例(见表 2) 。颊癌组织为术中原发灶组织 ,病理证实分 级为 Ⅰ级鳞癌。标本切取后立即液氮冻存备用。 表 1 颊癌标本情况 编号 性别 年龄 肿瘤大小(cm) 淋巴转移 病理分级 1 男 50 1 ×1 ×2 无 Ⅰ 2 女 69 0. 5 ×1 ×0. 5 无 Ⅰ 3 女 60 1 ×1 ×1 无 Ⅰ 4 男 65 0. 5 ×0. 5 ×0. 5 无 Ⅰ 5 女 48 0. 5 ×0. 5 ×1 无 Ⅰ 2. cDNA 微阵列所用的靶基因 cDNA 克隆由中国南方基 因中心和上海市血液研究所合作提供。 2. 1 DNA 克隆的鉴定 用于点样的克隆全部测序 ,用其 序列文件与 NCBI 的数据库进行 BLAST 分析 ,得到克隆的相 关信息。 2. 2 DNA 克隆的制备 通用引物进行 PCR ,扩增出目的 DNA ,通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物质量 ,经纯化和定量 (200 - 400 fmol/ ul) ,最后溶解在 50 %DMSO 溶液中 , - 20 ℃保 存。 2. 3 点样 用 Array Spotter 将目的 DNA 点在 FMB 玻片 上. 玻片经紫外交联固定 ,干燥器中保存。每个克隆在芯片上 重复点样。共有 4124 个基因。 3 实验试剂 Trizol 试剂( Gibco BRL) ; FMB 玻片( Turn2 er Designs 公司) ; Cy3 - dCTP (Amersham Biosciences) ; Cy5 - dCTP(Amersham Biosciences) ; spike - Cy3 或 spike - Cy5 (质控 物 , Amersham Biosciences) ;逆转录试剂盒 ( Gibicrol ) ; Cot - I ( Gibicrol ) ;Oligod( T) ;A80. 4 仪器 Microplate Scanning Spectrophotometer ( Power2 Wave x , BIO - TEK INSTRUMEN TS , INC.) ; Array Spotter ( Generation III Model # MSPO T 3 , Serial # MS0267 ,Molecu2 lar Dynamics Inc. ) ; GFX柱(Amersham Biosciences) ;Array Scan2 ner(Model # MSCAN 3 , Serial MR076 , Molecular Dynamics 公 司) . 5 软件 ArrayVision 软件 ( Molecular Dynamics 公司) ; ScoreCard 软件 ( Molecular Dynamics 公司) ; GeneSpring 软件 (Silicon Genetics) . 6. 方法 6. 1 总 RNA 抽提和测定 用 Trizol 抽提口腔癌组织和 口腔白斑组织的总 RNA。按常规步骤操作 ,抽提物经紫外分 析及电泳检测显示达到高质量。 6. 2 探针制备 用 Cy3 标记口腔癌组织总 RNA ,Cy5 标 记口腔白斑组织总 RNA。按常规操作步骤制备探针 ,经 GFX 柱纯化后计算探针的标记率。将探针抽干至 10μl ,混合 ,加入 20XSSC 6μl ,1 mg/ ml Cot ⅠDNA 10μl , 1 mg/ ml polyA 2μl , 1M HEPES 1μl ,10 %SDS 1μl。95 ℃2 min ,65 ℃10 min ,以备 杂交。两次实验独立进行。 6. 3 杂交及洗涤 将 cDNA 微阵列和杂交探针分别在 95 ℃水浴中变性 5 min ,将探针加在 cDNA 微阵列上 ,用盖玻片 封片 ,置于 65 ℃杂交 14 h。结束后 ,将玻片浸在 3xSSC + 0. 1 %SDS 中(50 ℃) ,去盖玻片。再于以上液体中浸泡 10 min ×4 次。然后浸在 0. 2xSSC 中 (室温) 10min ×4 次。500 rpm ×5 min 离心 ,甩干。 6. 4 图像数据处理 图象处理 :用 Array Scanner 扫描芯片。ArrayVision 软件进 行图象处理。 数据处理 :用 GeneSpring 软件对数据进行标准化处理 ,剔 除 Cy3 和 Cy5 信号强度均小于 400 的基因表达数据。 基因显著性差异表达的判定标准为 :Ratio > 2 或 Ratio < 0. 5(Ratio = Cy5/ Cy3) 。同时要求筛选出来的基因的表达数据 在所有样本中均能重复。 结 果 1. 总 RNA 抽提结果 1. 1 总 RNA 紫外分光 OD260 / OD280 :用 260 nm 和 280 nm 波长的光测 OD 值 ,Ratio 值介于 1. 7～2. 0 间。 1. 2 总 RNA 电泳 :电泳结果 :有清晰的 28 S、18 S 条带 ,5 S 条带不明显 ,且 28 S 条带的亮度约为 18 S 带的两倍 ; (见图 1) 。 图 1 总 RNA 电泳结果 2. 微阵列杂交技术体系验证 · 294 · 临床口腔医学杂志2003 年 8 月第 19 卷第 8 期 J Clin Stomatol ,Aug ,2003 ,Vol. 19 ,No. 8 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
法口的尽经h2店年8且5生皇第8里1Ein Sortdl A吧3ai113 ·493+ 2.1以54个点仅牺明生对职、阳性对，比率对但和 因17个表，太知功的13个《见表4)， 线性对期作参期对好数姑适行材准化处进。 起三与白陈空相关儿陆家的节内”表 2.2片内和片可聚交信号重复售的比较见图23。 IAN Pisaln g Ctrnt n表达 比较名芯片内币复点如后号的重罗性，托关采零为0. IKMe0n形03阳I ol Bvran oM上同 62且斜带为1.四，说明片内后号的重复社好。 2 NNG-021574 NTCT ocl Eison CD2知1.调 】N52714 oul BNison ME上词 4 NNG-007275 P00001 U以上.词 V4等上词 NM6价rd年heg'oll os4aDH用下 NXG-D00594 M4V0I oLorprien defr 且s1.调 NM-002995 HH28 6m灯e KMCE下d I04w3M:P04我 Fwuloli MMH2上 trihdis T 上网 2 NA-D00%I CYHA2 F词 13 U130% cd uler oumporert 2E上调 14 a 上d 0n下d 16 KM-000S29 PINI4 NFAu上词 T数IH N口LLL返 国 表4与自变相们未如财的因一表 1情a 里-A 84D 表达 医2片内杂交国号重复性比风 L.035993 e011 上调 AVT15579 厘.3刀 上调 967 门1N4 上两 -14 4 AB027440 PI2C20 上调 AF5行4位 121C2 上调 AF234155 105LG9 上两 AF224328 PIIMLS 上词 8483 FIINI5 上国 N4132 P11N19 上调 1o I0044s9 1N9 上调 29459 P123 项 12 wM23277 P89 上调 13 ATTHN m21 下透 100000 4.生物学岩息分长对口骸密组领与口2白凝组帆再着 2的 打表达水平著世楚并的地个基因遗打了相关劾构功爸的检 悟】片间南交口号重复性比较 索，发现其中7个基因已有有关报通，已有报道这些基因与 附分露、后号世骨、升连财象到队代菌如形成分幕帝刘阅 比较可一杨标本不可次杂交备号的重复性，柑关系数为0. 关 266且斜率为1.14，流明片间归号的币复性好， 玉.微序列南适的站果微序列索交用象见周4 时 论 口腔白斑作为一种典重的癌前柄变，在格床上有 相当比创L.58%一27.27)的篇变*1，严重危害 患者的身心健康。团着杜会老龄化，白斑的发病率有 升高趋劳。要了解聚个自拼绝燮过程中的业因或变， 以及停变各阶段中年康全部基因表达的动志变化，雷 要纸究的不是一个或几个业丙，而是整个基因组在从 白聚到癌的各个阶爱中上百个基因表达的动志变化， 不了解基因表达及水中成不可能理解基因世和表型问 固4雨陈列朵交图 的相互关系。本研究运用DNA徽降列技术，对白疑 用微阵列商选口腔疾组织和山监疾旁组凯表达无异2信 的可疑致癌基因进行初步第遗，并对某些己知功能的 以上的基因：共葫选出基因30个0.5约)，其中已知功作的基 可疑基因的作用作初步回顾性分析。 1995-2005 Tyinghm Tongng Opcol Dlisc Co..id AN righes renrved
2. 1 以 384 个点 (包括阴性对照、阳性对照、比率对照和 线性对照等) 作参照对原始数据进行标准化处理。 2. 2 片内和片间杂交信号重复性的比较见图 2、3。 比较一张芯片内重复点间信号的重复性 ,相关系数为 0. 9662 且斜率为 1. 03 ,说明片内信号的重复性好。 图 2 片内杂交信号重复性比较 图 3 片间杂交信号重复性比较 比较同一份标本不同次杂交信号的重复性 ,相关系数为 0. 9266 且斜率为 1. 14 ,说明片间信号的重复性好。 3. 微阵列筛选的结果 :微阵列杂交图象见图 4。 图 4 微陈列杂交图 用微阵列筛选口腔癌组织和口腔癌旁组织表达差异 2 倍 以上的基因 :共筛选出基因 30 个(0. 73 %) ,其中已知功能的基 因 17 个(表 3) ,未知功能的基因 13 个(见表 4) 。 表 3 与白斑癌变相关的已知功能的基因一览表 array-AN P384 ID Gene Category Gene- sym 表达 1 NM-000075 P02P01 cell division CD K4 上调 2 NM-021874 P07 G07 cell division CDC25B 上调 3 NM-002467 P06J14 cell division M YC 上调 4 NM-007275 P08O01 cell division FUS1 上调 5 NM-002011 P05I01 cell signaling/ cell communication FGFR4 上调 6 NM-000552 P05N13 cell signaling/ cell communication VWF 上调 7 NM-004360 P06N01 cell signaling/ cell communication CDH1 下调 8 NM-000584 P04M01 cell/ organism defense IL8 上调 9 NM-002593 P04B24 cell/ organism defense PCOLCE 下调 10 NM-002426 P04M08 metabolism MMP12 上调 11 NM-001908 P07C21 metabolism CTSB 上调 12 NM-000761 P07N08 metabolism CYP1A2 下调 13 U16306 P04 G21 cellular component CSPG2 上调 14 NM-000089 P09D14 cellular component RBBP1 上调 15 NM-001185 P05M21 cellular component AZGP1 下调 16 NM-020529 P04N14 gene/ protein expression NF KBIA 上调 17 NM-006157 P10N14 Unclassified NELL1 上调 表 4 与白斑癌变相关的未知功能的基因一览表 array-AN P384ID 表达 1 AL035593 P03O11 上调 2 AV715529 P04L22 上调 3 X95677 P11N24 上调 4 AB027440 P12C20 上调 5 AF349562 P12H22 上调 6 AF234255 P05L09 上调 7 AF228328 P11M18 上调 8 Z84988 P11N15 上调 9 X64132 P11N19 上调 10 AJ004955 P12D19 上调 11 M29469 P12D23 上调 12 M23277 P08H09 上调 13 AC007909 P04B23 下调 4. 生物学信息分析 对口腔癌组织与口腔白斑组织两者 有表达水平显著性差异的 30 个基因进行了相关结构功能的检 索 ,发现其中 17 个基因已有有关报道。已有报道这些基因与 细胞分裂、信号传导、免疫防御、细胞代谢、细胞成分等密切相 关。 讨 论 口腔白斑作为一种典型的癌前病变 ,在临床上有 相当比例 (1. 58 %～27. 27 %) 的癌变率[2 ] ,严重危害 患者的身心健康。随着社会老龄化 ,白斑的发病率有 升高趋势。要了解整个白斑癌变过程中的基因改变 , 以及癌变各阶段中细胞全部基因表达的动态变化 ,需 要研究的不是一个或几个基因 ,而是整个基因组在从 白斑到癌的各个阶段中上百个基因表达的动态变化 , 不了解基因表达及水平就不可能理解基因型和表型间 的相互关系。本研究运用 DNA 微阵列技术 ,对白斑 的可疑致癌基因进行初步筛选 ,并对某些已知功能的 可疑基因的作用作初步回顾性分析。 临床口腔医学杂志2003 年 8 月第 19 卷第 8 期 J Clin Stomatol ,Aug ,2003 ,Vol. 19 ,No. 8 · 394 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
÷494· 色家口的影学圣2店年名且直1叠第8月LDn5m133 研究结果显示，口腔梯癌与口腔白斑组织和比基 究. 因麦达存在较大的差别部分业因的表达下羽.部分 总之，白既癖变的发生，发展律往是细散内外多个 上调。在显著差并表达的基因中很多都与肿箔的发 基因结构和功能并常改变的站果，一些基因和信号通 生和发辰过程有关·例如在上的基因中，有4个基 路控制着细的扩增、分化和湖亡，在癌变发生中起着关 因与细胞分裂相关。其中CDCx是一个细胞周期磷酸 健作用。通过徽降技术可以研究组织的丛因女达请 家族，作微活依缓性细围具期蛋白激醇，有报道证明 差异，从而高通量地有效地发暖与口腔白斑癌变相关 (风B在体外有致密作：用，He?等从34对 的可疑基因件。为深入研究口腔白览高变发生机制、 结肠直肠井瘤和正常组织中袖提出DNA和RNA,分 临床诊断、预访治疗提供更全而、可靠的导向。 数用orthern bio,RT-CR,uthern blo加以校 [参考文献灯 黑，并用Western hlot对正常和肿瘤样本亚萨的置白 女达进行分析，发见C①CD女达的水平与俗成柄理 I】unWN,.we巧，VILE KE.Far山md of DNA 特狂及患者的生存情况相关联而且也与肿痛的分化 tridocen amays fer pese expreson anelesis ]BioTechniques. 250.1915):1041-v95 级划相关，其它微时列实验也有相问的站米。为了烈 】怀回偶，客复西，李祸张.门酸座利病空白译与■华有酯 察食道禁找细取癌癌相关基因的表达情况，H山等 M1.七来：中国区长技由航杜，J92. 1]Iwnd如s,egX.a at al Differtti ereedra of c女25 川含有5器个人中密相关基因的微所列进行筛边，其 xl-Gd,clivling军ca in hutan adere erciru田 中有包括CDC2sB在内的13个基因表达上网.说明 D1.Lb1200181(40:46573 该因可管会成为种墙甲期诊断的侯途华因，万一方 1I℃.imKY.Iwsn室Paflingof dferei斯md 面也证实查库列技术的有效性。 E·山drnp山网uw在ciE(C 有些基因与年胞信号传导有关，Gd等对 veradalea wih luter difcrenalis in ESCC)].CIn Canor Bea, 38侧经过子宫根治术和盆控淋已结清扫术悲者术前 201.74110:3519-2s 血家中的VWF进行测量，发更VWF与啦床病甲分期 fherpa.i-A IFPA).U-dimer (DUI,und wn Wildrund 相关联，与肿粕大小亦相关。有研究指出成纤雏细胞 roctor IvWF in patienes with operale cervicdl cascer:innsesce of 生长因子4（下GFR4在韩程癌中的表达卓为50%- 70%]也有报道证明下(G计R4的过度表达和乳像癌 u4.lul,193493)354-4. 16]Shah RN,Ibbint JC.Nido K xl al.FGiFR oveesgression in par 有关川，这些信号传导相关基因的表达异常说明白 creatic carcer is madated hy an intmrk erhuncer actnated by 玫流发的发生发辰与信号传导翰得存在一定的眠系， H51中山p.0aw00!214:位51-6. 以往的文献也在不可种类的癌组织中还实了这一点。 Torinen H.Hikirheino P.Lo IM,al.Expeexdos and gyo in ulea af hutan FGf toxpuo 4[.Paulen Eur Purf, 与组拉免疫伪海有关的基因，CSB在补癌，前列 201212》:273-85 席、肠稿，乳腺籍和胃癌中军己被检测出过度表 18]Hghex Caver TW.Tha xx t al.A noel andlicen at 8p22- 达例，任木实验中也发现有关表达。以往有研究提示 2B3 a in uren平2 oun f ullpoin B in c4rd山ec4 0aD1P0NA8SaU5A,I59g,55I21):124I0-5 CTB基因的扩增促成了卵巢密组织一些生物习性的 9】Ah由hA.《t书i.A,名m由G.t主【mne ccatring drects 成变Abdollahi等在用大白限进行的转华因实形中证 4年cId起c.甲iB8E(ChBl in Inruttned m.ovu 实了该结论。本实验发现L·&,PCOLCE众多与 en surTace epltheliel cels[1.J Soo Gyneool Irvesng.1599,6(11:32 -40 细出免夜助御及代谢有关的基因表达异常，说到白斑 l0]Ii山M.Cadherira.■aieedar farly impoel:in xdadive 棉变有必要从细电代谢和免发防闲角度加强研究， cell cell echesonj ]Arma Re Bochemt,199059:237~-252. 补渐组识巾表达下西的基因一般按认为是潜在的 Clavd CE,Nollt F Berx Ga ul.Expoeoius of th:E.cadheris. cetenin condles in1 arg neunendcnne turrours】.】Ph1. 抑制白斑密变的花因。本实单发现的表达下网茫因 141:2. 巾，D山，华因(E钙粘区白)是上皮细欣表达的怀招 Il2 Yoluyuta K,ataa's王Ed.发eidulin ef E 骚白家族中一类重要咸员，它位于上皮细外表面的 ·0e有aH9s0目oral sqmous cel0i0w0cs 细电，细监接触部分称为财着点。早期的研究证 n wtmJJ ]Dol Cron 2001(1 :66-71. 113]Aandtb P,lrebn,Gtwr M,cl u.Epiani:ourlitd u 实CDH和链蛋白复合体在人头氨部貔的原发处和转 the E.cadhere pene (CDHI)b CpG rthyltion in aoloctony 移社中下西1。妆有研究报道钙粘白在生物学 arples of aerts wth ulceratie coltis[小】ies [hmneenes 进程中拾演着一种特殊的角色如细胞分选迁谁和分 0kxr2@,352:121-6. 4位第日阑：3.6.24 化以，它在白斑癌变中究克起什么作用，有特研 199s-2005 Pinglun Tongtng Opueal Dusc Co..Lsd.AN rigles rereved
研究结果显示 ,口腔鳞癌与口腔白斑组织相比基 因表达谱存在较大的差别 ,部分基因的表达下调 ,部分 上调。在显著差异表达的基因中 ,很多都与肿瘤的发 生和发展过程有关。例如在上调的基因中 ,有 4 个基 因与细胞分裂相关。其中 CDC25是一个细胞周期磷酸 酶家族 ,能激活依赖性细胞周期蛋白激酶 ,有报道证明 CDC25B 在体外有致癌作用。Hernandez 等[3 ]从 34 对 结肠直肠肿瘤和正常组织中抽提出 DNA 和 RNA ,分 别用 Northern blot , RT - PCR , Southern blot 加以检 测 ,并用 Western blot 对正常和肿瘤样本亚群的蛋白 表达进行分析 ,发现 CDC25B 表达的水平与临床病理 特征及患者的生存情况相关联 ,而且也与肿瘤的分化 级别相关。其它微阵列实验也有相同的结果。为了观 察食道鳞状细胞癌癌相关基因的表达情况 , Hu 等[4 ] 用含有 588 个人肿瘤相关基因的微阵列进行筛选 ,其 中有包括 CDC25B 在内的 13 个基因表达上调。说明 该基因可能会成为肿瘤早期诊断的侯选基因 ,另一方 面也证实微阵列技术的有效性。 有些基因与细胞信号传导有关 , Gadducci 等[5 ]对 38 例经过子宫根治术和盆腔淋巴结清扫术患者术前 血浆中的 VWF 进行测量 ,发现 VWF 与临床病理分期 相关联 ,与肿瘤大小亦相关。有研究指出成纤维细胞 生长因子 4 (F GFR4) 在胰腺癌中的表达率为 50 % - 70 %[6 ] ,也有报道证明 F GFR4 的过度表达和乳腺癌 有关[7 ] 。这些信号传导相关基因的表达异常说明白 斑癌变的发生发展与信号传导障碍存在一定的联系 , 以往的文献也在不同种类的癌组织中证实了这一点。 与细胞免疫防御有关的基因 ,CTSB 在肺癌、前列 腺癌、肠癌、乳腺癌和胃癌中都已被检测出过度表 达[8 ] ,在本实验中也发现有关表达。以往有研究提示 CTSB 基因的扩增促成了卵巢癌组织一些生物习性的 改变 ,Abdollahi 等在用大白鼠进行的转基因实验中证 实了该结论[9 ] 。本实验发现 IL - 8、PCOLCE 众多与 细胞免疫防御及代谢有关的基因表达异常 ,说明白斑 癌变有必要从细胞代谢和免疫防御角度加强研究。 肿瘤组织中表达下调的基因一般被认为是潜在的 抑制白斑癌变的基因。本实验发现的表达下调基因 中 ,CDH1 基因( E - 钙粘蛋白) 是上皮细胞表达的钙粘 蛋白家族中一类重要成员。它位于上皮细胞外表面的 细胞 - 细胞接触部分 ,称为附着点[10 ] 。早期的研究证 实 CDH1 和链蛋白复合体在人头颈部癌的原发灶和转 移灶中下调[11 ,12 ] 。也有研究报道钙粘蛋白在生物学 进程中扮演着一种特殊的角色 ,如细胞分选、迁徙和分 化[13 ] 。而它在白斑癌变中究竟起什么作用 ,有待研 究。 总之 ,白斑癌变的发生、发展往往是细胞内外多个 基因结构和功能异常改变的结果 ,一些基因和信号通 路控制着细胞扩增、分化和凋亡 ,在癌变发生中起着关 键作用。通过微阵列技术可以研究组织的基因表达谱 差异 ,从而高通量地有效地发现与口腔白斑癌变相关 的可疑基因群。为深入研究口腔白斑癌变发生机制、 临床诊断、预防、治疗提供更全面、可靠的导向。 [参 考 文 献] [1 ] Freeman WM , Robertson Dj ,Vrana KE. Fundamentals of DNA hy2 bridization arrays for gene expression analysis [ J ] . Bio Techniques , 2000 , 29 (5) :1042～55. [2 ] 许国祺 ,李秉琦 ,李辉花奉. 口腔癌前病变 ———白斑与扁平苔藓 [ M ] . 北京 :中国医药科技出版社 ,1992. [ 3 ] Hernandez S , Bessa X , Bea S ,et al . Differential expression of cdc25 cell - cycle - activating phosphatases in human colorectal carcinoma [J ] . Lab Invest ,2001 ,81 (4) :465～73 . [ 4 ] Hu YC , Lam KY , Law S ,et al. Profiling of differentially expressed cancer - related genes in esophageal squamous cell carcinoma ( ESCC) using human cancer cDNA arrays : overexpression of oncogene MET correlates with tumor differentiation in ESCC[J ] . Clin Cancer Res , 2001 ,7 (11) :3519～25 . [5 ] Gadducci A , Baicchi U , Marrai R ,et al. Pretreatment plasma levels of fibrinopeptide - A ( FPA) , D - dimer (DD) , and von Willebrand factor (vWF) in patients with operable cervical cancer : influence of surgical - pathological stage , tumor size , histologic type , and lymph node status[J ] . Gynecol Oncol ,1993 ,49 (3) :354～8. [6 ] Shah RN , Ibbitt J C , Alitalo K ,et al. FGFR4 overexpression in pan2 creatic cancer is mediated by an intronic enhancer activated by HNF1alpha[J ] . Oncogene ,2002 ,21 (54) :8251～61. [ 7 ] Tuominen H , Heikinheimo P , Loo BM ,et al. Expression and glyco2 sylation studies of human FGF receptor 4 [J ] . Protein Expr Purif , 2001 ,21 (2) :275～85. [ 8 ] Hughes SJ , Glover TW , Zhu XX ,et al. A novel amplicon at 8p22 - 23 results in overexpression of cathepsin B in esophageal adenocarci2 noma[J ] . Proc Natl Acad Sci U S A ,1998 ,95 (21) :12410～5 . [ 9 ] Abdollahi A , Getts LA , Sonoda G ,et al. Genome scanning detects amplification of the cathepsin B gene (CtsB) in transformed rat ovari2 an surface epithelial cells[J ] . J Soc Gynecol Investig ,1999 ,6 (1) :32 ～40 . [10 ] Takeichi M. Cadherins : a molecular family important in selective cell - cell adhesion[J ] . Annu Rev Biochem ,1990 ,59 :237～252 . [11 ] Clavel CE ,Nollet F ,Berx G ,et al. Expression of the E - cadherin - catenin complex in lung neuroendocrine tumours[J ] . J Pathol ,2001 , 194 (1) :20～26. [ 12 ] Yokoyama K , Kamata N’Hayashi E ,et al. Reverse correlation of E - cadherin and snail expression in oral squamous cell carcinoma cells in vitro[J ] . Oral Oncol ,2001 ,37 (1) :65～71. [13 ] Azarschab P , Porschen R , Gregor M ,et al. Epigenetic control of the E - cadherin gene ( CDH1) by Cp G methylation in colectomy samples of patients with ulcerative colitis [J ] . Genes Chromosomes Cancer ,2002 ,35 (2) :121～6. (收稿日期 :2003 - 06 - 24) · 494 · 临床口腔医学杂志2003 年 8 月第 19 卷第 8 期 J Clin Stomatol ,Aug ,2003 ,Vol. 19 ,No. 8 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved