生口年学2古年3H第3丝花第2厘sahL以n地2 ▣749▣ 中西医结合· 灯盏细辛抗白斑癌变的功效及其血管 生成机制的实验研究 周可张水龙华丽钟文静金芝贵丁操字 【摘悬】甘的评价灯盏纽辛的机密变效果井动态烈察其对意血管生成的影响，方法用 y法锈导金黄地佩颠囊白斑溶浅，以灯盛组卒干预，采用显计堂注图像分析微直管树胎体彩厂 免疫组化染色发组织病珠对超等多种方法眼合动起裂察其变化烧律，站果灯盏细辛组较模 型组白斑独变率下降1倍，正常细粮率是模型组的近4倍，M值明k高于镇型组(P<Q01), 直管面积与立管帝度比清两饥间相比P:05,但树雷微血管转形是示形态和空间构筑近以于空白 对限组。洁论灯篷细辛有佛)的防止白墙安的功放。诊药对白莲墙变过程中的血管增生扩张 无明显影啊但对直管构形空问配置和鱼管坠的完整性有保护作用，可能是话直化喷黄中药发挥抗 悠功效的“良性血管生成水础， 【关缆可】灯盗饵辛；粘限白稀，口腔：新生直管化稀理性，动物，实险 Study of resisting leukpaki cancentian and angingoiess by berh ericerumtis croc.ZHNG Siaiong.H Lr.et d.Depudmnen yf On Medkcine.Siid y Stoatlegor Shemngi Second Mieal Umemy,Shuphea 200011.Chna 【Ahfratt】Ohjeetive evaltte the effeet of resistin吧nto of herhe cnigeortis and国 argopoiess Methods Curcinomaous coaversons of apiden hemder cheek pouches indaced by Sulley wny and obetructed by herba erigemontis were sudied Ink pedurion.andyss of umaes,sesin cast fom o'microvesel,o. SMA detection and hsopotholgcol exminpon wee applied observe their chagng potter Results The ne of ledloplakia camceraon of h布enprrtis goup was on tme kwer than th核f modd pop The rato of mumd cells was abo Sour times moee thn tht of mdd -M of herba eriprortis wis higher thm thel of model (0).Thene uas m siificant dierence between angriun vessl arca and density (0). Nevertheless,the rein eag fomm of menr vessel shimwed the ils dorfigrbon ard gacous amangemer was smli to etl gmop.Conrlusims Herh erigeretis his the fiunctiom of preverting ledoplakia cancerton has m a线：日nr可larn ind中eson in the emrse of l向时laki carerreon H世，善ghe potecting function oa ango oomfgurtoe and spacious amngeme and the complete of agion vessd wal Probebly its mechanian ist prmo bood circuaion by resoing bood ss and berig angopoiess as to 民nd canoeration 【gr】non brevisapi:Leuboplakia,d:Nnin,ph文；Arimis, laboraory 口腔精段白斑既是临床常见的口腔格膜疾病， 干燥全草。人量文献报道西有扩张脑管冠脉 又是具有港在癌变倾向及高达0.9%一19.8%流变 血管和外周血管，改善微循环，塔加血篷量，神制血 率的癌前病变川。子找阻断白岚密变的有效哲物对 小板放集减低血液粘模度和血胎等药理作用棱广 防治白斑与降低口控癌的发病*有重要意义，灯盏 泛用于中风冠心病等心脑血管疾转以及口疮和牙 细辛，又名灯盘花(erta crigerontis.H由)，是菊科植 列不齐快速环治等治疗中刃，然而，对H在阻 物苹飞蓬erigron brev实pus()n对u8]的 断口腔粘膜席前病变方面的功效，及其对血管生成 影响的研究尚属空白。为此，我们采用金地鼠颠囊 片斑密变模型，用H实行干预，联合应用组织病 作者单位：11上得第二医料大学口2修学民口整内料 圆曾同蛋水之.平目.体文静！方剂书金芝光：北京大学口腔园 理，泰汁灌注，微血管树胎铸型和甲平滑肌肌动蛋白 学院诗卷形丁调字 @-MA)检测等方法进行观察研究，片在评价H C1995-2005 Tghua Yovwgfang Opnical Dise Co..Lnd AN rights rerened
作者单位 : 200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔内科 (周曾同、张水龙、华丽、钟文静) ,药剂科(金芝贵) ;北京大学口腔医 学院特诊科(丁瑞宇) ·中西医结合· 灯盏细辛抗白斑癌变的功效及其血管 生成机制的实验研究 周曾同 张水龙 华丽 钟文静 金芝贵 丁瑞宇 【摘要】 目的 评价灯盏细辛的抗癌变效果并动态观察其对癌血管生成的影响。方法 用 Salley法诱导金黄地鼠颊囊白斑癌变 ,以灯盏细辛干预 ,采用墨汁灌注图像分析、微血管树脂铸形、α2 SMA 免疫组化染色及组织病理对照等多种方法联合动态观察其变化规律。结果 灯盏细辛组较模 型组白斑癌变率下降 1 倍 ,正常细胞率是模型组的近 4 倍。α2SMA 值明显高于模型组 ( P 0105 ,但树脂微血管铸形显示形态和空间构筑近似于空白 对照组。结论 灯盏细辛有确切的防止白斑癌变的功效。该药对白斑癌变过程中的血管增生和扩张 无明显影响 ,但对血管构形、空间配置和血管壁的完整性有保护作用 ,可能是活血化瘀类中药发挥抗 癌功效的“良性血管生成”基础。 【关键词】 灯盏细辛 ; 粘膜白斑病 ,口腔 ; 新生血管化 ,病理性 ; 动物 ,实验 Study of resisting leukoplakia canceration and angiopoiesis by herba erigerontis ZHOU Zengtong , ZHANG Shuilong, HUA Li , et al1 Department of Oral Medicine , School of Stomatology , Shanghai Second Mdical University , Shanghai 200011 , China 【Abstract】 Objective To evaluate the effect of resisting canceration of herba erigerontis and that of angiopoiesis1 Methods Carcinomatous conversions of golden hamster cheek pouches induced by Salley way and obstructed by herba erigerontis were studied1 Ink perfusion , analysis of images , resin cast form of micro2vessel ,α2 SMA detection and histopathological examination were applied to observe their changing patterns1 Results The rate of leukoplakia canceration of herba erigerontis group was one time lower than that of model group1 The rate of normal cells was about four times more than that of model1α2SMA of herba erigerontis was higher than that of model ( P 0105) 1 Nevertheless , the resin cast form of micro2vessel showed that its configuration and spacious arrangement was similar to control group1 Conclusions Herba erigerontis has the function of preventing leukoplakia canceration1 It has no obvious effect on angio2hyperplasia and expansion in the course of leukoplakia canceration1 However , it has the protecting function on angio2configuration and spacious arrangement and the complete of angeion vessel wall1 Probably its mechanism is to promote blood circulation by removing blood stasis and benign angiopoiesis so as to resist canceration1 【Key words】 Erigeron breviscapus ; Leukoplakia ,oral ; Neovascularization ,pathologic ; Animals , laboratory 口腔粘膜白斑既是临床常见的口腔粘膜疾病 , 又是具有潜在癌变倾向及高达 019 %～1918 %癌变 率的癌前病变[1 ] 。寻找阻断白斑癌变的有效药物对 防治白斑与降低口腔癌的发病率有重要意义。灯盏 细辛 ,又名灯盏花 (herba erigerontis , HEr) ,是菊科植 物短葶飞蓬[erigeron breviscapus (Vant) hand2mass]的 干燥全草。大量文献报道 HEr 有扩张脑血管、冠脉 血管和外周血管 ,改善微循环 ,增加血流量 ,抑制血 小板凝集 ,减低血液粘稠度和血脂等药理作用 ,被广 泛用于中风、冠心病等心脑血管疾病 ,以及口疮和牙 列不齐快速矫治等治疗中[2 ,3 ] 。然而 ,对 HEr 在阻 断口腔粘膜癌前病变方面的功效 ,及其对血管生成 影响的研究尚属空白。为此 ,我们采用金地鼠颊囊 白斑癌变模型 ,用 HEr 实行干预 ,联合应用组织病 理、墨汁灌注、微血管树脂铸型和甲平滑肌肌动蛋白 (α2SMA) 检测等方法进行观察研究 ,旨在评价 HEr 中华口腔医学杂志 2001 年 3 月第 36 卷第 2 期 Chin J Stomatol , March 2001 , Vol 36 , No. 2 · 941 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
·1504 电坚@是叠志山年1月第丝参算之且hL9mL3hrhL地长如上 防治白斑密变的戴果；并动态观敬其对检变过程中 累计例数统计。从表1中可以看出，西组的充血、 血管生成的影响探讨该药的抗座机制，考察运用- 白斑出现率明显低于机型组(x检验，P0.3,但两组形 常规丽定包坦的切片标木按脱蜻水化微皱处理缘 远高于空白对盟组。将4一9尚图像分析站米作图 复丢失的抗尿决定徐一染色前常规处理BC法小 (图5.6)，从中可以看出模型的曲线起伏较大，西 染色等步霉完成免疫组化染色。高倍光淀下 组曲线平坦。两组都给终高于空白自对照组， 观家并计算价连续性染色血管爸度值（简称 队值)=连续性染色血管数/视哥内血管总数X 表3组动物血管面积比值利血管帝度植比授(：土) 组 血管而(H 血管花度（从 10%。记录相邻3个视针植测数的平均值。 限堂 L.0址.明 0.现4.30 )H旧制剂及给药方法：制剂为云南大理产 打端妇来 1.0丝.3 9.423.87 H6T燥全草，由上海医科大学药学院生药学教成 白 02地0 185 室按常规制作浸将，1叫=108生药。稀释17.5 倍后按成人每口生药15g剂量的6倍计算给药量， 3.微直管树脂铸形标本观察结果：从涂DBA4 以自行制作的专用灌胃器直接灌胃每日1次，每次 周和5周组的微血管树脂转形标本中可以看到，H西 5滴连续12周不问断， 组的血管虽有扩张，但管径均匀走向一致，无出血 转 灶，空间构形正常，与核型组解然不问而与空白对 果 厮如相近， 1.组织学红察结米：表12是各组病理现察的 4.a-检测结米：a-M连线性染色的典型 1995-2005 Trimghna Tomgfing Open Dive Co..Lnd AW righes rvsarved
防治白斑癌变的效果 ;并动态观察其对癌变过程中 血管生成的影响 ,探讨该药的抗癌机制 ;考察运用α2 SMA 检测判断癌变进程阶段的价值 ,为临床推广应 用提供实验依据。 材料和方法 11 实验动物及分组 : 叙利亚金黄地鼠共 150 只 ,清洁级 ,3 周龄 ,体重 80～100 g ,封闭群。在空气 流通、室温 23～26 ℃、相对湿度 75 %～85 %的环境 下分笼饲养 ,每笼 6 只。将实验动物随机分为 3 组 , 模型组 : 66 只 ,常规饲养 12 周后涂二甲基苯丙蒽 (dimethylebenzanthrancene , DMBA) ,自第 4～9 周 ,每 周处死 11 只。其中 1 只做微血管树脂铸形 ,8 只双 侧颊囊做α2SMA 检测 ,2 只双侧颊囊做墨汁灌注图 像分析 ,将后两项的标本同时做病理观察。HEr 组 : 66 只 ,除前 12 周以 HEr 流浸膏稀释液灌胃外 ,其余 处置同模型组。空白对照组 (空白组) :18 只 ,不服 HEr ,不涂 DMBA ,同期每周处死 3 只。微血管树脂 铸形、墨汁灌注图像分析及α2SMA 3 项检测各测 1 只 ,病理观察标本为 2 只双侧颊囊。 21 方法 : (1) 动物模型制作 :按 Salley 法常规操作[4 ] 。 (2) 病理观察 :包括大体病理及组织病理观察 , 按 1972 年 WHO 口腔癌前病变协作中心的 12 条诊 断标准对上皮异常增生进行分级诊断。 (3) 墨汁灌注和图像分析 :见参考文献[5 ] 。 (4) 树脂微血管铸形 :见参考文献[5 ] 。 (5)α2SMA 免疫组化检测 :采用 DAKO 公司提供 的 ABC 试剂盒和自行配置的 TRIS2HCl 缓冲液。将 常规固定包埋的切片标本按脱蜡水化 →微波处理修 复丢失的抗原决定簇 →染色前常规处理 →ABC 法α2 SMA 染色等步骤完成免疫组化染色。高倍光镜下 观察并计算α2SMA 连续性染色血管密度值 (简称α2 SMA 值) = 连续性染色血管数/ 视野内血管总数 × 100 %。记录相邻 3 个视野检测数的平均值。 (6) HEr 制剂及给药方法 :制剂为云南大理产 HEr 干燥全草 ,由上海医科大学药学院生药学教研 室按常规制作流浸膏 ,1 ml = 10 g 生药。稀释 1715 倍后 ,按成人每日生药 15 g 剂量的 6 倍计算给药量。 以自行制作的专用灌胃器直接灌胃 ,每日 1 次 ,每次 5 滴 ,连续 12 周不间断。 结 果 1. 组织学观察结果 :表 1 ,2 是各组病理观察的 累计例数统计。从表 1 中可以看出 ,HEr 组的充血、 白斑出现率明显低于模型组(χ2 检验 , P 0105 ,但两组都 远高于空白对照组。将 4～9 周图像分析结果作图 (图 5 ,6) ,从中可以看出模型的曲线起伏较大 , HEr 组曲线平坦。两组都始终高于空白对照组。 表 3 3组动物血管面积比值和血管密度值比较( x ±s) 组别 血管面积( %) 血管密度(根/ mm2 ) 模型 1. 70 ±0. 97 10. 92 ±4. 30 灯盏细辛 1. 60 ±0. 63 9. 42 ±3. 87 空白 0. 52 ±0. 20 3. 28 ±1. 45 3. 微血管树脂铸形标本观察结果 :从涂 DMBA 4 周和 5 周组的微血管树脂铸形标本中可以看到 ,HEr 组的血管虽有扩张 ,但管径均匀 ,走向一致 ,无出血 灶 ,空间构形正常 ,与模型组炯然不同 ,而与空白对 照组相近。 4.α2SMA检测结果 :α2SMA连续性染色的典型 · 051 · 中华口腔医学杂志 2001 年 3 月第 36 卷第 2 期 Chin J Stomatol , March 2001 , Vol 36 , No. 2 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
中6口的形2力3M年1且1场之里山L9由3技之 ·151· 开血管生成。血管载面积比例增大和血管密度增加 2 20 被作为血管生成的主发标志之一份。由此提出了以 L.5 种箱血管系统作为花点的“抗血管生成疗法门。本 研究中爆汁灌注实验证实，H旧组的血管截面积比 时间周) 值和血管密度值并不下降，然而其微血管树脂特形 标本反肤出有良好的血管空间构形和完好的血管 阁5各阻百积比的可态麦花片线 壁.ā队检测结果证实亚组的妆达水平远高于 模型组。由于能够反映血管肌上皮朝饱的 功饶状态和是丘根的完好程度，因而提示G对 管生成的彩响不在于控血管扩张和增生，而在于 保持血管坠的完率性和血管的正常空问构形和形 态3别，这也许可以济作活血化籍类中药发挥其抗 《周) 培功效的“良性血管生成观象。 三，小队检测的格床价值 用：各组血管密度面的动感实化由钱 4在签别件箱的良，恶性方面有峰床价值 已有报道四本研究发现4值与上皮异常增 生不问分领间有高度用关关系。从“正常和炎症一 轻度异常增生中度异常增生一重度异常增生一 宽”显现出清所的段落和平台。其数被为心%、 50%30%、加%、3%。这一规律表明-4在白 斑密变的早明诊断和上皮异常增生的南理分级上有 任音等冠小胜检测陆果动老变化曲线 较为实用的临床价植。 m片见刻7。图器是各组a-M从值的动念变化曲 《本文图1-4,7见插图1-9页 线。从中可以看出H组始终高于榄州组，计算 参考文献 下均做，H6组为65元±34.51，模型组为42.12士 1许但街李我璃李巴第，等，口2瘤自病度白要与偏半苦 25.78,经，拉验P0.1。按10%、50%、20%、 都.第1最.北京：中回药科投出表恒2.◆1含. 10%3%5档将4价值分级.1正组与模型组落 2伦济民粉只日.黄营华，第.打药设冀为疗信心病心控所的修 米现察.上海中医钱第志，为1,6：710. 在各档巾的例数分别为44321,63和95引21、 5感里唐任雄，成合镜.静滴，是注，液重液减变性及血百 105.西组商分级例最较多，经t检验两组间 们州中回白表道变学泽志1%%动羽 4 Saley U.Eperinetal carringexess in the chork peuch df the Sean 势异有显著性(P0,01). =e,Jka,g4332522. 5任，因帅同，°文静，都.全为鼠顿幸白兵座变过程中直管异 讨 常生皮的观条研究悠体口2国学染去，0,6：443 6 Fllrun J.Anpugiris in one,wculs tunaid urd uhet 一、D的抗疼功效 ce.wt,95,2个31 以往的研究仅证实H册有防止心陆血管疾病 7年星抗建管生成疗法的临味研究。国外区学5学分厨 26:1517 发生的作用P引木研究经大休及组织病理观家证 务张港州在顺女水限光机上夜蜂型和基度爽在乳购良必性情 发中存在作形式和意义。中国有临反，，山：6w6常. 实，该药酸使金黄地服白斑癌变进程延缓，炎庄您 9 JoEa,ubus M,3:dw.中hrrd女1nu园 复提前，上皮异常增生率降低，最终导玫癌变半降 mcwrvescuier pe3心合ke odlls n p山ocry lypencrolot. AmJ Resper Cell Ml Bel.1999 20-542-994. 低（表12），从而显示出确切的抗癌动效，是一喉值 10mM.aoht目.MrnK,td.n台ences in the3yegs 得深入研究有开发价值的抗密中卓药。 berign and m5 nt ovnan tamrs。k国rted by arlyus o 二、HB对白斑密变过程中血管生成的影响 dor Dpplet uepour,iu soc点my。aded 止dy.Q山ea,1新03997. 血管生成学说是近20年发辰起来的肿粕行为 (忆椅日期3000子2 学说之一，认为实体痛的发生发腿和转移扩敞离不 《本文编辑：孔繁军) 1995-2005 Tingur Tougang Opucal Dhise Co.Lud igh resved
图 8 各组α2SMA 检测结果动态变化曲线 图 6 各组血管密度值的动态变化曲线 图 5 各组面积比的动态变化曲线 照片见图 7。图 8 是各组α2SMA 值的动态变化曲 线。从中可以看出 HEr 组始终高于模型组。计算 平均值 , HEr 组为 65176 ±34151 ,模型组为 42112 ± 25178。经 t 检验 P < 01001。按 100 %、50 %、20 %、 10 %、3 % 5 档将α2SMA 值分级。HEr 组与模型组落 在各档中的例数分别为 44、32、11、6、3 和 9、51、21、 10、5。HEr 组高分级例数较多 ,经 Ridit 检验两组间 差异有显著性( P < 0101) 。 讨 论 一、HEr 的抗癌功效 以往的研究仅证实 HEr 有防止心脑血管疾病 发生的作用[2 ,3 ] ,本研究经大体及组织病理观察证 实 ,该药能使金黄地鼠白斑癌变进程延缓 ,炎症修 复提前 ,上皮异常增生率降低 ,最终导致癌变率降 低(表 1 ,2) ,从而显示出确切的抗癌功效 ,是一味值 得深入研究、有开发价值的抗癌中草药。 二、HEr 对白斑癌变过程中血管生成的影响 血管生成学说是近 20 年发展起来的肿瘤行为 学说之一 ,认为实体瘤的发生发展和转移扩散离不 开血管生成。血管截面积比例增大和血管密度增加 被作为血管生成的主要标志之一[6 ] 。由此提出了以 肿瘤血管系统作为靶点的“抗血管生成疗法”[7 ] 。本 研究中墨汁灌注实验证实 , HEr 组的血管截面积比 值和血管密度值并不下降 ,然而其微血管树脂铸形 标本反映出有良好的血管空间构形和完好的血管 壁。α2SMA 检测结果证实 HEr 组的表达水平远高于 模型组。由于α2SMA 能够反映血管肌上皮细胞的 功能状态和基底膜的完好程度 ,因而提示 HEr 对血 管生成的影响不在于控制血管扩张和增生 ,而在于 保持血管壁的完整性和血管的正常空间构形和形 态[8 ,9 ] 。这也许可以称作活血化瘀类中药发挥其抗 癌功效的“良性血管生成”现象。 三、α2SMA 检测的临床价值 α2SMA 在鉴别肿瘤的良、恶性方面有临床价值 已有报道[10 ] ,本研究发现 ,α2SMA 值与上皮异常增 生不同分级间有高度相关关系。从“正常和炎症 → 轻度异常增生 →中度异常增生 →重度异常增生 → 癌”呈现出清晰的段落和平台。其数值为 100 %、 50 %、30 %、20 %、3 %。这一规律表明 ,α2SMA 在白 斑癌变的早期诊断和上皮异常增生的病理分级上有 较为实用的临床价值。 (本文图 1～4 ,7 见插图 2 - 9 页) 参 考 文 献 1 许国祺 ,李秉琦 ,李辉 ,等. 口腔癌前病变 ———白斑与扁平苔 藓. 第 1 版. 北京 :中国医药科技出版社 ,1992. 9218. 2 徐济民 ,郑慧君 ,黄震华 ,等. 灯盏花胶囊治疗脑心病心绞痛的临 床观察. 上海中医药杂志 ,1991 ,10 :7210. 3 陈坚 ,唐任雄 ,戎杏娥. 静滴灯盏花注射液对血液流变性及血脂 的影响. 中国血液流变学杂志 ,1998 ,8 :38239. 4 Salley JJ . Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. J Dent Res , 1954 ,33 :2532262. 5 华丽 ,周曾同 ,钟文静 ,等. 金黄地鼠颊囊白斑癌变过程中血管异 常生成的观察研究. 临床口腔医学杂志 , 2000 ,16 :41243. 6 Folkman J . Angiogenesis in cancer , vascular rheumatoid and other disease. Nat Med , 1995 ,1 :27231. 7 蒋超. 抗血管生成疗法的临床研究. 国外医学药学分册 ,1999 , 26 :13217. 8 张继增 ,范顺才 ,张晨光. 肌上皮细胞和基底膜在乳腺良恶性病 变中存在的形式和意义. 中国肿瘤临床 ,1994 , 21 :6762678. 9 Jones R , Jacobson M , Steudel W. alpha2smooth2muscle action and microvascular precursor smooth2muscle cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol , 1999 ,20 :5822594. 10 Emoto M , Iwasaki H , Mimura K, et al. Differences in the angiogenesis of benign and malignant ovarian tumors , demonstrated by analyses of color Doppler ultrasound , immuohistochemistry , and microvessel density. Cancer , 1997 ,80 :8992907. (收稿日期 :2000203228) (本文编辑 :孔繁军) 中华口腔医学杂志 2001 年 3 月第 36 卷第 2 期 Chin J Stomatol , March 2001 , Vol 36 , No. 2 · 151 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
灯盏细辛抗白斑密变的功效及其血管生成机制的实验研究 (止文见49真) 图1王常项碱F青见使师)围2座果设下所见（段型 医】图多直置直登明日扩餐雷4金套密度情大面 7,1A生续性幸色的直管（防用 编者拔为了更迅速地反映我代口皇医学名专业领线的新进根和减米，木刊偏委会决定对有重大创奇 和固内首创的科研成果将采用“快速通道”方式，使共尽早刊出，今后凡属“快速通道"”论义均在目本和论文 首页的文题前注有·”，希量口腔医务工作者积极支持和参与， f到2：9 Cf925-05T刀ir了e Opund Casc Ca了.Al rightr rewerved
插图 2 - 9 灯盏细辛抗白斑癌变的功效及其血管生成机制的实验研究 (正文见 149 页) 编者按 为了更迅速地反映我国口腔医学各专业领域的新进展和成果 ,本刊编委会决定对有重大创新 和国内首创的科研成果将采用“快速通道”方式 ,使其尽早刊出。今后凡属“快速通道”论文均在目录和论文 首页的文题前注有“3 ”,希望口腔医务工作者积极支持和参与。 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved