·34· 生东的张坠叠志达王2且算19参直1直LnmL21103 口腔白念珠菌基因型分析及临床意义 沈雪敏，唐用瑶周曾同 [摘要]的可究不门口腔需赖州白念床的分高株的基因型特点。左法采用计辩机系筑箱明随机扩 消多老性DN八《民AD)分析利健城人和附限树患者口腔的33株老床菌南株进行基因分型。益3派床伪林中 6株技邃定为白之菌其会2保为热市色珠檀，自之菌民A0分析其日瑰2和A)市型，扇“首群魁与口腔 念珠齿病组付白多填病能民A指纹用无明显相似性。，结论不可甚因型白念位的定雀可作与口腔结校转的种 莞有关· [关键问]白必珠菌：整因分型：口腔路璃 [中图分费号】Q939.5R780.21文献标识码]A【文泰输号】109-1634(203》07.03叫-04 The aaslysis of grnotype of aral Caadit albicans aad its clinical ingdications Shew Iuwn,Tang Guyv. Zhou Zgrong.Teparrment (raf Madichve.Nro Bople's fsspita.Schoo Saomolegr.Shaugho Sernnd Medical Uutuerery.Shovghal 2000111.Chiag [Abtrac To ess the gemlypie characterisies of ond Candids alhicans islles fom dierent ond muoal disease patients Metbud C甲ue-asied random ar年ed polymomphie DA(民APD)slyss was applied o fingerpnat 38 oral Candda s islated from heatly carers and oeal atunsl dce palients Besdl Thiry-six ins wene iderificd as Candid albicans and the other two were Candida tnpicalis Taenty-on gtypes were oh tined in 36 Candiib alhicams ins hy RAP)analysis There was little smilrity hetwoen RAPD finyrprints uf ahoperic ns nf hehen planus and oral candicis gmp Candn The mlninatioe of fferen eroype of Cndich alh出ns mary be telated io the vane的国aral munsd diae I Key war封ndi:h alhicans,elp笔：oral mucnsl diseae 白念珠菊（简称自念）卤株何的差异以往土要瓷 抹，其中4林分高自2例售者不可的粤秋川用：山腔下丽 靠表型(otype)特征来区分，但表型分型存在鉴别 (:1nw,1門组：0人4株北6依分离白2例步者不 力两重复性差、实验结果变异大等缺点川。近年来， 月的忠第时期， 以分子生物学技术为基出的延同分平(xype)克限 2标本紧集方法N组▣腔标本用含漱浓指法深集LP 组0汇组口腔标木同棉试涂瑞法采集。 了表型分型的铁点，披广泛应用于评价菌株何的相关 关系PI,木实验采用随机扩增多态性DNA(random 3.菌株墨定、侵存采集山腔标本经地化培泰，并经牙 管厅相子彩城实验，C等母鉴定东姊对首株进行空定， amplified polymorph加eDNA,RAPD分析，对健康人和 最后采用浅棒石始压重保存法保存四种 黏棋利患者口腔的白么自分离株进行基因分重，观察 4基国分型 从不可种类黏膜病惠者口散采集的白念會株基因型特 41DNA制备保存值株经增能培我，首先用4ml预处 点，深时白念基因型与素便响临床表现的关系。 迎液(0.01MDTA,0.0SMTs-pH7.50.28MB- 所基乙醇3订解行0幽建行预空理。然后根君Leurg等 材料和方法 散通的白色细塑NA挂是方法进行NA别答川，并用分光完 1,种满株按蓝满林米源分为3报：共生情(em 度法测定DNA刘度和含量。 N)用：7人7林，几0款林满ord card山s,OC组：15人1T 42RAPD分折 42,IP℃R扩增：代家反体系总体积为50口也析Sd 作者单收：011上海，上为弟二医科大学别属莫九人民风院、口 R援冲液(10×，0,5M-0.1MTa-p☒.3动2回 空配学航口健内形 1dNTP5mMMC2,.5U制情.句C和C各1， 1HrhK.s由K Recherkal and dir里Pcters infecing o ainde and methyl mereptan hy oedl hocmer1]Dra Micmhel 国士rnPa由国Fs中Jkne士d,12,349y n4ue,1w0.5:1932D1. 7含3-29. S们马按能，价未一，朱片，养.与期家制量口典的相关研究 dearnex01-tDel」，198,2830月-3l9. U川.修休口壁民学象去2002：102一103. 1收5日月：203.04.8 6]Ferson S.Tdind Mn.Cwmon R.et a.The frmotionof hydm e5-2005T5it了egfoug C小WDga,l4Weu起1d
口腔白念珠菌基因型分析及临床意义 沈雪敏 ,唐国瑶 ,周曾同 [摘 要] 目的 研究不同口腔黏膜病白念珠菌分离株的基因型特点。方法 采用计算机系统辅助随机扩 增多态性 DNA(RAPD) 分析 ,对健康人和黏膜病患者口腔的 38 株念珠菌菌株进行基因分型。结果 38 株菌株中 36 株被鉴定为白念菌 ,其余 2 株为热带念珠菌。白念菌 RAPD 分析共出现 21 种 RAPD 带型。扁平苔藓组与口腔 念珠菌病组间白念致病菌 RAPD 指纹图无明显相似性。结论 不同基因型白念菌的定植可能与口腔黏膜病的种 类有关。 [关键词] 白念珠菌 ;基因分型 ;口腔黏膜病 [中图分类号] Q939. 5 R780. 2 [文献标识码] A [文章编号] 1003 - 1634 (2003) 07 - 0394 - 03 The analysis of genotype of oral Candida albicans and its clinical implications S hen X uemin , Tang Guoyao , Zhou Zengtong. Depart ment of Oral Medicine , Ninth People’s Hospital , School of S tom atology , S hanghai Second Medical U niversity , S hanghai 200011 , China [ Abstract] Objective To assess the genotypic characteristics of oral Candida albicans isolates from different oral mucosal disease patients. Method Computer - assisted random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was applied to fingerprint 38 oral Candida strains isolated from healthy carriers and oral mucosal disease patients. Result Thirty - six strains were identified as Candida albicans and the other two were Candida tropicalis. Twenty - one genotypes were ob2 tained in 36 Candida albicans strains by RAPD analysis. There was little similarity between RAPD fingerprints of pathogenic strains of lichen planus group and oral candidiasis group. Conclusion The colonization of different genotype of Candida albicans may be related to the variety of oral mucosal disease. [ Key words] candida albicans ; genotyping ; oral mucosal disease 白念珠菌 (简称白念) 菌株间的差异以往主要依 靠表型(Phenotype) 特征来区分 ,但表型分型存在鉴别 力弱、重复性差、实验结果变异大等缺点[1 ] 。近年来 , 以分子生物学技术为基础的基因分型(genotype) 克服 了表型分型的缺点 ,被广泛应用于评价菌株间的相关 关系[2 ] 。本实验采用随机扩增多态性 DNA (random amplified polymorphic DNA , RAPD) 分析 ,对健康人和 黏膜病患者口腔的白念菌分离株进行基因分型 ,观察 从不同种类黏膜病患者口腔采集的白念菌株基因型特 点 ,探讨白念基因型与黏膜病临床表现的关系。 材料和方法 1. 实验菌株 按照菌株来源分为 3 组 :共生菌 (Normal , N) 组 :7 人 7 株 ;口腔念珠菌 (oral candidasis , OC) 组 : 15 人 17 作者单位 :200011 上海 ,上海第二医科大学附属第九人民医院、口 腔医学院口腔内科 株 ,其中 4 株分离自 2 例患者不同的患病时期 ;口腔扁平苔藓 (lichen planus , L P) 组 :10 人 14 株 ,其中 6 株分离自 2 例患者不 同的患病时期。 2. 标本采集方法 N 组口腔标本用含漱浓缩法采集 ;L P 组、OC 组口腔标本用棉拭涂擦法采集。 3. 菌株鉴定、保存 采集口腔标本经纯化培养 ,并经芽 管、厚壁孢子形成实验、YBC 酵母鉴定系统对菌株进行鉴定。 最后采用液体石蜡覆盖保存法保存菌种。 4. 基因分型 4. 1 DNA 制备 :保存菌株经增菌培养 ,首先用 4 ml 预处 理液(0. 01 M EDTA ,0. 05 M Tris - HCl p H 7. 5 ,0. 028 Mβ- 巯基乙醇) ,37 ℃孵育 30 min 进行预处理。然后根据 Leung 等 报道的白念细胞 DNA 抽提方法进行 DNA 制备[ 3 ] ,并用分光光 度法测定 DNA 纯度和含量。 4. 2 RAPD 分析 4. 2. 1 PCR 扩增 : PCR 反应体系总体积为 50 ul ,包括 5ul PCR 缓冲液(10 ×,0. 5 M KCl - 0. 1 M Tris - HCl ,p H8. 3) 、200 uM dN TP、5 mM MgCl2 、1. 5 U Taq 酶、引物 C1 和 C3 各 1 ul、 [ 4 ] Yaegaki K , Sanada K. Biochemical and clinical factors influencing o2 ral malodor in periodontal patients[J ] . J Periodontol , 1992 , 63 (9) : 783～789. [ 5 ] 马骏驰 ,俞未一 ,朱玲 ,等. Halimeter 与嗅觉测量口臭的相关研究 [J ] . 临床口腔医学杂志 ,2002 ,2 :102～103. [ 6 ] Persson S , Edlund MB , Claesson R , et al. The formation of hydro2 gen sulfide and methyl mercaptan by oral bacteria[J ] . Oral Microbiol Immuunol , 1990 ; 5 :195～201. [7 ] Tonzetich J . Oral Malodor : An indicator of health status and oral cleanliness[J ] . Int Dent J ,1978 ; 28 :309～319. (收稿日期 :2003 - 04 - 08) · 493 · 临床口腔医学杂志 2003 年 7 月第 19 卷第 7 期 J Clin Stomatol ,J ul ,2003 ,Vol. 19 ,No. 7 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
隆口2学会力2m1年T口龙L2是02且ae山01，L19.7 395 0吧NA模版，引物序列为C(5”-ACGGTACACT.3): C45'.GTTT0CGCC.》周。在段扩增民《1FM448 中，搜以下步W讲行反成：4C1m鱼，36℃mn:72C2叫n. 共45个周期最后一个轿环2C廷并10m,AC起存，在棒 次℃家反应中，均设置用性对蹈， 4.2.2CR增产物在2)琼价能TAE凝交中比 沐，以100单棉度的eXV为DNn分了量标记. 4.2.3用数码成像分析系禁（国5除金us对电沐 证胶摄但并讲行分所，流分析系笙修以各电改条替的位置作 2927的b11为1例肩平否藓步者不同时期的分离株 为参慧计算任意2个电狱道的相根新数(simlarity coefficert, 22和04为为1例展平有恶者不时期的分离怀。M SAB),SAB值越大说明内着家性越五，若8值0.8，则可 为D则A分「量记. 认为这两株商株具有基因门添性并取定此值(S=0.3影作为 图！LP细南株A四抽这图 票限值将具有水因可源性的橘林分为若1铁(du4, 表217组立急州白第数(8单 4.2.4票格拉盛上还验条件常罗R4D分析，牌特 尾里0线4)e1092106011224n3 RA的重复性. 0140.51310.314.33050.1.2.4 7R日·a.为369.002507.2？取35 结果 0000495046040,490日 as3I0TaV知 0.04.g50450.日B.506日 07.3079.00 4.4504s045t.430日 1.葡候整定结果共生葡和口2念珠菌期组各有1株图 06最37000,95050.9财·0500.64.%07 棕枝统定为然带急珠两，其条站株能株技金定为白急O心杭 0110190.6050.464.0·0.76.6044 离林恒括见是1，其余的果略)。 g1.2901T0.50430.4月4.4%015·8.00.40 042901T4,0470434.的0150.0-00 麦1门整味南州OC3南族 0则重40190.6563u6的.704H0.40.0· 饰校的母不象日用要官·牙数型子r融号整定 准：想第.s,黑排到华四同生2喜，阳为局一载。 第就翰高 圣定清果 格值长.5，两得同琴因图性经丘， 00.1.19 5554.7451 白名 2.30℃组（见图2,3）：该组向佛共出现4个按：d(013, 000 00.2.2 555457411 白念 016 00.7.5 + 555457411 自念 01402.035,036号)：0(009,010号)：f1007.016.025,033 C0) 60.2.2 555457411 白 号》：g015019.们4号)：共余2妹自色具有各白前的蓝因 010 g0.3.17 555457411 白含 型，园片系沉白念共出现6个其因型， 013 00.3.29+ 535457411 白含 014 00.6.7 555457411 白2 015 00429 + 535457411 白色 019 60.71号 55457411 白多 023 0.s.11 5T5557019 帝 014 0.s.24 55457411 白多 025 00.9.6 + 5554S7411 白含 026 00.9.6 555457411 白念 032 00.t1.6 555457411 白色 oti 011.294 55457411 白色 035 01.1.9+ 555457411 白念 0以524为1例之几南痛岳不4D时对的分商林25陵零 061】13+ 555457411 白 宁若布多麻南，从为DA针了量标了 图】OC组饷杭RAD指饮图 杆：“+南移成劳管，“。“粒木移域安管， :“+扣形农臀角丝，有属运厚维很子，“。“指形成附角线， 懂01站sm痛 任未出现冢张子， ©：“白念指白念球角.片骨热港念休黄， 2.花因分型 21N组：RAD沿纹图5B值均E小表细r株自多伯 越因型各不相问。 22LP组（见图1）装组自株的54H值见表2从表2可 着出，流组共出现」个族：a(00820,27.029号)：b(004和 022号)：c011和08号)，其会6候白含的花以型各不相叫， 0?16为1例之民商痛安看不时剧的分离株，M为 因此北该组山之共出璞9个甚因型， NA分了量标记： 图3C粗饷株AD指仪图 c1995-2005 Tmmgka Tovgfang Opvical Dsc Co..Lnd.AN ngius reserved
100 ng DNA 模板。引物序列为 C1 (5’- ACGGTACACT - 3’) ; C3 (5’- GTTTCCGCCC - 3’) [ 4 ] 。在 PCR 扩增仪 ( HEMA 480) 中 ,按以下步骤进行反应 :94 ℃1 min ;36 ℃1 min ;72 ℃2 min。 共 45 个周期 ,最后一个循环 72 ℃延伸 10 min ,4 ℃保存。在每 次 PCR 反应中 ,均设置阴性对照。 4. 2. 2 PCR 扩增产物在 2 %(w/ v) 琼脂糖 TAE 凝胶中电 泳 ,以 100 bp 梯度的 Marker XIV 为 DNA 分子量标记。 4. 2. 3 用数码成像分析系统(美国 Sygene Genius) 对电泳 凝胶摄照并进行分析。该分析系统能以各电泳条带的位置作 为参数计算任意 2 个电泳道的相似系数 (similarity coefficient , SAB) 。SAB 值越大说明两者亲缘性越近 ,若 SAB值 ≥0. 8 ,则可 认为这两株菌株具有基因同源性 ,并限定此值 (SAB = 0. 8) 作为 界限值将具有基因同源性的菌株分为若干族(cluster) [ 1 ,5 ] 。 4. 2. 4 严格按照上述实验条件重复 RAPD 分析 ,检验 RAPD 的重复性。 结 果 1. 菌株鉴定结果 共生菌和口腔念珠菌病组各有 1 株菌 株被鉴定为热带念珠菌 ,其余 36 株菌株被鉴定为白念 (OC 株 菌株概括见表 1 ,其余结果略) 。 表 1 口腔念珠菌病组(OC) 菌株 菌株编号 采集日期 芽管a 厚壁孢子b YBC 酵母鉴定 系统编码 鉴定结果c 005 00. 1. 19 + + 555417451 白念 007 00. 2. 2 + + 555457411 白念 016 00. 7. 5 + + 555457411 白念 009 00. 2. 24 + + 555457411 白念 010 00. 3. 17 + + 555457411 白念 013 00. 3. 29 + + 555457411 白念 014 00. 6. 7 + + 555457411 白念 015 00. 6. 28 + + 555457411 白念 019 00. 7. 19 + + 555457411 白念 023 00. 8. 17 - - 575557015 热带 024 00. 8. 24 + + 555457411 白念 025 00. 9. 6 + + 555457411 白念 026 00. 9. 6 + + 555457411 白念 032 00. 11. 6 + + 555457411 白念 033 00. 11. 23 + + 555457411 白念 035 01. 1. 9 + + 555457411 白念 036 01. 2. 13 + + 555457411 白念 注 :a :“+ ”指形成芽管“; - ”指未形成芽管。 b :“+ ”指形成假菌丝 ,并有顶端厚壁孢子“; - ”指形成假菌丝 , 但未出现厚壁孢子。 c :“白念”指白念珠菌“热带”指热带念珠菌。 , 2. 基因分型 2. 1 N 组 :RAPD 指纹图 SAB 值均显示该组 6 株白念的 基因型各不相同。 2. 2 L P 组(见图 1) :该组菌株的 SAB 值见表 2 ,从表 2 可 看出 ,该组共出现 3 个族 :a (008、020、027、029 号) ; b (004 和 022 号) ;c (011 和 018 号) 。其余 6 株白念的基因型各不相同 , 因此该组白念共出现 9 个基因型。 029 ,027 ,020 ,011 为 1 例扁平苔藓患者不同时期的分离株 , 022 和 004 为另 1 例扁平苔藓患者不同时期的分离株。M 为 DNA 分子量标记。 图 1 L P 组菌株 RAPD 指纹图 表 2 L P 组白念相似系数(SAB) 值 菌株编号 018 017 008 029 027 020 011 022 004 003 018 - 0. 14 0. 31 0. 31 0. 31 0. 33 0. 90 0. 290. 290. 44 017 0. 14 - 0. 76 0. 67 0. 67 0. 70 0. 29 0. 27 0. 27 0. 35 008 0. 31 0. 76 - 0. 90 0. 90 0. 95 0. 46 0. 43 0. 43 0. 63 029 0. 31 0. 67 0/ 90 - 0. 90 0. 95 0. 46 0. 43 0. 43 0. 63 027 0. 31 0. 67 0. 90 0. 90 - 0. 95 0. 46 0. 43 0. 43 0. 63 020 0. 33 0. 70 0. 95 0. 95 0. 95 - 0. 50 0. 46 0. 46 0. 67 011 0. 90 0. 29 0. 46 0. 46 0. 46 0. 50 - 0. 76 0. 76 0. 44 022 0. 29 0. 27 0. 43 0. 43 0. 43 0. 46 0. 76 - 0. 90 0. 40 004 0. 29 0. 27 0. 43 0. 43 0. 43 0. 46 0. 76 0. 90 - 0. 40 003 0. 44 0. 35 0. 63 0. 63 0. 63 0. 67 0. 44 0. 40 0. 40 - 注 :SAB 值 ≥0. 8 ,菌株间基因同源性较高 ,可归为同一族。 SAB 值 < 0. 8 ,菌株间基因同源性较低。 2. 3 OC 组(见图 2 ,3) :该组菌株共出现 4 个族 : d (013、 014、032、035、036 号) ; e (009、010 号) ;f (007、016、025、033 号) ;g (015、019、024 号) ;其余 2 株白念具有各自独特的基因 型 ,因此该组白念共出现 6 个基因型。 023 ,024 为 1 例念珠菌病患者不同时期的分离株 ,023 被鉴 定热带念株菌 ,M 为 DNA 分子量标记 图 2 OC 组菌株 RAPD 指纹图 007 ,016 为 1 例念珠菌病患者不同时期的分离株。M 为 DNA 分子量标记 图 3 OC 组菌株 RAPD 指纹图 临床口腔医学杂志 2003 年 7 月第 19 卷第 7 期 J Clin Stomatol ,J ul ,2003 ,Vol. 19 ,No. 7 · 593 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
·396· 位k1的医学全九220阳年2月第192第2月】n50ad2003,.19物.2 2.4LP组与0C组间比较：通过对LP和OC组白名 3白念与引膜病临床表见的关系【P组中共出 RA即指纹图的g山法内取观梨两相白老RAPD带型无明显 现a,b,c等3个铁a族4株中的3株以及b陕所有的 相权性， 白念分别来自同一惠若，其余不能自入上述各族的白 今 论 多的基因型各不相同，表明LP组白念的分布无明显 集中趋势。由于LP是一种全身性疾病，发病机理复 1.白念与口腔黏膜病大量研究证实，白念与许 杂不同悲者的口腔局部和全身情况可能具有多样性 多口腔禁膜病有关。有些酬膜柄的场因就是白多“ 从而导致不同白念的定植。而OC组共出现d,e「4 染，如口腔念殊南病黑毛舌等：有些裕膜病，茧然白念 个族，其余2株白念具有各自牡特的基因型。d族(5 不是致病因素，但是一旦件发白念感典，则会如重病 株)为OC组中的主要基因型，可见0C组白念的分布 情，影响疗效。有学者根道，伴有白念感染的非均质型 与LP组相比具有一定的集中趋势。另外，通过对 白斑如果不及时予以抗真鱼治疗将出现始变比例的 RAD指纹图的肉眼观察LP组与OC组白念电泳带 增高。因为在这种状态下生长的白念具有史强的亚硝 型的相似性不高，说明在这两种口控黜摸病中分离到 化能力.它通过产生亚硝按复合物，直接作用于口腔黯 的白色欢病菌不同提示不同基因型白念的定植可能 膜或通过与其它致梳物的相互作用微活特异的拖前基 与口腔脑膜病的种类有关。这一结论有特今后联合其 因从而导数口腔种箱的发生。有人观浆到.格床 它基因分型方法（如DNA印迹分析，基因测序等）进 上有些度烂型和光血菱绵型肩平芒群的惠者虽用各种 一步加以验证，同时深入研究LP组白念分布的多样 方法治疗但疗效差.甚至很难愈合经查这两型扁平 性与湛者局部和全身因素的关系。 苔髯白多感染的件发束明显高干普近型和对照短，分 州为37.5%和26.32%1。近年米.随着肿瘤的放射 「参考文献] 治疗，化学治疗，广谱抗生素，皮厦类固醇搬素和免疫 l】kaia」Vwtr-Hueel H,loPa.ertie sindlarily and 抑材剂的大量使用或道用，白念感染病例明显增多。 ph脚etypicd离yf cmme and pathepicCard由 目而己有许多抗真南药在白念感染的治疗上取得了成 dbicens isolcted foom the ordl enry IJ J Clin Miexbsdl ,1993 ,31 (120:3190-319m 功，但是随若耐药菌株的出现，治疗失敢的病例越米越 2】C,6yS,ht纽，t为ity among the在yT 多。即使同一种伴有白念感染的口腔黏膜病，抗真菌 plfed polyuorphie DNA method,muioeis cruyae cleetmophoresis. 药的疗效也可能不问，提腿我们研究这种治疗效果的 ard hrn Hot yhinin wth the mdndy pitive DNA rube Ca for fingerprining Cardd].J Clin Micruliol. 不一致性是否与白念南株特性不同有关。 1997,3549):2348-23% 2.白念基因分型用于区分白念曲株的传统方 13]Keang Leuig W.Dassannyake RS,Yau JYY,et d.Onl celnar 法是表型分型，如血清学分型，药物敏感性分型等，但 ain,pherlypic.drypic四fiks Candiei in in女 aed,dentae.xemdonc,romopharyngeal carciromo survivors ] 是表型分型鉴别力弱、重复性差的缺点限制了它的应 J0a6 crobiol,200,3g60:2219-2226. 用。从根本上讲，白念南株间的是异是由DNA核苷 酸序列的不可决定的，而它们的表型容易受外部环境 dom amplred polymorphk DNA RAPD).andlysis for genotyoio meapping of Candida slbiss sriro J Cn Lab Anal,1996,10 的影响产生变化，所以利用核甘酸序列的不同对白念 (1月：1969 进行分型是提高鉴别精度的必然趋势。许多学者 1S】Shmd】,o路E,Soll DR.Compuner:s98dmet0 ds for asess 认为RAD是一种比较理想的丛因分型方法，该方法 ing nin ndutednexs in Candida hcans by Eagerpnnting with the 快速技术简单所需的DNA模板量较少，任意1D个 modeaely repetitive qn Ca3 []J Clin Miersbd,19,28 (60:1236→1245 碱左右的东聚核苷酸链即可作为PCR引物.因此无 6]Axell T.A poposal for reclasstication of oral candidoss I.Ora 需预先知道待测苗株的基因顺序，鉴别力较强。 sa1997842):111-112. MeCullough等用丛因分型研光白念耐药性的机理， T】沙月等孙正牡较，等口2可平若阵的念录国多录卫】中 华口2配学0去，190255)：297. 发现耐药茵株与圾感茵株的基因组成不同，为开发新 $MeCullugh M,Cemurs KV,Slevera DA.Molecular and phenr 型有效的抗真菌药提供了基础研究依据。我门应用 typc choracterination c pnotypic Candida ahicans ahgmups and RAPD分型法家LP患者，OC患者和健康人的白念 comperien uith Candida dubiniersis and Candida seilaoidea IJ J Gia6:d.199372):417:-421 分离株的基因问源性，以及同组各芮株间的基因问源 (收日期：2003-04-16) 性。 C1995-2005 Trimgha Tovgfoang Opncal Disc Co..Lid.ANl rights rererved
2. 4 L P 组与 OC 组间比较 :通过对 L P 组和 OC 组白念 RAPD 指纹图的双盲法肉眼观察 ,两组白念 RAPD 带型无明显 相似性。 讨 论 1. 白念与口腔黏膜病 大量研究证实 ,白念与许 多口腔黏膜病有关。有些黏膜病的场因就是白念感 染 ,如口腔念珠菌病、黑毛舌等 ;有些黏膜病 ,虽然白念 不是致病因素 ,但是一旦伴发白念感染 ,则会加重病 情 ,影响疗效。有学者报道 ,伴有白念感染的非均质型 白斑如果不及时予以抗真菌治疗 ,将出现癌变比例的 增高。因为在这种状态下生长的白念具有更强的亚硝 化能力 ,它通过产生亚硝胺复合物 ,直接作用于口腔黏 膜或通过与其它致癌物的相互作用激活特异的癌前基 因 ,从而导致口腔肿瘤的发生[6 ] 。有人观察到 ,临床 上有些糜烂型和充血萎缩型扁平苔藓的患者虽用各种 方法治疗 ,但疗效差 ,甚至很难愈合 ,经查这两型扁平 苔藓白念感染的伴发率明显高于普通型和对照组 ,分 别为 37. 5 %和 26. 32 %[7 ] 。近年来 ,随着肿瘤的放射 治疗、化学治疗 ,广谱抗生素、皮质类固醇激素和免疫 抑制剂的大量使用或滥用 ,白念感染病例明显增多。 目前已有许多抗真菌药在白念感染的治疗上取得了成 功 ,但是随着耐药菌株的出现 ,治疗失败的病例越来越 多。即使同一种伴有白念感染的口腔黏膜病 ,抗真菌 药的疗效也可能不同 ,提醒我们研究这种治疗效果的 不一致性是否与白念菌株特性不同有关。 2. 白念基因分型 用于区分白念菌株的传统方 法是表型分型 ,如血清学分型、药物敏感性分型等 ,但 是表型分型鉴别力弱、重复性差的缺点限制了它的应 用。从根本上讲 ,白念菌株间的差异是由 DNA 核苷 酸序列的不同决定的 ,而它们的表型容易受外部环境 的影响产生变化 ,所以利用核苷酸序列的不同对白念 进行分型是提高鉴别精度的必然趋势[2 ] 。许多学者 认为 RAPD 是一种比较理想的基因分型方法 ,该方法 快速、技术简单 ,所需的 DNA 模板量较少 ,任意 10 个 碱基左右的寡聚核苷酸链即可作为 PCR 引物 ,因此无 需预先知道待测菌株的基因顺序 ,鉴别力较强[4 ] 。 McCullough 等[8 ]用基因分型研究白念耐药性的机理 , 发现耐药菌株与敏感菌株的基因组成不同 ,为开发新 型有效的抗真菌药提供了基础研究依据。我们应用 RAPD 分型法观察 L P 患者、OC 患者和健康人的白念 分离株的基因同源性 ,以及同组各菌株间的基因同源 性。 3. 白念与黏膜病临床表现的关系 L P 组中共出 现 a ,b ,c 等 3 个族 ,a 族 4 株中的 3 株以及 b 族所有的 白念分别来自同一患者 ,其余不能归入上述各族的白 念的基因型各不相同 ,表明 L P 组白念的分布无明显 集中趋势。由于 L P 是一种全身性疾病 ,发病机理复 杂 ,不同患者的口腔局部和全身情况可能具有多样性 , 从而导致不同白念的定植。而 OC 组共出现 d ,e ,f ,g4 个族 ,其余 2 株白念具有各自独特的基因型。d 族 (5 株) 为 OC 组中的主要基因型 ,可见 OC 组白念的分布 与L P 组相比具有一定的集中趋势。另外 ,通过对 RAPD 指纹图的肉眼观察 ,L P 组与 OC 组白念电泳带 型的相似性不高 ,说明在这两种口腔黏膜病中分离到 的白念致病菌不同 ,提示不同基因型白念的定植可能 与口腔黏膜病的种类有关。这一结论有待今后联合其 它基因分型方法 (如 DNA 印迹分析、基因测序等) 进 一步加以验证 ,同时深入研究 L P 组白念分布的多样 性与患者局部和全身因素的关系。 [参 考 文 献] [ 1 ] Hellstein J ,Vawter - Hugart H ,Fotos P ,et al. Genetic similarity and phenotypic diversity of commensal and pathogenic strains of Candida albicans isolated from the oral cavity [J ] . J Clin Microbiol ,1993 ,31 (12) : 3190～3199. [ 2 ] Pujol C , Joly S , Lockhart SB , et al. Parity among the randomly am2 plified polymorphic DNA method , multilocus enzyme electrophoresis , and southern blot hybridization with the moderately repetitive DNA probe Ca3 for fingerprinting Candida albicans [J ] . J Clin Microbiol , 1997 ,35 (9) : 2348～2358. [3 ] Keung Leung W , Dassanayake RS , Yau J YY , et al. Oral coloniza2 tion , phenotypic , and genotypic profiles of Candida species in irradi2 ated , dentate , xerostomic , nasopharyngeal carcinoma survivors [J ] . J Clin Microbiol ,2000 ,38 (6) : 2219～2226. [ 4 ] Holmberg K , Feroze F. Evaluation of an optimized system for ran2 dom amplified polymorphic DNA ( RAPD) - analysis for genotyoic mapping of Candida albicans strains [J ] . J Clin Lab Anal ,1996 ,10 (1) : 59～69. [ 5 ] Schmid J , Voss E , Soll DR. Computer - assisted methods for assess2 ing strain relatedness in Candida albicans by fingerprinting with the moderately repetitive sequence Ca3 [J ] . J Clin Microbiol ,1990 ,28 (6) : 1236～1243. [ 6 ] Axell T. A proposal for reclassification of oral candidosis [J ] . Oral Surg 1997 ,84 (2) :111～112. [ 7 ] 沙月琴 ,孙 正 ,佐 仪 ,等. 口腔扁平苔藓的念珠菌感染[J ] . 中 华口腔医学杂志 ,1990 ,25 (5) :297. [ 8 ] McCullough MJ , Clemons KV , Stevens DA. Molecular and pheno2 typic characterization of genotypic Candida albicans subgroups and comparison with Candida dubliniensis and Candida stellatoidea [J ] . J Clin Microbiol ,1999 ,37 (2) : 417～421. (收稿日期 :2003 - 04 - 16) · 693 · 临床口腔医学杂志 2003 年 7 月第 19 卷第 7 期 J Clin Stomatol ,J ul ,2003 ,Vol. 19 ,No. 7 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved