·710 基础研究 应用ITS-ITS2区域鉴定口腔念珠菌 2,中料院上海生命科学院上海第二医科大学健康科学研究所) 【物】目的：建立快准判念珠西的为法。方法：酒过C出O恤rCi焙养显色培养与CR 内分 装E1A皮1m.oa.m sing IIS-IIS regi a: :Cha s of ITS-ITS:re 念珠南是机会性致病真南。近年来，由于临床兔 因此，司求其它方法从分子水平进行种间及种内的分 (RNA)的内转录酒，非编再区 I tra 形的以 之珠凿在剂 用 因内外尚属空白。本实验利用CHR 确的分了分型对于临床诊断和治 CHROM 知培养基是目前临床上常用 区城是否能用来鉴定三种常见的口念珠菌，并探 301995-2005Ti03h
·基础研究· 应用 ITS12ITS2 区域鉴定口腔念珠菌 赵 民1 ,施 卫2 ,周曾同1 ,罗 氵风2 ,陈 莹2 ,张 济2 (1. 上海第二医科大学附属第九人民医院口腔内科 上海 200011 ; 2. 中科院上海生命科学院上海第二医科大学健康科学研究所) [摘要] 目的 :建立快速、准确鉴别念珠菌的方法。方法 :通过 CHROMagar Candida 培养基显色培养与 PCR 扩增 ITS12ITS2 区域相结合的方式对 13 例口腔念珠菌标本进行细胞及分子水平鉴定 ,并对 CHROMagar Candida 培 养基能否引起念珠菌 ITS12ITS2 区域碱基序列改变问题进行探讨。结果 :13 例念珠菌标本分别属于最常见的白色 念珠菌、热带念珠菌及光滑念珠菌三种类型 ,并在 CHROMagar Candida 显色培养基上分别呈现出草绿色(白色念珠 菌) 、蓝灰色(热带念珠菌) 以及紫红色(光滑念珠菌) 菌落 ;这三种念珠菌类型在 ITS12ITS2 区域的片断长度或碱基 序列上表现出特异性差异。结论 :使用 PCR 扩增 ITS12ITS2 区域的方法可以对以上三种临床念珠菌进行准确鉴定 及种内分型。 [关键词] 念珠菌 ;鉴定 ; ITS 区域 [中图分类号] R780. 2 [文献标识码] A [文章编号] 1003 - 1634 (2004) 12 - 0710 - 05 Using ITS12ITS2 region to distinguish oral Candida species ZHA O Min , S HI Wei , ZHOU Zeng2Tong , L UO Feng , CHEN Ying , ZHA N G Ji. Depart ment of Oral Medicine , the Ninth A f f iliated Hospital of S hanghai Second Med2 ical U niversity . S hanghai 200011 , China [Abstract ]Objective :To establish a rapid and accurate protocol for the classification of oral Candida species. Method : Using PCR amplification of ITS12ITS2 regions combined with CHROMagar Candida medium culture to have characterized 13 clinical isolates of Candidas , and explored whether CHROMagar Candida can induce sequence changes of ITS12ITS2 re2 gions in these opportunity fungi. Result :On the CHROMagar culture , these isolates appear to be categorized into three col2 or types , green , blue and red , respectively representing C. albican , C. Tropicalias , and C. glabrates , three most com2 mon oral fungi of clinical significance. This is further revealed by sequencing analysis of ITS12ITS2 regions of these isolates after PCR amplification , in which each fungi species shows a characteristic fragment length or sequence specificity which is not affected by the CHROMagar Candida medium culture. Conclusion :Characteristic sequence features of ITS12ITS2 re2 gions of Candida species can be utilized as molecular markers to classify clinically significant Candidas. [ Key words] Candida ; classification ; ITS region 念珠菌是机会性致病真菌。近年来 ,由于临床免 疫抑制剂、广谱抗生素、皮质类固醇激素等大量使用及 艾滋病患者的增多 ,机会性致病真菌的感染率呈明显 上升趋势。在口腔真菌感染性疾病中 ,白色念珠菌 (C. albican) 占 50 %以上。在其余病例中 ,以热带念珠 菌(C. Tropicalias) 与光滑念珠菌(C. glabrates) 占主要 部分[1 ,2 ] 。临床研究表明 :不仅不同种念珠菌在致病 性和耐药性方面存在差异 ,而且同一种内的念珠菌在 致病性和耐药性方面也存在差异。因此 ,快速针对念 珠菌感染标本进行准确的分子分型对于临床诊断和治 疗具有十分重要的意义。 CHROMagar Candida 培养基是目前临床上常用 的一种念珠菌分离和鉴定方法[3 ] 。但是 ,该方法所能 鉴定的念珠菌种类有限且无法进行种内的亚型鉴定。 因此 ,寻求其它方法从分子水平进行种间及种内的分 子分型是念珠菌临床研究及治疗所急需解决的关键问 题。ITS 区域是真菌细胞内 DNA 编码核糖体 RNA (rRNA) 的内转录间隔、非编码区 (internal transcribied spacer region) 。利用 ITS 区域进行真菌鉴定、分型是 目前的研究热点。ITS12ITS2 是最新发现的区域 ,利 用其进行曲霉 (Aspergillus) 亚型分类鉴定的研究近期 在国外已有报道[4～6 ] ,但对于念珠菌的分类鉴定目前 国内外尚属空白。本实验利用 CHROMagar Candida 培养基与 PCR 扩增 ITS12ITS2 相结合的方式对三种 口腔最常见的念珠菌进行鉴定、分类 ,探讨 ITS12ITS2 区域是否能用来鉴定三种常见的口腔念珠菌 ,并探讨 使用 CHROMagar Candida 培养基是否引起菌株 ITS12 ITS2 碱基序列改变的问题 ,从而为今后建立更加快 · 017 · 临床口腔医学杂志2004 年 12 月第 20 卷第 12 期 J Clin Stomatol ,Dec ,2004 ,Vol. 20 ,No. 12 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
生达u的学h2W升1中单n影12E10n9mmLh1正 711· 速准两的念苏诺客染的诊断和定方法览定基陆 DNn装书*列确过风AST检常与cbk面漏斥注行比对， 找出与之相似的序列纪录，国株的蜜定以最亮分的菌种决定， 材料与方法 2:?NA城甚序]分析使用Vo:lor NTI suile序列分 1.材 析俄杆利13依满株的1T5一1T区城碱料序列进行比，找出 1.1式验离株共13宋口验亮珠周满快，的果白上海知 值株何网月及相异的城基。 九人此医克口应结良有专料或冷的志者窗株经相C下时t 结 果 鉴定为9株白色老际道2休允惜老琴值2依胡市老珠能一 1.2CHRD8aurn山培养 I.CIlkOMagr Candia由折养基室定 I达国CHRO山公司)， 不可种念味齿呈现不同是色。白色念珠传呈罩绿色，完滑 1.3T51T3调用引传引物序到为 念流满早餐红色，热骨急床雨早背从色《见图1》， MITS1:5'GGAAGTAAAAGICGTAACAAGO3' ITS-5-CCTOCGTTCTTCATCOATOO3 (均由上海博重公可合成》。 2.方法 2.1念珠两分离和纯化标本检种于)保罗氏球酯T 权，持南落出现后，津取单离落移种于沙保罗氏琼霜平板，反短 5次以达到分离纯化的甘们并采州浓格石始湿整保存法保存 留究西株备同。 同I CIMer Ca希苏整要定 22丙林活化及增两始泰将吴有两株按冲于沙误罗氏 观酯平板，37心始养4搭h.扔取单前落的一半按种于YD国 2.%R扩增1T5r1T5区5 体培系水，另一平艳的于CH)2 r Candd培泰基37Cg 11511尚代R的中球抽果（见图2）， 养象h后裂安前落该色并分别收一接种环菌百移种于Y)夜 修培界基，35提动端养24h. 2.3会林南城天fDA的拙提卷但文减171，内液离 心后用IM的山烈琴洗一次，用Lae(美国，Sigmal消化 头限牛后体，用1%的D5裂解卡夏仿海仑银化法捏取 ONA+ 14R扩增1TSIT%区减CR反应体茶必体积为 s04,包活10×PCR风冲清5川200 dN TP2UT南， 传1T少1和1T出各2川，藏幢水补至0以。代R反皮在热精 商2IrI%家电这体果 环仪上进行温度新环是5性0a、0组火0572℃ 延排0s40个循环，尔后2C家特3mn延钟，CR产物经 5.DNA照基序列利定和分际 I,5X碎后糖减较检刻以NAMk:r为分子量5记化：结 IT5TCR扩塔产物讲行DNA能基序列测宁，导 果在餐外灯下观察并限相记录。 TS8品这域的NA孩基序列以行比对。·等，·9，·10、 2.5DNA碱某序测定1TS-I1S.区爱的代CR扩增产 11、·12、·13分别为89、1011、1213号两株经CH0 物进行纯化及DNA碱基序列利定， 丽Gn由培带法分G洛游4林h后，ITs~ITS区就的DNA孩 2.6LAsT序列比对将新测定的1TSIT5区减的 基序列约测序结要（见图3）。 I 5 四 e 1995-2075 Trimglua TongGm:Owica Due Co..iM AN ngker neirwd
速、准确的念珠菌感染的诊断和鉴定方法奠定基础。 材料与方法 1. 材料 1. 1 实验菌株 共 13 株口腔念珠菌菌株 ,均采自上海第 九人民医院口腔黏膜病专科就诊的患者 ,菌株经 YBC Test Kit 鉴定为 9 株白色念珠菌、2 株光滑念珠菌、2 株热带念珠菌。 1. 2 CHROMagar Candida 培养基 (法国 CHROMagar 公司) 。 1. 3 ITS12ITS2 通用引物 引物序列为 : MITS21 :5’2GGAA GTAAAA GTCGTAACAA GG23’ ITS2 :5’2GCTGCGTTCTTCA TCGA TGC23’ (均由上海博亚公司合成) 。 2. 方法 2. 1 念珠菌分离和纯化 标本接种于沙保罗氏琼脂平 板 ,待菌落出现后 ,挑取单菌落移种于沙保罗氏琼脂平板 ,反复 3 次 ,以达到分离纯化的目的 ,并采用液体石蜡覆盖保存法保存 研究菌株备用。 2. 2 菌株活化及增菌培养 将保存菌株接种于沙保罗氏 琼脂平板 ,37 ℃培养 48 h。挑取单菌落的一半接种于 YPD 固 体培养基 ,另一半接种于 CHRO Magar Candida 培养基 ,37 ℃培 养 48 h 后观察菌落颜色并分别取一接种环菌苔移种于 YPD 液 体培养基 ,35 ℃摇动培养 24 h。 2. 3 念珠菌基因组 DNA 的抽提 参照文献[ 7 ] ,菌液离 心后 ,用 1 M 的山梨醇洗一次 ,用 Lyticase (美国 ,Sigma) 消化 , 获取原生质体。用 1 %的 SDS 裂解 ,苯酚氯仿混合提取法提取 DNA。 2. 4 PCR 扩增 ITS12ITS2 区域 PCR 反应体系总体积为 50μl ,包括 10 ×PCR 缓冲液 5μl ,200μm dN TP ,2 U Taq 酶 ,引 物 MITS21 和 ITS2 各 2μl ,蒸馏水补至 50μl。PCR 反应在热循 环仪上进行 ,温度循环是 95 ℃变性 30 s、50 ℃退火 30 s、72 ℃ 延伸 30 s、40 个循环、尔后 72 ℃保持 3 min 延伸。PCR 产物经 1. 5 %琼脂糖凝胶检测 ,以 DNA Marker 为分子量标记 ,电泳结 果在紫外灯下观察并照相记录。 2. 5 DNA 碱基序列测定 ITS12ITS2 区域的 PCR 扩增产 物进行纯化及 DNA 碱基序列测定。 2. 6 BLAST 序列比对 将新测定的 ITS12ITS2 区域的 DNA 碱基序列通过 BLAST 检索与 Genbank 数据库进行比对 , 找出与之相似的序列纪录 ,菌株的鉴定以最高分的菌种决定。 2. 7 DNA 碱基序列分析 使用 Vector N TI suite 序列分 析软件对 13 株菌株的 ITS12ITS2 区域碱基序列进行对比 ,找出 菌株间相同及相异的碱基。 结 果 1. CHROMagar Candida 培养基鉴定 不同种念珠菌呈现不同显色。白色念珠菌呈草绿色 ,光滑 念珠菌呈紫红色 ,热带念珠菌呈蓝灰色(见图 1) 。 图 1 CHROMagar Candida 培养基鉴定 2. PCR 扩增 ITS12ITS2 区域 ITS12ITS2 PCR 的电泳结果(见图 2) 。 图 2 ITS12ITS2 PCR 电泳结果 3. DNA 碱基序列测定和分析 ITS12ITS2 PCR 扩增产物进行 DNA 碱基序列测定。将 ITS12ITS2 区域的 DNA 碱基序列进行比对。3 8、3 9、3 10、3 11、3 12、3 13 分别为 8、9、10、11、12、13 号菌株经 CHRO Mag2 ar Candida 培养基 37 ℃培养 48 h 后 ,ITS12ITS2 区域的 DNA 碱 基序列的测序结果(见图 3) 。 临床口腔医学杂志2004 年 12 月第 20 卷第 12 期 J Clin Stomatol ,Dec ,2004 ,Vol. 20 ,No. 12 · 117 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
712· 悠步0的度2会土山L年1】日第老单12且11n空mnmL1h￥aL2 H CTIICACTICPPTICIICTRAAGICTTGTCTIGPCTGPATIASTTAAAARAMIATTGCIG ---TGAAGTIGTTITCTAC AAAAGAAAICIIGTCTICACICMTIACITLNAARIATTIGTTEIGI 13 (-TGAAAGTTIIGAAGTIGTTTICTACTAAACAICTICNETIGCIGATIAGTILARFPRRATPTTTGTTIGIGI 0 10w 11u 120 1 140 16l 0 9 0 2TTTGCATOCACTGOGHGARCTCOCCCOCCSARACHCAOCGTTOCC DCAACONNONAAATHOING INGTAANCTCC R用TG2 TOCACTGGGFGARCTC女CO女GARAGRGAKIITTOCCCAACGRACARNACANTRCTACTFARGLRANCIOCA 13B2TIGCOCCTGGGHECTCDOCODOCGNNGNGNTIOOCOCAACSRHCAAAAAAGTAGTAARGTARACIODA 13 TTTCCATOCACNCCCAGAACICOOCCCOCCANACOCOGETCOCCON CONCVANGRATRGIABIAARGIRRACTOCR 170 10 20四 41 11 1218ACTGTETGTGTAATTAGCTOTCGEICGIETGRIPARECROCTCCTITGGAATRGAGRGATOCAOGCRCACTCCCAG )ACTGIIGTATAATTRGAAPGTICEATICGICRTAAARCACCTCCTFICCAALACACACAICONCCCCICTOCCC 0aa1号 0 21 GTAIGTAIGAAAGTTTTCACTATTAA-CIAACAA- -ICRCRTeTdGA-CTICHIAA CIITIGACIMTA--GTAATPA- TCTTGTSACAA-TATAAA nmnh ICnGgIGIchA- 4 CITTTGACTRTTA--GTAMTAA ICICIGIRCAA -CTTGPACTITIGACITD--GUVTM- CGTTCTTGAGITTICACTATTA-GTARTPA- G口A TTORIN -CTICNAGITTIGACIRTIN--CINYTA 5 GITGIICRAGTITIONCTATIA--CLARTAA- INIMOI CICYIVA 0 GTIGRAGTITTOIATM--CLAMTAA---ICIGCIOIGCA-CTTGMINA CITTIGACTRTTA--GTARTAP -TCTGSTGIGACAA--GTIGAIAFP 0 CCTICTIGAAACTTTICACIRTTCINMIARTAAA--IONCTIICRCT- GTUITNA GTT- COCTIETTENACITTIGACTRIEGIAATARTAAA--TOCTTIGACT- IAAHTRAA 12 GBICTTIGTCB3CILOCI0C0LERCTGRGARCACCACTARATTAACCRGCRGLAGAAATOGATTCAC BOM1I CGICTTTGICXTOCTCOORCICRCAACAOCTRCCAROCOOCCACTTAACOCOROCCACLRGAAATOOCMYITCMC BETCTTTUICGOCTCOCTCCOOCCACTGCRGARCRCCCRCCAFCCGOGCACTTARGCAGGCAGAGAAAT3GCA11CAC 0山caBg0 TIORACTT.TORCTTI GIAWTAA TCTCEIOIGOA TIGAUJA eJ9.205e如Jae0 ng Opic圆Dwa.i.d4We的row
· 217 · 临床口腔医学杂志2004 年 12 月第 20 卷第 12 期 J Clin Stomatol ,Dec ,2004 ,Vol. 20 ,No. 12 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
压口2形坠叠延年1之月直0生之E】a94如1时 ·713+ 迎 3. 0 m AAAATIRGTIGTAAGTTAG-AOCTCOG-GASOCTGR CCCACTGDCRANGCRASTITGITT-CANGNNIO 2 FPPRTISGTTTAATTEAG--AOCTCZGROG-GOAEBCTG3--CCCACOGOCRANGOASTITGITT-CACNACA NAATOGTTTGINAGTTTRG--AOCTCT0COG-CONLOCTOOG-OCONOOOOCRAHCANITG1TT-AGAAAPACA 4 AATIGOTIEIRNCITLG-OCICTOCOO-CCAEOCTCOG-OCOACOOOCAAROCAKTTGTTT-SRAAGHMACR OAAAITOCTICIAACTTLAC--AOCICIO-GACT-IXCAOCOCPPRGCANTTCT7I-GACH 8 ARAPTTIGTAAGTTLA-ATTCTEGG-GCARBCDAF-OXCCAOCGO PARGCANITTETTT-CVOCA BETTIAAGTTTRG--ACCOCT0GOC-CCACOCTGGG-CCCNDOROGARGCAICITICETT-CARACAARACA BRRME TOCTDOINAGTTCG--AOCCIOCDO-GOOOCTOCG-CCCACCOCCAAACCAATIGTT-CAAAGRAFRACR SAAAAT136T19TITAG--AOCI020G0G-COY33CTR3G-OCCACCOOCKCOVCEZDCTT-ACAAAAAC 因时TTT-TCTe1A-CTC-THTC1 COCOCLAOCRARG-CTT-FTA M了 AAATTG1-TN1ATA--ACCTODG3CS-ETBGEMTTGCTOOCOCCAOCRG-N2- MBANGTTIBET-TTAGTTATA-ROCTCIGSOG-TAGOMTICCTCOCOCONCOAUNG-AARI01T--LAAIARAANC ZAMTTTCCI-TIAGTTATA--AOCICTOGDO-GIAGGATICCTOCCCAOCAAAG-AFR t23a(P2*AA从I1f红T(T可MIRCRCIRGICCTOC-C7GC-CCICICTCOGNOCRCAGACA (PGCASAGARAATITTARCRAOCTOCTENGTEICINCCIOCICCIOC-COGRG-ATCICICICONCCKACNCA COCNCNMTATTITAOCAACCTOCICACTONCORCACTOG1CCIC-OCAGAG-MISTCICTCNOCGASCTONICA wep2)ERMITIBSTDGTMAG.TIAG AOCTCTOCCC CCAGOCIOOG OCCOGXAAACCAATHGTT CAARGAARACA 2 218CMGh1 PTTAAGCAAICA-AI0TTC3e5TCC话T阳T1C2ILU1TG工 CSTOTECA1EAACCMOTC-3ERSYICC1TOCCCOGTONCCINCGCAANOCCHPCACTITLAC- A CDGTGOISOMITMCCNMTC-GZATGTCOCOCOCOGEOCACCINCOCAAAOCTSTTRCPSTMTACT-CC GI2 CROCICOCCMTTARGCAAICA-CTAPTGI0CTGAOGTACCTPCOFAROCTGTIGCTTTC.I-C 6112 CMICIOGOCAITAACAAIEA-GTAMTGRTOCTOOOGCNGTXACCTPCOCIPROCTIGTIRCGNCTTTLCI-CC YICR CRTGTESOBCHYTTANGCARTO-CTAMDGOCTOOOCCNOCTOCACCIRCCAAROCIIGTLAOOKI1-AT7-CC :TANGCARTCA-CTAMCACOCTID0CCAG11CXCCOKGRAHOC1TGTIRCGACTTT-BCLI-CC 8111 CATGOGTSCAA:TAAGCAAICA-CTARDGATOCTLOOGCAOCIIOCCLORGANDCTTCTLRCGACTTT-ACT-OC 9 CHIETGGTOCARCTABCONYTCA-GTAMDCIOCTIDOOCATTCRCCLMOCGANOCTICTLACCACTT-AT- 8CaT5iC0dKo10的1Ta生rtT0Tm71- 1012 CATGICGICCAMITARGCAFCA-GTARIGHIOCTTOOGCAGGTTOCCTROCGAAACC.TETIAOGFC.TTIACTT-CC CATGTGGDECHYTINGONTC-CTAIDGMIOCT.OOOCAOGTOCNCCERCCCAAACCPICTTAOGACPTIACTT 1 CAGTOGTCIAAOCAAMICA-GTARTGNZOCTICDECAOCTTOCCCROSGMOCTT3T1FOCHCTTT--0C 2-” -CAACTAA--TICT-TTNDGNDOCTOOCCAUCTTCRCCORC3GINNOC1D3ILAOO--TIACOPTT0C LREBA--T---CTAA--AT.TCT-ITAAICACOCTIOOGCAOCTIACERCRAROCIIGILPOCC.-TTACrE 1mA--1- --CAMITMA--WITTCT-TTAROGATOCITOOGCAGCTIOCIROSGANOCTIETIACGNCTTINCITTOC 尾3【TS1TS:区城的DNA碱越序州制序结是 4.BLA5T序列比从 定的结果显示：三种多味曲的1TS~1TS:区序列具有明显 将13林多林离整定为9像白色含林离(1一9号)2株妈 的种内保守性可以将三种念联殊菌复比区分。另外9休 市含道(10-11号)2候光洲之珠窗213号)， 自色念味南的TS~T品区序列有的完全一致，有的出现 讨 论 12个碱其的整异2株热带念味菊的1TS-1T区序列 完全致2林光带老沫菌的ST品区序列有3个碱 CHROMgar C也格养基用于念珠商分离和鉴定， 基的差异。提示S品区序列不仅可将三种念珠菌 优点是使川力使转点是只对白色念珠菌（节缺色）和热 聚定到种，而且可根好减丛序列的差异进行和内分型。 念珠药（蓝灰色》特异性和酸感性较高，准确率和特异 89和·8、·9：1011和“10、11：1213和12、15分 性均大于少%但光礼之沐卤可显示装色咸粉色、白色， 别为2株白色念味南2株热带念味南2株光滑念味南使 因北不能用于光滑念味菌等其它念珠菌的鉴定。 用CHROMar Car山出培养基前后的序列。实验表明使 念味内的DN4为半状重复下判，包括裙马28S18 川H微gar《d启养基不文变之珠菌的IS-I5 S5.8S的基因其内转求间隔区部分(1TS,和TS)进化 区序列.因此，用CHROMagr Candi山培养后无法准确 较快具有定的种问特异性和种内保守坐，可将含珠回 聚定的多味南，可可用TSIT3区验定， 袭定到种、花种。我们选月的引物为TS,和1TS,该对 本实验以NA基因内转素间隔区通用引物 引物的扩增序列包括都分1TS、5.8S和部分1T~ 代K打扩增11STS区并对增产物进行NA碱基 ITSeITS:PCR的电泳结果显示：光滑念味陶的PCR片段 测定，以期建立念珠菌分子水平的鉴定标记。其鉴定 长年明墨长于白色念味南和热带念味南，的500中左右。 基础建立在不月念珠菌核背酸序列的差异上其结果 而后两者的片受长度近似，约25到甲左右，碱基序列测 eJy2052 ng Tongtng pieal Dusc Co..上过4 rigs rererved
图 3 ITS12ITS2区域的 DNA 碱基序列测序结果 4. BLAST 序列比对 将 13 株念珠菌鉴定为 9 株白色念珠菌 (1～9 号) ,2 株热 带念珠菌(10～11 号) ,2 株光滑念珠菌(12～13 号) 。 讨 论 CHROMagar Candida 培养基用于念珠菌分离和鉴定 , 优点是使用方便 ,缺点是只对白色念珠菌(草绿色) 和热 带念珠菌(蓝灰色)特异性和敏感性较高 ,准确率和特异 性均大于 99 % ,但光滑念珠菌可显示紫色或粉色、白色 , 因此不能用于光滑念珠菌等其它念珠菌的鉴定[8]。 念珠菌的 rDNA 为串状重复序列 ,包括编码 28 S、18 S、5. 8 S的基因 ,其内转录间隔区部分(ITS1 和 ITS2 )进化 较快 ,具有一定的种间特异性和种内保守性 ,可将念珠菌 鉴定到种、亚种。我们选用的引物为 ITS1 和 ITS2 ,该对 引物的扩增序列包括部分 ITS1、5. 8 S 和部分 ITS2。 ITS12ITS2 PCR的电泳结果显示:光滑念珠菌的 PCR 片段 长度明显长于白色念珠菌和热带念珠菌 ,约 500 bp 左右。 而后两者的片段长度近似 ,约 250 bp 左右。碱基序列测 定的结果显示:三种念珠菌的 ITS12ITS2 区序列具有明显 的种内保守性 ,可以将三种念珠菌彼此区分。另外 ,9 株 白色念珠菌的 ITS12ITS2 区序列有的完全一致 ,有的出现 1～2 个碱基的差异;2 株热带念珠菌的 ITS12ITS2 区序列 完全一致;2 株光滑念珠菌的 ITS12ITS2 区序列有 3 个碱 基的差异。提示 ITS12ITS2 区序列不仅可将三种念珠菌 鉴定到种 ,而且可根据碱基序列的差异进行种内分型。 8、9 和 3 8、3 9 ;10、11 和 3 10、3 11 ;12、13 和 3 12、3 13 分 别为2 株白色念珠菌、2 株热带念珠菌、2 株光滑念珠菌使 用 CHROMagar Candida 培养基前后的序列。实验表明使 用 CHROMagar Candida 培养基不改变念珠菌的 ITS12ITS2 区序列。因此 ,用 CHROMagar Candida 培养后无法准确 鉴定的念珠菌 ,可再用 ITS12ITS2 区鉴定。 本实验以 rRNA 基因内转录间隔区通用引物 PCR 扩增 ITS12ITS2 区 ,并对扩增产物进行 DNA 碱基 测定 ,以期建立念珠菌分子水平的鉴定标记。其鉴定 基础建立在不同念珠菌核苷酸序列的差异上 ,其结果 临床口腔医学杂志2004 年 12 月第 20 卷第 12 期 J Clin Stomatol ,Dec ,2004 ,Vol. 20 ,No. 12 · 317 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
。714· 他这1的号坐大H里2月说h1正里Lan9aD3LL通12 慢性牙龈炎及慢性牙周炎治疗前后患牙龈沟液中 tPA及PAI活性的比较 门福华陈群赵成 (福建医科大学用属口腔医院福建摇州350002) 「摘要】日的：比较慢性场服炎授性牙周贵惠牙治疗筒后根沟液中下PA及A清性。方法：这群慢性根我 《=2)及慢性牙周类口=5)患牙两组，在治疗前及当疗后收集侧沟液(GCF)并记菜整床鲁标用发色底物法测 定GCF中卜A及PAI的活性，结是：PA活性在牙服卖用当疗前后差异无慧著性，在牙周卖组治疗筒后笼异有 是养性，PA括性在牙黑卖服及牙网卖拥始疗前后差异物有短善性，PAVFP队比值在牙调我细治疗筒后差异有是 著性牙根炎组治疗前后差异无最著性，结论：！可以作为新牙服瓷建程度及治疗效果较为客覆的指标，牙周 发组中治疗后A矿rA最著降条的常位是否预示授差的预后，尚而连一步氯向研究， 天健词】阻积型纤溶南原激话剂，好溶南厚霜靖剂期制剂：根肉液：牙周病活动期 [中图分类号】71.4【义献标买码】A 1文章编号11000,16342004012-0714-00 Comprias the acthity ftiu女miegrs acthater (PA)and内mingra acthater iahiboe(PA身ingingr al crevkular fluid before aad after trratment from chreak ginghitis and chronk periodaatitis Y.N Frhua.CMAN Qne.ZRAO Yie.Deparimew 30002.Cuni [Absract ojecthe :To investigate the actinity of tPA and PAI before and after initial penedortal thenagy in ping" tionts were sclacted and eerigneed initial per cular tud from 80 snes were collected bofone en.:The re sults showed thet thete wirs ro sigrificast dffer of PA befoee ad after treatmest in gingivitis but dl before and after treatment both in gingvitis a ad自er treatme罐enedonuitis,bm网n grgvitis.Cdsa1TMs达id女ated the activity of PAI moy be ob女 Key weeds]tiou-lype plriminopen actiaor,plririnogen actnaor inhbiloe;gingival eeviclir fuid:penodor tal dsease activty “基金项：教容落学国国人员科精们局精金使陆明1指外可面0站7号》 刚建省黄有厅利研器金班助顶目OAe的 准确可常。因此该方法在对雀床念珠面感染的鉴定及 22 II口℃.DD.attar MM.ed,atien of med与 流行病学分析，筛选突变株等方面具有重要意义。 ingonan yors uning PCR-haned deteton of DNA sopence pol 【参考文献1 merphurs in the interal traracnbed pucer 2 aegion of the INA 】像空美胡碧单成人口整老珠菌感兔后感国素的多元行新小 r1.1nMt2003449:236e.10 [Trais heary.Per C.Im.t a.Identecation of Apergllas 中事口2医字柔表1稀4100-41， 2】修容美，南塑草口胶之珠图及其监病性的顺究门.中华口腔属 4.20023料40：1510.5. 学条志，号13》：0,11. 】Willinger B,ehC.Scitah B,d.of cand血 ous Medically Ingerta国Candida Species in Cincal5ncam年 ID).a now chromogenic mdian for pesargtive iertrication of Cendide ec5.m6on0CH0道Ca由L】0n 4337472 cwt23001,34啡：3号1，头 andida and I 4]t由幻，×r恤Y,Nalaaprhi S,t.Multplex FCR uing inter w1时2m解gdtd女科 Ye☆tfication of yeind spociJ.on Cn Micrebe Antinicreb0g92(1月s·10. con8 yead rara巾，」Micmb,20,30》:617- 收编日嗣：2004.0%：28
慢性牙龈炎及慢性牙周炎治疗前后患牙龈沟液中 t2PA 及 PA I 活性的比较3 闫福华 ,陈 群 ,赵 欣 (福建医科大学附属口腔医院 福建 福州 350002) [摘要] 目的 :比较慢性牙龈炎、慢性牙周炎患牙治疗前后龈沟液中 t2PA 及 PAI 活性。方法 :选择慢性龈炎 (n = 28) 及慢性牙周炎(n = 52) 患牙两组 ,在治疗前及治疗后收集龈沟液 ( GCF) 并记录临床指标 ,用发色底物法测 定 GCF 中 t2PA 及 PAI 的活性。结果 :t2PA 活性在牙龈炎组治疗前后差异无显著性 ,在牙周炎组治疗前后差异有 显著性 ; PAI 活性在牙龈炎组及牙周炎组治疗前后差异均有显著性 ; PAI/ t2PA 比值在牙周炎组治疗前后差异有显 著性 ,牙龈炎组治疗前后差异无显著性。结论 :PAI 可以作为判断牙龈炎症程度及治疗效果较为客观的指标 ;牙周 炎组中治疗后 PAI/ t2PA 显著降低的部位是否预示较差的预后 ,尚需进一步纵向研究。 [关键词] 组织型纤溶酶原激活剂 ;纤溶酶原激活剂抑制剂 ;龈沟液 ;牙周病活动期 [中图分类号] R781. 4 [文献标识码] A [文章编号] 1003 - 1634 (2004) 12 - 0714 - 03 Comparion the activity of tissue plasminogen activator ( t2PA) and plasminogen activator inhibitor ( PAI) in gingi2 val crevicular fluid before and after treatment from chronic gingivitis and chronic periodontitis YA N Fu2hua , CHEN Qun , ZHA O Xin . Depart ment of Periodontology , School of S tom atology , Fujian Medical U niversity , Fuz hou 350002 , China [Abstract ]Objective :To investigate the activity of t2PA and PAI before and after initial periodontal therapy in gingi2 val crevicular fluid from chronic gingivitis and chronic periodontitis. Method : Seven gingivitis and thirteen periodontitis pa2 tients were selected and experienced initial periodontal therapy. Gingival crevicular fluid from 80 sites were collected before and after treatment , which includes 28 sites from seven gingivitis , 52 sites from thirteen periodontitis. Result : The re2 sults showed that there was no significant difference of the activity of t2PA before and after treatment in gingivitis but there was significant differeoce before and after treatment in periodontitis sites ; there was significant difference in PAI lev2 el before and after treatment both in gingivitis and periodontitis. The ratio of PAI/ t2PA was significant differences before and after treatment in periodontitis , but not in gingivitis. Conclusion : This study indicated the activity of PAI may be ob2 jective indicator to judge the inflammation of periodontium and treatment effect. The decrease of the ratio of PAI / t2PA in periodontitis warrants further investigation via longitudinal studies to assess whether it can be used as an indicator of the poor prognosis. [ Key words] tissue2type plasminogen activator ; plasminogen activator inhibitor ; gingival crevicular fluid ; periodon2 tal disease activity 3 基金项目 :教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(教外司留[ 2000 ]367 号) 福建省教育厅科研基金资助项目(JA00208) 准确可靠。因此该方法在对临床念珠菌感染的鉴定及 流行病学分析、筛选突变株等方面具有重要意义。 [参 考 文 献] [1 ] 徐岩英 ,胡碧琼. 成人口腔念珠菌感染易感因素的多元分析[J ] . 中华口腔医学杂志 ,1996 ,(1) :40 - 41. [2 ] 徐岩英 ,胡碧琼. 口腔念珠菌及其致病性的研究[J ] . 中华口腔医 学杂志 , 1997 ,(3) :180 - 181. [ 3 ] Willinger B , Hillowoth C , Selitsch B , et al. Performance of candida ID , a new chromogenic medium for presumptive identification of Candida species , in comparison to CHROMagar Candida [J ] . J Clin Microbiol ,2001 ,39 (10) :3793 - 5. [ 4 ] Fujita SI , Senda Y , Nakaguchi S , et al. Multiplex PCR using inter2 nal transcribed spacer 1 and 2 regions for rapid detection and identifi2 cation of yeast strains[J ] . J Clin Microbiol ,2001 ,39 (10) : 3617 - 22. [5 ] Chen YC , Eisner JD , Kattar MM ,et al. Identification of medically important yeasts using PCR2based detection of DNA sequence poly2 morphisms in the internal transcribed spacer 2 region of the rRNA genes[J ] . J Clin Microbiol ,2000 ,38 (6) :2302 - 10. [6 ] Travis henry , Peter C , Iwen , et al. Identification of Aspergillus Species Using Internal Transcribed Spacer Regions 1 and 2[J ] . J Clin Microbiol , 2000 ,28 (4) :1510 - 5. [ 7 ] Morace G , Sanguinetti M , Posteraro B , et al. Identification of Vari2 ous Medically Important Candida Species in Clinical Specimens by PCR2Restriction Enzyme Analysis [ J ] . J Clin Microbiol , 1997 , 35 (3) :667 - 672. [8 ] Yucesoy M , Marol S. Performance of Chromagar candida and BIG2 GY agar for identification of yeast species [J ] . Ann Clin Microbiol Antimicrob ,2003 ,29 ,2 (1) :8 - 10. 收稿日期 :2004 - 06 - 28 · 417 · 临床口腔医学杂志2004 年 12 月第 20 卷第 12 期 J Clin Stomatol ,Dec ,2004 ,Vol. 20 ,No. 12 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved