第10章吸光光度法 教学目的: 1.掌握光度法的基本原理; 2.了解光度分析条件的控制,分光光度法的应用范围 教学重点: 1.朗伯一比尔定律的应用,ε与S的物理意义及其互算 2.显色条件的选择 3.吸收曲线与工作曲线的绘制、作用 4!.测定波长与参比溶液的选择,适宜的吸光度读数范围的控制 5.示差光度法的原理及应用。 教学难点:显色条件的选择。 教学内容: 吸光光度法:基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法,包括比色 法和分光光度法 分光光度法的优点:灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 10.1物质对光的选择性吸收和光吸收的基本定律 10,11吸光光度法的特点 1.光的基本性质 紫外光:200-400mm可见光:400-750m红外:0.75-50um 单色光:单一波长的光。复合光:由不同波长的光组成的光 互补色光:按一定比例混合,能够组成白光的两种光互称为互补色光。(见表10-1) 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色,两互补色按一定比例混合后,可得到白色 2.吸收光谱产生的原因 由于不同的物质微粒具有不同的量子能级,其能量差也不同,因此物质对光的吸收具有 选择性。分子能级图,p313,图10-1 吸收光谱曲线:A~C曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度,在最大吸收波长 处测定吸光度,则灵敏度最高。 a.λmx与c无关b.A∝c 1012光吸收的基本定律 1.朗伯一比尔定律 1760年, Lambert用实验指出,当光通过透明介质时,光的减弱程度与光通过介质的光 程成正比
6－1 第 10 章 吸光光度法 教学目的： 1. 掌握光度法的基本原理； 2. 了解光度分析条件的控制，分光光度法的应用范围。 教学重点： 1. 朗伯－比尔定律的应用，ε与 S 的物理意义及其互算； 2. 显色条件的选择； 3. 吸收曲线与工作曲线的绘制、作用； 4. 测定波长与参比溶液的选择，适宜的吸光度读数范围的控制； 5. 示差光度法的原理及应用。 教学难点：显色条件的选择。 教学内容： 吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色 法和分光光度法。 分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。 10.1 物质对光的选择性吸收和光吸收的基本定律 10.1.1 吸光光度法的特点 1．光的基本性质 紫外光：200-400nm 可见光：400-750nm 红外：0.75-50µm 单色光：单一波长的光。 复合光：由不同波长的光组成的光。 互补色光：按一定比例混合，能够组成白光的两种光互称为互补色光。（见表 10-1） 溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色，两互补色按一定比例混合后，可得到白色。 2．吸收光谱产生的原因 由于不同的物质微粒具有不同的量子能级，其能量差也不同，因此物质对光的吸收具有 选择性。分子能级图，p313，图 10－1。 吸收光谱曲线：A∼C 曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度，在最大吸收波长 处测定吸光度，则灵敏度最高。 a. λmax 与 c 无关 b. A ∝ c 10.1.2 光吸收的基本定律 1. 朗伯－比尔定律 1760 年，Lambert 用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通过介质的光 程成正比
1852年,Beer研究证明了,光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的数目成 正比,在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。 吸光度:4=1g1=Kbc透光率:xf A=lg.=lg-=kb 朗伯-比尔定律数学表达式 表明:当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后,溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸 收层厚度成正比,这是吸光光度法进行定量分析的理论基础。式中比例常数K与吸光物质 的性质、入射光波长及温度等因素有关 2.摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 (1)摩尔吸收(光)系数E 当b:cmc:mo/L时,则A=Ebc E:摩尔吸收系数,只与波长有关。单位: L cm-l mol-l E物理意义:一定λ下,b=1cm,c=1moL时的吸光度。实际工作中不能用c=1mol/L 的溶液测吸光度(A=0.2-0.7) ε能反映方法的灵敏度,光度法测定ε:104,一般ε105已很灵敏 (2)桑德尔灵敏度指数:S(μg/em2) 在λmx时,A=0001下,单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量 S与的关系:A=0.001=cbc,bc=0.001/e S=b(cm)xc(mol/dm )xM(g/mol)x10ug/g 000l×M×103M (ug/cm2) E 例」Fe2与邻二氮菲生成红色络合物,g=1.1×104,灵敏度高 Fe2与磺基水杨酸络合物,ε=5.8×10 双硫腙与Pb的ε=6,8×10,S=ME=207/6.8×10=0.0030(g/cm2) 双硫腙与Cu的E=4.52×10°,S=ME=63.5/4.52×10+=0.0014(ugm2)灵敏度高 3.吸光度的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为A1,A2,.An,则总吸光度为 =A1+A2++An(据此可进行多组分的测定) 102分光光度计及吸收光谱 1.目视比色法:比较透过光的强度 标准色阶:在相同条件下显色,目视比较。 特点:灵敏度高,准确度低,不同人看,结果不同,不符合朗伯一比尔定律,也可用目 视比色法,因为比较的是透过光
6－2 1852 年，Beer 研究证明了，光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的数目成 正比，在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。 吸光度： 0 lg t I A Kbc I = = 透光率： 0 t I T I = 0 1 lg lg t I A Kbc I T = = = ———朗伯-比尔定律数学表达式 表明：当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸 收层厚度成正比，这是吸光光度法进行定量分析的理论基础。式中比例常数 K 与吸光物质 的性质、入射光波长及温度等因素有关。 2. 摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 （1）摩尔吸收（光）系数ε A＝Kbc 当 b：cm c：mol/L 时，则 A=ε bc ε ：摩尔吸收系数，只与波长有关。单位：L.cm-1 .mol -1 ε 物理意义：一定λ下，b＝1cm，c＝1 mol/L 时的吸光度。实际工作中不能用 c＝1 mol/L 的溶液测吸光度(A＝0.2-0.7)。 ε 能反映方法的灵敏度，光度法测定ε：104，一般ε: 105已很灵敏。 （2）桑德尔灵敏度指数：S （µg/cm2） 在λmax 时，A=0.001 下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量。 S 与ε的关系：A＝0.001＝εbc，bc＝0.001/ε S=b(cm)×c(mol/dm3)×M(g/mol)×106µg/g＝ 3 0.001 10 M M ε ε × × = (µg/cm2) 『例』Fe2+与邻二氮菲生成红色络合物，ε＝1.1×104 ，灵敏度高 Fe 2+与磺基水杨酸络合物，ε＝5.8×103， 双硫腙与 Pb 的ε＝6.8×104，S＝M/ε＝207/6.8×104=0.0030(µg/cm2) 双硫腙与 Cu 的ε＝4.52×104，S＝M/ε＝63.5/4.52×104=0.0014(µg/cm2) 灵敏度高 3．吸光度的加和性 共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为 A1，A2，…An，则总吸光度为： A=A1+A2+…+An （据此可进行多组分的测定） 10.2 分光光度计及吸收光谱 1. 目视比色法：比较透过光的强度 标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。 特点：灵敏度高，准确度低，不同人看，结果不同，不符合朗伯－比尔定律，也可用目 视比色法，因为比较的是透过光
2.光电比色法:比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好。 3.吸光光度法:与光电比色法的原理相同,只是二者获得单色光的方法不同,前者使用滤 光片,后者使用光栅、棱镜,因而比光电比色法的准确度和选择性好 4.分光光度计及其基本部件: 光源一单色器一比色皿(吸收池)一检测器一显示器 (1)光源钨丝灯:可见、红外400-1000mm:氢灯或氘灯:紫外160-350nm (2)单色器 滤光片:有机玻璃片或薄膜,利用颜色互补原理。 b.棱镜:根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜可见,石英棱镜:紫外、可见 c.光栅:在玻璃片或金属片上刻划均匀的线,1200条/m,衍射、干涉原理 (3)吸收池:玻璃:可见,石英紫外、可见 (4)检测器:光电转换器件(光电管、光电倍增光,光电二极管阵列)。利用光电效应,光 照产生光电流,测定光电流的大小 (5)显示器:检流计:72型。数字显示:722型。数字打印:UV-240 1022吸收曲线一A~曲线,见图10-3 参比溶液的选择原则: a.M、L均无色,可用蒸馏水作参比 b.L无色,M有色,可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。 c.L有色,M无色,可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液 d.L、M均有色,可将一份试液加入适当掩蔽剂,将被测组分掩蔽起来,使之不再与 显色剂作用,而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入,以此作为参比溶液。 ε.改变加入试剂的顺序,使被测组分不发生显色反应,可以此溶液作为参比溶液消除 干扰 103显色反应及其影响因素 1031显色反应和显色条件 将待测组分转化成有色化合物的的反应,所用的试剂称为显色剂 1.显色反应的选择 要求:a.选择性好;b.灵敏度高,ε>l04;c.有色化合物ML要稳定,不分解 d.ML的组成要一定(只ML无MLn);eML与L颜色差别大,吸收峰波长差Δλ>60nm 2.显色剂:满足以上要求。 有机显色剂:磺基水杨酸、丁二酮坞、1,10-邻二氮菲、二苯硫腙等 3.多元络合物 10.32影响显色反应的因素 1.溶液的酸度:M+L=ML(显色剂L存在酸效应αLcl)
6－3 2. 光电比色法：比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好。 3. 吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤 光片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性好。 4. 分光光度计及其基本部件： 光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显示器 （1）光源 钨丝灯：可见、红外 400－1000nm； 氢灯或氘灯：紫外 160－350nm （2）单色器 a． 滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。 b． 棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见, 石英棱镜:紫外、可见 c． 光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200 条/mm, 衍射、干涉原理 （3）吸收池：玻璃:可见, 石英:紫外、可见 （4）检测器：光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光电效应，光 照产生光电流，测定光电流的大小。 （5）显示器：检流计：72 型。数字显示：722 型。数字打印：UV－240。 10.2.2 吸收曲线 ——A ~ λ 曲线，见图 10-3 参比溶液的选择原则： a. M、L 均无色，可用蒸馏水作参比。 b. L 无色，M 有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。 c. L 有色，M 无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。 d. L、M 均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与 显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。 e. 改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除 干扰。 10.3 显色反应及其影响因素 10.3.1 显色反应和显色条件 将待测组分转化成有色化合物的的反应，所用的试剂称为显色剂。 1. 显色反应的选择： 要求：a. 选择性好；b. 灵敏度高，ε>104；c. 有色化合物 ML 要稳定，不分解； d. ML 的组成要一定（只 ML 无 MLn）；e. ML 与 L 颜色差别大, 吸收峰波长差∆λ>60nm. 2. 显色剂：满足以上要求。 有机显色剂: 磺基水杨酸、丁二酮坞、 1，10-邻二氮菲、 二苯硫腙等 3. 多元络合物 10.3.2 影响显色反应的因素 1. 溶液的酸度：M＋L＝ML（显色剂 L 存在酸效应αL（H））
a.影响显色剂的溶度 b.影响M的存在状态 c.影响ML的组成和稳定性,如Fe}一磺基水杨酸pH组成颜色 2-3 棕褐 8-101:3 色 2.显色剂用量:显色剂过多有时会引起副反应,加入量要严格控制,可通过实验确定。 3.显色时间:通过实验找出适宜的显色时间。 4.温度:通过实验确定温度范围,通常在室温下进行。 5.溶剂:一般螯合物在有机溶剂中溶解度大,提高显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)2ˉ在水 中大部分离解,几乎无色:在丙酮中呈蓝色。 6.干扰组分:共存组分与显色剂生成有色络合物,正干扰:生成无色络合物,负干扰。 干扰的消除: a.制一定酸度,使干扰组分不生色 b.掩蔽剂,与干扰组分生成无色物。 c.选择适当的波长 d.选择适当的参比液 e.分离干扰组分 104吸光光度分析及误差控制 104.1测定波长的选择和标准曲线的制作 1.测定波长的选择 (1)“最大吸收原则”:选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰) (2)“吸收最大,干扰最小”:在最大波长处有其他物质干扰时。如图10-4 2.标准曲线的制作 配制一系列标准溶液,作A一c曲线,待测组分的含量可以从标准曲线上查出 1042对朗伯比尔定律的偏离 1.非单色光引起的偏离 4=E1bc=lg,/=10l1A=62b=lg,2=10la 10+10若s1=2,则A=ebc,若s1≠2,A与c不成线性关系 2.介质不均匀引起的偏离 3.由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 4.显色反应的干扰及其消除方法
6－4 a. 影响显色剂的溶度 b. 影响 M 的存在状态 c. 影响 ML 的组成和稳定性，如 Fe3＋－磺基水杨酸 pH 组成 颜色 2-3 1：1 紫红 4-8 1：2 棕褐 8-10 1：3 黄色 2. 显色剂用量：显色剂过多有时会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验确定。 3. 显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。 4. 温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。 5．溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如 Cu(SCN)4 2－在水 中大部分离解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。 6. 干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰；生成无色络合物，负干扰。 干扰的消除： a. 制一定酸度，使干扰组分不生色。 b. 掩蔽剂，与干扰组分生成无色物。 c. 选择适当的波长。 d. 选择适当的参比液 e. 分离干扰组分 10.4 吸光光度分析及误差控制 10.4.1 测定波长的选择和标准曲线的制作 1．测定波长的选择 (1) “最大吸收原则”：选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰) (2) “吸收最大，干扰最小”：在最大波长处有其他物质干扰时。如图 10-4 2. 标准曲线的制作 配制一系列标准溶液，作 A－c 曲线，待测组分的含量可以从标准曲线上查出。 10.4.2 对朗伯-比尔定律的偏离 1．非单色光引起的偏离 1 2 1 2 01 02 1 1 01 2 2 2 02 1 2 01 02 01 02 1 2 01 02 lg , 10 lg , 10 A lg lg A A c 10 10 bc bc bc bc I I A bc I I A bc I I I I I I I I I I I I ε ε ε ε ε ε ε ε ε ε ε − − − − = = = = = = 1 2 1 2 ≠ ＋ ＋ ＝ ＝ 若 ＝ ，则 ＝ bc,若 ， 与 不成线性关系 ＋ ＋ 2．介质不均匀引起的偏离 3．由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合 4. 显色反应的干扰及其消除方法
措施:a.控制溶液酸度,b.加入掩蔽剂,c.改变干扰离子的价态, d.选择合适的参比溶液,ε.增加显色剂用量,f.分离 104.3吸光度测量的误差 光度分析的准确度,由仪器本身决定的,对一台仪器来说读数误差AT为定值。一定的 △T对应的△c不同,相对误差Δce不同 小,△門起的Δc小,Δc大;c大,Δ起的Δc大,△c大 0.434dTdA0434dT0.434dT A=lgT=0. 434InT dA=. T AT叫-lg)TgT Ac△4d40434a 相对误差:EE==2= 吸光度范围的选择:A0.20.8(T为65%15%)(相对误差较小) 10.5其他吸光光度法 10.51示差吸光光度法 选用比c浓度稍小的c为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍 4=6→4和时=A=4-4=E(-4)=△Nc=Ebm,定量基础:△4=6(c-)=6bc a.先做ΔA~Ac标准曲线;b.测待测溶液的△A; c.从标准曲线查出相应的△c;d.cx=c0+△c 设普通光度法和示差光度法的测量误差为x% 普通光度法结果:c±c.·x% 示差光度法结果:c1±(c-c) 10.52双波长吸光光度法 1.原理:当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法。该法广泛运用于环境试样和 生物试样的分析 2.应用:(1)混浊试液中组分的测定;(2)单组分的测定;(3)两组分共存时的分别测定。 106吸光光度分析法的应用 1.酸(碱)离解常数的测定 HB 在某波长λ下,测量溶液吸光度(设酸HB和碱Bˉ均有吸收,液层厚度b=lcm)则 A=EHB HB+EB[Bl=E CHB[H+ teg K。+[ AuB=Engc, dB =ac= pK, =pH-lg 2.络合物组成的测定
6－5 措施：a. 控制溶液酸度，b. 加入掩蔽剂，c. 改变干扰离子的价态， d. 选择合适的参比溶液，e. 增加显色剂用量，f. 分离 10.4.3 吸光度测量的误差 光度分析的准确度，由仪器本身决定的，对一台仪器来说读数误差∆T 为定值。一定的 ΔT，对应的Δc 不同，相对误差Δc/c 不同。 c小，ΔT引起的Δc小，Δc/c大；c大，ΔT引起的Δc大，Δc/c大。 0.434dT dA 0.434dT 0.434dT A=-lgT=0.434lnT dA=- =- = T A T (-lgT) T lgT i i 相对误差： 0.434 lg c A dA dT RE c A A T T ∆ ∆ = = = = i 吸光度范围的选择：A:0.2-0.8（T为65%-15%）(相对误差较小) 10.5 其他吸光光度法 10.5.1 示差吸光光度法 选用比cx浓度稍小的c0为参比，调透光率100%，相当于标尺扩大10倍。 } 0 0 0 ( ) ( ) 0 0 , x x x x x A c b A A A A b c c b c bc A b c c b c A c b ε ε ε ε ε ε ε = ⇒ = ∆ = − = − == ∆ = ∆ = − = ∆ = 相对 相对 定量基础： a. 先做∆A~∆c 标准曲线； b. 测待测溶液的∆A； c. 从标准曲线查出相应的∆c； d. cx=c0+ ∆c 设普通光度法和示差光度法的测量误差为 x% 普通光度法结果： c c x x x ± ⋅ % ， 示差光度法结果： c c c x x x ± − ⋅ ( 0 ) % 10.5.2 双波长吸光光度法 1．原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法。该法广泛运用于环境试样和 生物试样的分析 2．应用：（1）混浊试液中组分的测定；（2）单组分的测定；（3）两组分共存时的分别测定。 10.6 吸光光度分析法的应用 1. 酸（碱）离解常数的测定 HB = H+ + B－ 在某波长λ下，测量溶液吸光度（设酸 HB 和碱 B－均有吸收，液层厚度 b=1cm）则 [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] ( ) ( ) , lg HB HB a HB HB B B a a HB HB HB a B B B c H c K A HB B K H K H A A A c A c pK pH A A ε ε ε ε ε ε − − − − − + − + + = + = + + + − = = ⇒ = − − 2. 络合物组成的测定
(1)饱和法(又称摩尔比法): 固定一种组分(通常是金属离子M)的浓度,改变络合剂(R)的浓度,得到一系列[R]M 比值不同的溶液,并配制相应的试剂空白作参比液,分别测定其吸光度。以吸光度A为纵 坐标,[RM为横坐标作图。 (2)连续变化法(又称等摩尔系列法) c+c=C改变c和c的相对量,配制一系列溶液,在有色络合物的最大吸收波长处测 量这一系列溶液的吸光度。当溶液中络合物MRn浓度最大时,chcM比值为〃。当c/c为 0.5时,络合比为1:1;当c/c为0.3,络合比为12 A [RVIMI VM/mL oo 1.0 2. /mL5.0403.02010. 图1014饱和法 图1015连续变化法
6－6 （1）饱和法（又称摩尔比法）： 固定一种组分(通常是金属离子 M)的浓度，改变络合剂(R)的浓度，得到一系列[R]/[M] 比值不同的溶液，并配制相应的试剂空白作参比液，分别测定其吸光度。以吸光度 A 为纵 坐标，[R]/[M]为横坐标作图。 （2）连续变化法（又称等摩尔系列法） cM+c R=c，改变 cM和 c R的相对量，配制一系列溶液，在有色络合物的最大吸收波长处测 量这一系列溶液的吸光度。当溶液中络合物 MRn 浓度最大时，cR/cM 比值为 n。当 cM/c 为 0.5 时，络合比为 1:1；当 cM/c 为 0.33，络合比为 1:2。 图 10-14 饱和法 图 10-15 连续变化法