中全物区经h大3m升3且23是单2且nL,hm,3地2 1 论著 绞股蓝影响白斑癌变过程中Ha-ras 基因突变的实验研究 网曾同唐田瑶钟文护丁操宁毛德控李伟国 【箱要】日的复南致程道利白可寝变过程中脑德基因笑变的影响，从分于水T探数程 百瑞密抑院的机埋，并对出基因与白可德变动志变化过程的关柔连行可究，方法朵可聚合而 醚反必单战构象多态性分析法粒测经敛联直总武、试元C(州皂成等处坦的全地鼠频爱白西增变 机型际木，观酬®基因含第61位密码子笑变的阳性后号。苗果白路德发顿整组突变卡达 2.%%效股直处里组平均为7.到%，蚁段登各祖抗突变常效住信次为C一祖，总优组式元组， 其突变常分别为5.3江五.2511.00%.DA诗号超度4-8周时白斑顿型矩突变率为11.10% 40,份%饺度蓝处组为0一心为%，钻论经君蓝具有是萝的抗整林因突变功效，其有效成分与 C✉帝等离轻林有关。比西林因突变在白斑院变中起重堡作用， 【关键河】粘减白斑有，门2，某因5：聚合南纤反区：多款现象，单壁购象 Esperimental域dy oa the iiflicnce of (neslemium peutaplry色由3 k upo point uiu幽维fhs mcogine in Hecking leul中kb frm canrrralimn 2oy /mgorg.aw(.3.wg.w国 Dyamar g Ord Mdrwr.Srio Sromanogy.Shangia Seenod Mdead (imey.Shmgba 20011.Chima 【Awtn】Ohjretive E8u吨he influence of (ym4 pertaphyllam M址4 (P)ipon poir mutation of Hrrs onoopene the molecular mechansm of C'in biocking canceratian and the relationshp between 业s onoogene and cire3f1 eulopl域i山.Methods D里d8edee起父sd2ue1muc mus of the hamers wne divided inn kuaplakis mdel四up(LKGI and CP tre家dp《CG,in mutation (coden 61)of Hraas onoogene wos detected by PCR SSCP in both goups Resuts The maation ingideree of l.KG urs 22 96%,whle the men ingidenoe of (PGuas 759%(The ineidrneesof CoO gmip do9 e group and adue goup were3边%，625%ad1l,0%repectively,we知reaed with起A for 4 8 weeks,the matation incideree of L.KGi ranged fioet 11 10%1o 4000%,whle (P(i mnged fromn 0 to 10.70%Cendudons O has uutscandng cancer Hocking cffout chidfh afecid by froe GrOlL Mitston of ns onoogeuce plays an aporte量tal6 uloplaka cance国nn 【ry words】Iedkopla由%l,Ges,s:h chtin reactin,mphig,9 nge stranled ocrtomationdl 口腔白斑(cral leukoplakia,CL0为国际公i从的 pentiphyllum3址，GP2,干顶的金电鼠领囊白野模 粽前病变，式悲病本和变率分别高达4,9%一 业进行动念刮究，检测乳K癌变过程中的宽基 48.9%及3.4%一198%，是口腔鳞毫的重要病第之 因含第6】位密码子突变的情况，探时对您业因 一。虹心离基因在口腔癌的发生中有重要作用， 骚活的影响及其防癌热癌的分子机理。 有研究发现口腔裤察标本中s基因产物p21有 高表达)。我们采月聚合的酰反麽单酰构象名表 材料和方法 性分析(po小merase chin rexctiorrsinde士randed 一材料 crfurmtioel polymphism,C歌SCP到技术，对具有 1实验动物：氨利亚金地鼠1奶只，清洁级以 多种生物活生的中药教报蓝(y心 龄4一8风，体重80一1008，封闭群。上海西普尔 BK实验动物公司提供. 作青单位：20山上舞第二候和大学口整快华保口整内料 2,实验致癌剂：二甲基苯并菊 (用情网国四、，钟文津、丁编了序情回)，回家恢药等理上海快 (dimethybemcanthacene,DB)Ig,室裙下如入到 药工：雨究所飞速证) 200ml丙明液中，配置成0.5%的DDA液。 1995-2095 Tmgl Tuogie Opncml Dinc Co.IAd AN nighey rewrred
·论著· 作者单位 : 200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔内科 (周曾同、唐国瑶、钟文静、丁端宇、李伟国) ;国家医药管理局上海医 药工业研究所(毛德 ) 绞股蓝影响白斑癌变过程中 Ha2ras 基因突变的实验研究 周曾同 唐国瑶 钟文静 丁端宇 毛德 李伟国 【摘要】 目的 观察绞股蓝对白斑癌变过程中 Ha2ras 癌基因突变的影响 ,从分子水平探讨绞股 蓝防癌、抑癌的机理 ,并对 Ha2ras 基因与白斑癌变动态变化过程的关系进行研究。方法 采用聚合酶 链反应2单链构象多态性分析法 ,检测经绞股蓝总甙、甙元、C202OH 皂甙等处理的金地鼠颊囊白斑癌变 模型标本 ,观察 Ha2ras 基因含第 61 位密码子突变的阳性信号。结果 白斑癌变模型组突变率达 22196 % ,绞股蓝处理组平均为 7159 % ;绞股蓝各组抗突变率效佳依次为 C202OH 组、总甙组、甙元组 , 其突变率分别为 5132 %、6125 %、11100 % ;DMBA 诱导癌变 4～8 周时白斑模型组突变率为 11110 %～ 40100 % ,绞股蓝处理组为 0～10170 %。结论 绞股蓝具有显著的抗癌基因突变功效 ,其有效成分与 C20带游离羟基有关。Ha2ras 基因突变在白斑癌变中起重要作用。 【关键词】 粘膜白斑病 ,口腔 ; 基因 ,ras ; 聚合酶链反应 ;多态现象 ,单链构象 Experimental study on the influence of Gynostemma pentaphyllam Mak upon point mutation of Ha2ras oncogene in blocking leukoplakia from canceration Zhou Zengtong , Tang Guoyao , Zhong Wenjing , et al. Department of Oral Medicine , School of Stomatology , Shanghai Second Medical University , Shanghai 200011 , China 【Abstract】 Objective To study the influence of Gynostemma pentaphyllam Mak ( GP) upon point mutation of Ha2ras oncogene the molecular mechanism of GP in blocking canceration ,and the relationship between Ha2ras oncogene and canceration of leukoplakia 1 Methods DMBA induced carcinogeneses of the buccal pouch mucosa of the hamsters were divided into leukoplakia model group (LKG) and GP treated group ( GPG) 1 Point mutation (codon 61) of Ha2ras oncogene was detected by PCR2SSCP in both groups1 Results The mutation incidence of LKGwas 22196 % , while the mean incidence of GPGwas 7159 % (The incidences of C202OH group , glucoside group and aglucon group were 5132 % , 6125 % and 11100 % respectively) 1 When treated with DMBA for 4 to 8 weeks , the mutation incidence of LKG ranged from 11110 % to 40100 % , while GPG ranged from 0 to 10170 %1 Conclusions GP has outstanding cancer blocking effect chiefly affected by free C202OH1 Mutation of Ha2ras oncogence plays an important role in leukoplakia canceration1 【Key words】 Leukoplakia , oral ; Genes , ras ; Polymerase chain reaction ; Polymorphism , single2stranded conformational 口腔白斑(oral leukoplakia , OLK) 为国际公认的 癌前病变 ,其患病率和癌变率分别高达 419 %～ 4819 %及 314 %～1918 % ,是口腔鳞癌的重要病源之 一。Ha2ras 癌基因在口腔癌的发生中有重要作用 , 有研究发现口腔鳞癌标本中 Ha2ras 基因产物 p21 有 高表达[1 ] 。我们采用聚合酶链反应2单链构象多态 性 分 析 ( polymerase chain reaction2single2stranded conformational polymorphism , PCR2SSCP) 技术 ,对具有 多 种 生 物 活 性 的 中 药 绞 股 蓝 ( Gynostemma pentaphyllum Mak , GP) [2 ,3 ]干预的金地鼠颊囊白斑模 型进行动态研究 ,检测 OLK癌变过程中 Ha2ras 癌基 因含第 61 位密码子突变的情况 ,探讨 GP 对癌基因 激活的影响及其防癌、抑癌的分子机理。 材料和方法 一、材料 1.实验动物 :叙利亚金地鼠 195 只 ,清洁级 ,周 龄 4～8 周 ,体重 80～100 g ,封闭群。上海西普尔 BK实验动物公司提供。 21 实 验 致 癌 剂 : 二 甲 基 苯 并 蒽 (dimethylbenzanthracene , DMBA) 1 g ,室温下加入到 200 ml 丙酮液中 ,配置成 015 % 的 DMBA 液。 中华口腔医学杂志 2000 年 3 月第 35 卷第 2 期 Chin J Stomatol , March 2000 , Vol 35 , No. 2 · 19 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
2 中1物置坐全去面计5且单3张花21m,hT0,15.地3 3.PCR仪：型号GBNS. 校电泳(0.5h,电压110V)见路辣动带，收集产物. 4.C朵SCP有关引物和试剂：含61位密码子 CP-2S川CR反应产物加入12川变性液，经 袋异反应的引物序列：引物1为5 7T10min一冰浴5mn0%紧丙蜂凤度凝胶电 ACGGAATATAAGCTGGIG分’，引物2为5？ 这风定液中园定15mn流脱染色液中染色10 CGGCGCAGGICCACG3蛋白懈K,裂深液，CR mn一洗脱→显色液中显色。①凝家摄片：现察 试剂盒白上海第二医科大学提供。自配试剂：变性 RP反应结米，摄取泳动带比较条带分布情 浪(95%甲酰胺2mm/L.DTAN,0.05%梨酚 况，空自对孤组标本量小示两条单链影像，发生rs 控.05%二甲苯青)：周定液(10%乙静0.5%冰 基因含第61位密码子实变的标本在两条单蛙前出 耐酸)：显色液0.4%甲径，1.5%氢氧化钠)， 现算3条链影像， 5.蛟段控：云南产纹股蓝干全草，由国家医药 日上海医药工业研究院中药研究空忽照竹本常松 好 果 法提拟(P总成（商称(PA)、P试元（而称(B) 1,金地碱姨黄粘膜上皮重度异常增生及原位 和含C位游高羟华的GP(简称GC), 您组织理切片见图12。分别取自K模型组涂 二方法 布BA3周和T周标本. 1,实验动物分组及处理：空白对照组2只)： 2rm8突变阳性信号见图3，图中5号标木 空气流通室温23-2新℃相对捏度75%-0%环 为阳性对照取自上海第二医科大学口腔医学院 境下分笼养，每笼②0只。食用金地R全价营养颗 C标木表现为比ms基四突变的第5条链影像。 粒何科和1%淮生素C液。双侧颊黄粘腹涂布生理 6号标本为阴性对以，取自本实验空白对照组，8号 盐水.于实验结束时处死。sey川在1954年建立 标本取自本实验LK核型组，显示有灯的基因突 比横型时已正实内倒在金地鼠填囊癌前病变的诱导 变的冰动带。共余各标本均为本实验伊处理组 实验中不具致密作用，故木实监未设丙丽对瓢组， 标木时间点为涂BA3-?周. @1《校型如(48只)：相同条作下饲养，双颊涂布 .光镜观案(G伊各 路B4源导玫癌，分别在涂布满4,5,6，了，8周时分 处理组与K模型划 批处死-10只，③P处理组(145只)：其中A 重度异常塔生及原位癌 48以.B50只，C47只。相问条件下何养，并 发生情况比较兑表1。 按每天3.5mg只剂量灌胃畏股GP.2周后开始 将伊各组资料归总计 DA涂布双加，分别在涂布DBM满45,6,7,8 算重度异常增生及原位 国后各处理组分批处死9-10只。 密发生平为8.6%。经 留3b突变阅性号电 2.K校型制作：餐服Sy法1，乙链麻碎金 摄迪果 x2检段K、P组问 地佩后，大直锺撑开双侧减粪口，以】号油面笔框数 差异有显著性。P心 少量BA液，以域囊前脖欧为中心常圆尚式涂加 .5:而P各处型组问P>.5。 10次蔡食禁水2h每同重复3次 4.GP各组与LK棋举组rs基因突变阳性 3.标本处理：处死后取两侧规囊组织，每只金 信号出现率比较见表2。经x2检验.LK、间 州鼠可料标本2例。将新研标本用甲辱固定，石蜡 Pc0,0I,米异有高度显著性.PA,B,PC各 包埋，常规切片，分别作CP检测及HE染 色常规镜检。 表1伊组与核型组藏度导常增生及原位棉发车率比整 4.代R义P棱满：①NA抽提：上述标木经 原日 IK 常组 核用 ”空白组 CPA R 1西援冲液(pH7.8)去带2川蛋白眸K及0裂 度度开沈增生 仔数 0W6 (91 W4 解液消化(50℃24一36h)·②R:取标本4川注 入19,2川CR反成液中（含ag醇0.8），并给予 原位提标本数6付% 19% 2y100 0'94 04 合计 6W路 %9%1W100 W4 1裤石编油选行号反应(94℃90￥94℃30556℃ 龙仁迷 56T螺几0越 30s72℃60s,不30次)，将标本稀释25倍后过 祖.k:口整白暖：资联植.A:小息试：H:小或元 行内反应（问外反应程序循环7次）：2%球租糖微 C:含C解离桥的"，表2A 1995-2095 Tmghu Tungimy Opucml Dirc Co.LAd AN rghty rewerved
31 PCR 仪 :型号 GENIUS。 41 PCR2SSCP 有关引物和试剂 :含 61 位密码子 特 异 反 应 的 引 物 序 列 : 引 物 1 为 5 ’ ACGGAATATAAGCTGGTGG3 ’ , 引 物 2 为 5 ’ CGGCGGCAGGTCCACGGTC3’ ,蛋白酶 K、裂解液、PCR 试剂盒由上海第二医科大学提供。自配试剂 :变性 液(95 % 甲酰胺、2 mmol/ L EDTA Na2 , 0105 % 溴酚 蓝、0105 % 二甲苯青) ;固定液 (10 % 乙醇、015 % 冰 醋酸) ;显色液(014 % 甲醛、115 %氢氧化钠) 。 51 绞股蓝 :云南产绞股蓝干全草。由国家医药 局上海医药工业研究院中药研究室参照竹本常松 法[4 ]提取 GP 总甙(简称 GP2A) 、GP 甙元(简称GP2B) 和含 C20位游离羟基的 GP(简称 GP2C) 。 二、方法 1. 实验动物分组及处理 : ①空白对照组 (2 只) : 空气流通、室温 23～26 ℃、相对湿度 75 %～80 %环 境下分笼养 ,每笼 ≤10 只。食用金地鼠全价营养颗 粒饲料和 1 %维生素 C 液。双侧颊囊粘膜涂布生理 盐水 ,于实验结束时处死。Salley[5 ]在 1954 年建立 此模型时已证实丙酮在金地鼠颊囊癌前病变的诱导 实验中不具致癌作用 ,故本实验未设丙酮对照组。 ②OLK模型组 (48 只) :相同条件下饲养 ,双颊涂布 DMBA 诱导致癌 ,分别在涂布满 4、5、6、7、8 周时分 批处死 9～10 只。③GP 处理组(145 只) :其中 GP2A 48 只 ,GP2B 50 只 , GP2C 47 只。相同条件下饲养 ,并 按每天 315 mg/ 只剂量灌胃喂服 GP ,12 周后开始 DMBA 涂布双颊 ,分别在涂布 DMBA 满 4、5、6、7、8 周后各处理组分批处死 9～10 只。 21 OLK模型制作 :参照 Selly 法[5 ] 。乙醚麻醉金 地鼠后 ,大直镊撑开双侧颊囊口 ,以 1 号油画笔蘸取 少量 DMBA 液 ,以颊囊前静脉为中心作圆周式涂布 10 次 ,禁食禁水 2 h ,每周重复 3 次。 31 标本处理 :处死后 ,取两侧颊囊组织 ,每只金 地鼠可制标本 2 例。将新鲜标本用甲醛固定 ,石蜡 包埋 ,常规切片。分别作 PCR2SSCP 检测及 HE 染 色 ,常规镜检。 41 PCR2SSCP 检测 : ①DNA 抽提 :上述标本经 TES 缓冲液(pH 718) 去蜡 →2μl 蛋白酶 K及 40μl 裂 解液消化(50 ℃,24～36 h) 。②PCR :取标本 4μl 注 入 1912μl PCR 反应液中(含 Taq 酶 018μl) ,并给予 1 滴石蜡油进行外反应(94 ℃90 s →94 ℃30 s →56 ℃ 30 s →72 ℃60 s ,循环 30 次) ;将标本稀释 25 倍后进 行内反应(同外反应程序 ,循环 37 次) ;2 %琼脂糖凝 胶电泳( 015 h ,电压 110 V) ,观察泳动带 ,收集产物。 ③SSCP :25μl PCR 反应产物加入 12μl 变性液 ,经 97 ℃10 min →冰浴 5 min →30 % 聚丙烯酰胺凝胶电 泳 →固定液中固定 15 min →洗脱 →染色液中染色 10 min →洗脱 →显色液中显色。 ④观察摄片 : 观察 PCR2SSCP 反应结果 ,摄取泳动带 ,比较条带分布情 况。空白对照组标本显示两条单链影像 ,发生Ha2ras 基因含第 61 位密码子突变的标本在两条单链前出 现第 3 条链影像。 结 果 11 金地鼠颊囊粘膜上皮重度异常增生及原位 癌组织病理切片见图 1 ,2。分别取自 OLK模型组涂 布 DMBA 5 周和 7 周标本。 2. Ha2ras 突变阳性信号见图 3。图中 5 号标本 为阳性对照 ,取自上海第二医科大学口腔医学院 SCC 标本 ,表现为 Ha2ras 基因突变的第 3 条链影像。 6 号标本为阴性对照 ,取自本实验空白对照组。8 号 标本取自本实验 OLK模型组 ,显示有 Ha2ras 基因突 变的泳动带。其余各标本均为本实验 GP 处理组 , 标本时间点为涂 DMBA 5～7 周。 图 3 Ha2ras 突变阳性信号电 泳结果 31 光镜观察 GP 各 处理组与 OLK 模型组 重度异常增生及原位癌 发生情况比较见表 1。 将 GP 各组资料归总计 算重度异常增生及原位 癌发生率为 816 %。经 χ2 检验 , OLK、GP 组间 差 异 有 显 著 性 , P 0105。 41 GP 各组与 OLK模型组 Ha2ras 基因突变阳性 信号出现率比较见表 2。经χ2 检验 , OLK、GP 间 P < 0101 ,差异有高度显著性。GP2A、GP2B、GP2C各 表 1 GP 组与模型组重度异常增生及原位癌发生率比较 项目 OLK 模型组 GP 组 GP2A GP2B GP2C 空白组 重度异常增生/ 标本数 10/ 96 8/ 96 8/ 100 6/ 94 0/ 4 原位癌/ 标本数 6/ 96 1/ 96 2/ 100 0/ 94 0/ 4 合计 16/ 96 9/ 96 10/ 100 6/ 94 0/ 4 发生率( %) 16167 9138 10100 6138 0 注 :OLK:口腔白斑 ; GP :绞股蓝 ; GP2A : GP 总甙 ; GP2B : GP 甙元 ; GP2C:含 C20位游离羟基的 GP ;表 2 ,3 ,4 同 · 29 · 中华口腔医学杂志 2000 年 3 月第 35 卷第 2 期 Chin J Stomatol , March 2000 , Vol 35 , No. 2 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
中年Π2Xk土0作3且单1s张道2Mn1,h1,35.地2 ”h 表1平处理各组与互.K视型组比r突变率比权 但一旦其中某个概基发生点突变就会活化为密基 装日 O.K 印凯 机塑道 坐白福 因，研究发现它的点突变位置马限于第12,13、61 位密码子上，授激活了的rms基因可以在不需要 F性斜标本数2%611H0)9兴国4 夹变率（州 22,2 62511.00 0 生长因了的条作下活化GP,面高水平的G甲则是 立计 71.1 1.9 0 正蒂纸型增生为癌细啦的必不可少的条件。国内 外学者己在大量实验中正实口控幕的的基因突 组问间整异无显著性，P>0.05. 变阳性本高于正常细抱2一16倍。%BA诱导的 5.AA诱导白斑变4一8风各组的Hrms Q.K模型有高达22.2%的rms基因突变阳性信 基因突变半见表3，经x2脸验，涂布日A4、56 号，而未接触致控宛的空白组为0（表），说明rms 周时处死的A.K榄型姐与G十组间比s基因突变 基四突变与K密变紧密杆关，此外，以往的实验 率差异有高度显著性(P“0.01)第78周P组亦 研究表明HA语导金地品烦费粘膜产生LK以 低于K模型组，但整异无显若性(P>05》。 及LK需变有·个动念发展过程。涂布BA4一 6.含或不含游离羟基的(P各组间突变率比较 8周是粘极上皮朝胞由正常轻度异常增生中度 见表4。GPB是经阿味水解处理过的GP,已将所有 异常招生重度异常增生原位密的序列变化的关 的糖结构全部切除，因此不再含有游离经基。而 键时明门，其中涂布AA4一5周的病理表现以 中C是经特异作用于C位的衡处理过的G伊，因而 轻-中度上皮异常增生为主，5一6周以重度异常 整保正C位上有游离羟基，而(GPA题是没有经 增生及原位癌为主了周以上几乎全部出现原位密。 过水解成特殊静处理的中，存有某些带游离轻基的 表3显示出任此时用内，L飞核型组持续雉持高突 成分。因此，比较PB与PA+PC,可以发现含 变率，说明r基因突变贯穿于K毫变的全过 游离羟基的离基因突变率低于不含游离经基的近2 程，从而证实了红癌基因在白斑禀变的发生中 倍，阳x2检5验结果P>005。 有很重要的作用、 二，P在白斑癌变过程中的抗比ms基因突 表3BA诱导4-周比r突变率比教 变作用 染8BA时周) 州 别日 6 7 近20年米经中日学者大量研究，发现P成分 阳桂色 中含有人参式，并有抗中瘤，降血脂，降血糖、抗襄 20 U103'20 2寸18416 老抗心肌缺氧等多种生物活性。其作用机理可能 突变率 《特 25.040.0015.0011.11 2222 与提高机体杭氧化、调节免疫等作用有关。以往应 A1性例题 8 用金地鼠颍囊白斑模型所做的实验证实，伊有明显 标幸数 3V6 6/56 6W60 的抑制细胞异常增殖的作用经中喂食的金地凤 突率 103 5.3 100 BA诱导癌变窄比对m组，2信多同，本实验再 次证实有明显的抑癌作用，但从分子水半阐述 机理未见报道。为此我们采用相问诱高条件，比较 表4含或不含O州的伊处理粗间r5突交率比较 P组与CLK模型组间红✉基因突变的阳性率， 跑日 不H03-lcA+C 发现GP组只及CK慎平组的1/3（表2），且与光镜 阳作例效知杯本数 11/100 11f190 家变空1 1.0 玉M 现察结米基本相符（表1）提示了甲抗基因突变的 作月可能是抑制细胞异常增殖的分子学基础。从表 讨 论 3可以看出，任LK癌变的全过程中.甲组的rs 一，Hrs基因突变与风K拖变的关系 甚因突变率均低于模型组，尤其在接触化学诱癌剂 大量研究表明肿箱的发生与原密基因被漩浙 的早，中期在粘膜上皮肖处于轻、中度异常增生阶 密切相关，比r基因是原癌基因Cms家选中的 段.①的枕突变保护作用更加是养，说明确有保 重要·员，它与另外两种Cs家鼓成员k标ms, 护正常细称防止痛变的功效。同制提示接受P 心ms样其表达产物均为相对分子质量为2100 保护的时问越早越好，即①在困止：白斑癌变进程 的蛋白，称为P21。正常情况下基因不表达， 中的慎动作月比治疗作用史重爱。 1995-3095 Tmglw Tangime Opneml Durc Co.LAd.AW rghts rewerred
表 2 GP 处理各组与 OLK模型组 Ha2ras 突变率比较 项目 OLK 模型组 GP 组 GP2A GP2B GP2C 空白组 阳性例数/ 标本数 22/ 96 6/ 96 11/ 100 5/ 94 0/ 4 突变率( %) 22192 6125 11100 5132 0 合计 22192 7159 0 组间差异无显著性 , P > 0105。 51DMBA 诱导白斑癌变 4～8 周各组的 Ha2ras 基因突变率见表 3。经χ2 检验 ,涂布 DMBA 4、5、6 周时处死的 OLK模型组与 GP 组间 Ha2ras 基因突变 率差异有高度显著性( P 0105) 。 61 含或不含游离羟基的 GP 各组间突变率比较 见表 4。GP2B 是经彻底水解处理过的 GP ,已将所有 的糖结构全部切除 ,因此不再含有游离羟基。而 GP2C 是经特异作用于 C20位的酶处理过的 GP ,因而 能保证 C20位上有游离羟基。而 GP2A 则是没有经 过水解或特殊酶处理的 GP ,存有某些带游离羟基的 成分。因此 ,比较 GP2B 与 GP2A + GP2C ,可以发现含 游离羟基的癌基因突变率低于不含游离羟基的近 2 倍 ,但χ2 检验结果 P > 0105。 表 3 DMBA 诱导 4～8 周 Ha2ras 突变率比较 组别 项目 涂 DMBA 时间(周) 4 5 6 7 8 OLK 模型 阳性例数/ 标本数 5/ 20 8/ 20 3/ 20 2/ 18 4/ 18 突变率 ( %) 25100 40100 15100 11111 22122 GP 阳性例数/ 标本数 0/ 60 6/ 58 3/ 56 6/ 56 6/ 60 突变率 ( %) 0 10134 5136 10171 10100 表 4 含或不含2OH 的 GP 处理组间 Ha2ras 突变率比较 项目 不含2OH( GP2B) 含2OH( GP2A + GP2C) 阳性例数/ 标本数 11/ 100 11/ 190 突变率( %) 11100 5179 讨 论 一、Ha2ras 基因突变与 OLK癌变的关系 大量研究表明 ,肿瘤的发生与原癌基因被激活 密切相关。Ha2ras 基因是原癌基因 C2ras 家族中的 重要一员。它与另外两种 C2ras 家族成员 Ki2ras、 N2ras一样 ,其表达产物均为相对分子质量为 21 000 的蛋白 ,称为 p21。正常情况下 Ha2ras 基因不表达 , 但一旦其中某个碱基发生点突变就会活化为癌基 因。研究发现它的点突变位置局限于第 12、13、61 位密码子上。被激活了的 Ha2ras 基因可以在不需要 生长因子的条件下活化 GTP ,而高水平的 GTP 则是 正常细胞增生为癌细胞的必不可少的条件[6 ] 。国内 外学者已在大量实验中证实口腔癌的 Ha2ras 基因突 变阳性率高于正常细胞 2～16 倍[1 ] 。DMBA 诱导的 OLK模型有高达 22192 %的 Ha2ras 基因突变阳性信 号 ,而未接触致癌剂的空白组为 0 (表 2) ,说明Ha2ras 基因突变与 OLK癌变紧密相关。此外 ,以往的实验 研究表明 ,DMBA 诱导金地鼠颊囊粘膜产生 OLK以 及 OLK癌变有一个动态发展过程。涂布 DMBA 4～ 8 周是粘膜上皮细胞由正常 →轻度异常增生 →中度 异常增生 →重度异常增生 →原位癌的序列变化的关 键时期[7 ] 。其中 ,涂布 DMBA 4～5 周的病理表现以 轻～中度上皮异常增生为主。5～6 周以重度异常 增生及原位癌为主 ,7 周以上几乎全部出现原位癌。 表 3 显示出在此时期内 ,OLK模型组持续维持高突 变率 ,说明 Ha2ras 基因突变贯穿于 OLK癌变的全过 程 ,从而证实了 Ha2ras 癌基因在白斑癌变的发生中 有很重要的作用。 二、GP 在白斑癌变过程中的抗 Ha2ras 基因突 变作用 近 20 年来 ,经中日学者大量研究 ,发现 GP 成分 中含有人参甙 ,并有抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗衰 老、抗心肌缺氧等多种生物活性。其作用机理可能 与提高机体抗氧化、调节免疫等作用有关。以往应 用金地鼠颊囊白斑模型所做的实验证实 , GP 有明显 的抑制细胞异常增殖的作用 ,经 GP 喂食的金地鼠 DMBA 诱导癌变率比对照组低 2 倍多[6 ] 。本实验再 次证实 GP 有明显的抑癌作用 ,但从分子水平阐述 机理未见报道。为此 ,我们采用相同诱癌条件 ,比较 GP 组与 OLK模型组间 Ha2ras 基因突变的阳性率 , 发现 GP 组只及 OLK模型组的 1/ 3 (表 2) ,且与光镜 观察结果基本相符(表 1) ,提示了 GP 抗基因突变的 作用可能是抑制细胞异常增殖的分子学基础。从表 3 可以看出 ,在 OLK癌变的全过程中 , GP 组的Ha2ras 基因突变率均低于模型组 ,尤其在接触化学诱癌剂 的早、中期 ,在粘膜上皮尚处于轻、中度异常增生阶 段 ,GP 的抗突变保护作用更加显著 ,说明 GP 确有保 护正常细胞、防止癌变的功效。同时提示接受 GP 保护的时间越早越好 ,即 GP 在阻止白斑癌变进程 中的预防作用比治疗作用更重要。 中华口腔医学杂志 2000 年 3 月第 35 卷第 2 期 Chin J Stomatol , March 2000 , Vol 35 , No. 2 · 39 · © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
54 中坚的坠叠志年1第共生道之且生由出之 三，中抗瘤基因突变有效成分的深讨 参考文献 P总试是个多成分的混合体，口己明疏始 构的皂贰即有和余种。1%3年口木竹本落松筝报 【两刚，口的座与来林因和拉亲林因.含床口整民李余太，%， [1:5s级 道了伊皂术都具有四玢三获的达玛烷严结构和低 2厦曾用，登水龙馨峰宁，中共故取三研究边展。上再中区 紧糖糖基，并提出0位或21位联原子上带有游离 朵志？包 3以曾问徐雀宁作水龙等。议股禁对全地鼠除案保静病变相 经基的（伊贰与神制种猪细的有关，本实验发现 的对力学多响的究，上表门较民华，9切点.好经 C带辞离羟基的QPC在P各组中抗基因点突变 4竹本常老在丽原指，中含正，使，”T+电夕是规分研究 (觉1.m9衡1V流学物老（日）行浮纳之，1愿 效果最件.含有不明部位带游离羟基的工A效果 9:T715. 次之.面不含游离羟基的PB效果最差。将PA Sskg,E年ene园Qrtg9sa1 e check pouch1e务nn tma.I几emRw.1好别.元25行2. 与PC合并后与B比较，两者效果相差1倍左 4膜曾同，金芝费张水龙等。饺反直困所叠购所娘冀超发的光 右（表2，）提示游离羟基可能是维持伊抗停有效 童解.实用口臣费字朵志1积，12H. 了aue2T,WwY,uu,Hd.Π1dum年里 分子结构或构型的重要因素。本实验结果提示，韶 tuk on carcinomos rversors of plen hamker check pouches 高羟基是P防止ras是因突变的有效成分的标 tg对y dmethyl herontheacene:Ma31.nk制1， .1114T 志进一步的机坦还有待深入探讨，辞离经业2的 效果尚待扩大样本以得到明确结论。 攻痛口：9游小) (木文图12见打夏第0页 (本文%拼：孔就不) 传略卜闸， 著名口腔医学专家邹兆菊教授逝世 我因著名的山腔铜而外科女保山山监领面买学影像学有的创游人，起将才诈出丁笑：贡就， 松策面放财学专家留非菊特漫，因树买白已的率牛精力亮无架南地米就治了我 几十年采，第无与散漫华持工作在 泡无效，于199年12月28日了时15分国门养演面外科学、门胶溪面民学影像民草、特学及科研第一线，勒于姑研，期 在北京不本酒世，享年81岁， 学的黑疗、节学与科研工作，是因际知名于创新在口2面外科学及口腔额面 笔壳领教授1引3年10月3引日生干的口腔领而外科学及口腔国而医季影檬医孕形像学方面积暴了丰言的修味经 江西省南昌市，阳7年毕业于江西省南学专家，为我国口控医学事业的发展作验取得了丰顾的科可成要曾在国内外 昌女了中学，43年毕业于日文中央大出了卓地的离橄。 发k论文百余百。能主第、参与编著女 学医学院牙民学系，先后在意庆数乐山留未菊较授4国内制述了口监做射著多罩其中许多研究成冕在园际学术 中央买院及江西南昌容立医院工作，从学科，为我国养了·大卦专业人才，丰界起关注并多次我得国深及石，郢褪 年起在北京大学医学院牙医学系编了我国第一泡口莹领而X线给斯奖母。夷菊就授学识满博，治学严道 (后政为北京医子就口腔系北真医利大学)教科书及参考书。17年主持石开对工作一世不背精益求精深受步者和 学口控医学院)任较曾担任口腔策而外了全国首届口腔或射学术会议并担任中可事]的尊收和爱戴。笔先药我授高开 科南主任、山腔澜而外科教研室主任山华医学会山腔科学会口腔发射学组路一了我1，伙我」失去了一位老前辈、好可 把放财学科负青人等明务，的暴任中华仟垢长，为山的候而医学形像学科钓发老患希失去了·位灯医生。鹅的逝巴 胶买孕会口指欲面外孕饥懒司、《中唇响明尽摔，弹辆霜房，作出：了要贡是北京医科大学口粮民季院的拥大，也 牛口控医学杂志》及其它专业学术刊物前。笔无袭较投忠某光的数有事业，是我国口腔医学章业的提失。我们将水 的编委与特道编爱，卫生部高等医药院%！年该国务院学位委曼金批准为第一运怀之炮。 仪口控专业教材细市委员会委员及国际批薄十生导师指导了我国自己培养的 于医学台会员。1图1牛2月如入”九三第一位医学博士。今天隐的许多学生 学杜”1四8华2月加入中国共个党， 己成为国内外如名的山腔保季女嫁和领 零迷装教技是俄身我回高等口腔医导我国口控医学事业发展的骨干力量 《北京医科大学门腔医学院) 学数有和医疗事业的优秀竟员是我国笔迷菊教技为培帮我回高级口能医学人 (本文期辑：视原集) 995-2005Tg Toig Opvical Dusc Co.Lnd Afl nghus rererredt
三、GP 抗癌基因突变有效成分的探讨 GP 总甙是一个多成分的混合体 ,目前已明确结 构的皂甙即有 70 余种。1983 年 ,日本竹本常松等报 道了 GP 皂甙都具有四玢三萜的达玛烷型结构和低 聚糖糖基 ,并提出 20 位或 21 位碳原子上带有游离 羟基的 GP 甙与抑制肿瘤细胞有关[4 ] 。本实验发现 C20带游离羟基的 GP2C 在 GP 各组中抗基因点突变 效果最佳 ,含有不明部位带游离羟基的 GP2A 效果 次之 ,而不含游离羟基的 GP2B 效果最差。将 GP2A 与 GP2C 合并后与 GP2B 比较 ,两者效果相差 1 倍左 右(表 2 ,4) ,提示游离羟基可能是维持 GP 抗癌有效 分子结构或构型的重要因素。本实验结果提示 ,游 离羟基是 GP 防止 Ha2ras 基因突变的有效成分的标 志 ,进一步的机理还有待深入探讨 ,游离羟基 GP 的 效果尚待扩大样本以得到明确结论。 (本文图 1 ,2 见插页第 10 页) 参 考 文 献 1 周刚 1 口腔癌与癌基因和抗癌基因 1 临床口腔医学杂志 , 1995 , 11 :572581 2 周曾同 ,张水龙 ,徐维宁 1 中药绞股蓝研究进展 1 上海中医药 杂志 ,1996 ,7 :421 3 周曾同 ,徐维宁 ,张水龙 ,等 1 绞股蓝对金地鼠颊囊癌前病变细 胞动力学影响的研究 1 上海口腔医学 ,1997 ,6 :652681 4 竹本常松 ,在原重信 ,中岛正 ,他 1 ¾¡ Ä ⁄ Ë の成分研究 (第 1 报) 1 Gypenoside I2XIV の化学构造 (日) 药学杂志 , 1983 , 103 :17321851 5 Salley JJ1 Experimental Carcinogenesis in the cheek pouch of the syrian hamster1 J Dent Res , 1954 ,33 :25322621 6 周曾同 , 金芝贵 ,张水龙 ,等 1 绞股蓝阻断金地鼠颊囊癌变的光 镜观察 1 实用口腔医学杂志 ,1995 ,11 :2441 7 Zhou ZT , Wang Y, Zhou YM , et al1 Effect of gynostemma pentaphyllum mak on carcinomatous conversions of golden hamster cheek pouches induced by dimethyl benxanthracene : histological study1 Chin Med J , 1998 ,111 :84728501 (收稿日期 :1999203216) (本文编辑 :孔繁军) ·传略讣闻· 著名口腔医学专家邹兆菊教授逝世 我国著名的口腔颌面外科专家、口 腔颌面放射学专家邹兆菊教授 ,因病医 治无效 ,于 1999 年 12 月 28 日 7 时 15 分 在北京不幸逝世 ,享年 81 岁。 邹兆菊教授 1918 年 10 月 31 日生于 江西省南昌市 ,1937 年毕业于江西省南 昌女子中学 ,1943 年毕业于国立中央大 学医学院牙医学系 ,先后在重庆歌乐山 中央医院及江西南昌省立医院工作。从 1948 年起在北京大学医学院牙医学系 (后改为北京医学院口腔系、北京医科大 学口腔医学院) 任教 ,曾担任口腔颌面外 科副主任、口腔颌面外科教研室主任、口 腔放射学科负责人等职务。曾兼任中华 口腔医学会口腔颌面外科学组顾问、《中 华口腔医学杂志》及其它专业学术刊物 的编委与特邀编委 ,卫生部高等医药院 校口腔专业教材编审委员会委员及国际 牙医学会会员。1981 年 12 月加入“九三 学社”,1988 年 12 月加入中国共产党。 邹兆菊教授是献身我国高等口腔医 学教育和医疗事业的优秀党员 ,是我国 口腔颌面医学影像学科的创始人。她将 自己的毕生精力毫无保留地奉献给了我 国口腔颌面外科学、口腔颌面医学影像 学的医疗、教学与科研工作 ,是国际知名 的口腔颌面外科学及口腔颌面医学影像 学专家 ,为我国口腔医学事业的发展作 出了卓越的贡献。 邹兆菊教授在国内创建了口腔放射 学科 ,为我国培养了一大批专业人才 ,主 编了我国第一部《口腔颌面 X 线诊断 学》教科书及参考书。1987 年主持召开 了全国首届口腔放射学术会议并担任中 华医学会口腔科学会口腔放射学组第一 任组长 ,为口腔颌面医学影像学科的发 展鞠躬尽瘁 ,殚精竭虑 ,作出了重要贡 献。邹兆菊教授忠诚党的教育事业 , 1981 年被国务院学位委员会批准为第一 批博士生导师 ,指导了我国自己培养的 第一位医学博士。今天 ,她的许多学生 已成为国内外知名的口腔医学专家和领 导我国口腔医学事业发展的骨干力量。 邹兆菊教授为培养我国高级口腔医学人 才作出了突出贡献。 几十年来 ,邹兆菊教授坚持工作在 医疗、教学及科研第一线 ,勤于钻研 ,勇 于创新 ,在口腔颌面外科学及口腔颌面 医学影像学方面积累了丰富的临床经 验 ,取得了丰硕的科研成果 ,曾在国内外 发表论文百余篇。她主编、参与编著专 著多部 ,其中许多研究成果在国际学术 界引起关注并多次获得国家及省、部级 奖励。邹兆菊教授学识渊博 ,治学严谨 , 对工作一丝不苟 ,精益求精 ,深受患者和 同事们的尊敬和爱戴。邹兆菊教授离开 了我们 ,使我们失去了一位老前辈、好同 志 ,患者失去了一位好医生。她的逝世 是北京医科大学口腔医学院的损失 ,也 是我国口腔医学事业的损失。我们将永 远怀念她。 (北京医科大学口腔医学院) (本文编辑 :穆景燕) · 49 · 中华口腔医学杂志 2000 年 3 月第 35 卷第 2 期 Chin J Stomatol , March 2000 , Vol 35 , No. 2 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved
4NQO诱发两种品系大鼠舌猫过程中p53蛋白的表达特点 (王文见26真) 图！4大队十实验第6博发生了第1侧活程 (:5)图1第6国DA大候香附限内的5因 性细明装（城150图4生d)阳作价香烟 密果，离性相服多为培量风动的系密厘感(×1 纹股蓝影响白斑癌变过程中山-s基因突变的实验研究 工文见引1真) 图1粘制上应课度异常增生（刘0图2粘限照位完！ 一10 1995-2005Tmkm Tomgag Opcal Dasc Co.Lid Ail rhus rererre
4NQO 诱发两种品系大鼠舌癌过程中 p53 蛋白的表达特点 (正文见 126 页) 绞股蓝影响白斑癌变过程中 Ha - ras 基因突变的实验研究 (正文见 91 页) 图 1 粘膜上皮重度异常增生( ×100) 图 2 粘膜原位癌( ×100) — 01 — © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved