问题系列1,5.08 二月4日，二月18日（星期五）㎡交 1。问题设置的口的是再次介都蛋白的结构，酶的活性位点。还有酶健化或结合时距离的重 要性。在这个基因组学和蛋白组学时代。该门题设置还会介绍一种我们已知某一蛋白的 详细结构和化学性质。寻找与其功能相似蛋白的标准方法。在第二单元中的多肚合成酶 和非核糖体多肽链合成酶的学习中，你会发现我门对脂酸合成相关酶的认识有助于我门 从蛋白序列中破译相关功能，我们己经在5.07中学习过了酯酸合成，并将在第三读中再 学习此途径。并以此途径中的一个酶作为例子。 首先米看hA,这是从结核分棱杆茵中分离得到的一种烯酰-ACP(酿基载体蛋白) 还原酶，其有脂酸合成途径中能化的反应见下图(FguI).此酶为FAS家族成员， Figure 1 enoyl-ACP reductase S-ACP S ACP H'+NADH NAD' 它需要长脂肠酰基硫瑟为底物米合成分枝酸，分枝酸是结核分枝杆菌细胞壁必需且特异的 组成。异烟肼已经应用四十多年，并塑续作为抗结核感染的一线药物。己知此药可钟制分 枝酸的合成，且它其中一个作用位点为IhA。19年据WHO饶计，结核商致死人数比 因其它锈染致死人数的总和还多！ IhA的结构(bpb)己放在本课程(5.08》第1单元的文件夹中。如何读取该结构图 的方法已在赠一次课章讨论中学习过。注意北蛋自为同源四聚体，我们已经去掉了其它三 个亚基，因此只需要规黎单体的结构。这样可简化分析过程
问题系列 1，5.08 二月 4 日，二月 18 日(星期五)前交 1．问题设置的目的是再次介绍蛋白的结构，酶的活性位点，还有酶催化或结合时距离的重 要性。在这个基因组学和蛋白组学时代。该问题设置还会介绍一种我们已知某一蛋白的 详细结构和化学性质，寻找与其功能相似蛋白的标准方法。在第二单元中的多肽合成酶 和非核糖体多肽链合成酶的学习中，你会发现我们对脂酸合成相关酶的认识有助于我们 从蛋白序列中破译相关功能。我们已经在 5.07 中学习过了酯酸合成，并将在第三讲中再 学习此途径。并以此途径中的一个酶作为例子。 首先来看 InhA，这是从结核分枝杆菌中分离得到的一种烯酰-ACP（酰基载体蛋白） 还原酶，其有脂酸合成途径中催化的反应见下图（Figure 1）。此酶为 FASII 家族成员， 它需要长脂肪酰基硫醚为底物来合成分枝酸，分枝酸是结核分枝杆菌细胞壁必需且特异的 组成。异烟肼已经应用四十多年，并继续作为抗结核感染的一线药物。已知此药可抑制分 枝酸的合成，且它其中一个作用位点为 InhA。1999 年据 WHO 统计，结核菌致死人数比 因其它感染致死人数的总和还多！ InhA 的结构(ibvr.pdb)已放在本课程（5.08）第 1 单元的文件夹中。如何读取该结构图 的方法已在第一次课堂讨论中学习过。注意此蛋白为同源四聚体，我们已经去掉了其它三 个亚基，因此只需要观察单体的结构，这样可简化分析过程
N题： 1.画一张二领结构的草图（包基所有的螺旋和折叠），并标明螺旋或B链的起止部位。 菲，此蛋白的话化位点处有2个反应底物：NAD(尼克酰胺服攀岭二核背酸，这是我们在 5.07课程中学习过在氧化/还原反应中最重要的两个辅酶之一)和反式2.十六场能N 乙酰半肤酰孩)。COA被N-乙酰-随基乙胺(HS(CH:kNHCOCH NAC)取代，首先，思 考此酶催化的化学反应。思考两个底物的相对结合部位及此结构中这两个部位间是香存 在化学作用，这很重要。请写出还原机制，注明辅助因子NADH/NAD的作用。晶体化 时为什么要用NAD? ⅲ。注意辅尉因子的作用产物，并画出此产物与成物脂防酸间的反应。指出两者之间的反应 距离以及哪些活性位点的氨基酸残基对霍化最重要，推测出活化位点处厚些侧链在NC 一不饱和箭斯酸硫腿的还原中起重要作用。 V,注意脂酸结合区的结构。描述其环境，也就是说，侧链氢基酸的主要性质。脂膨酸底物 的构象有柯特殊7 2.请点击进入以下网站h即www.ncbi.nlm.nih.go并查我烯酰-ACP还原酶的数据（蛋自 质)。找出它在大肠杆商(FΛS【,主要合成短链脂防酸)，曲门螺旋杆菌，结核分枝杆 南和包皮分枝杆菌中的序列。前两个属于FAS醇家族，具作用于16C以下的酯酸硫健， 而后两个属于FASⅡ家族，作用于16C~26C的脂酸硫整，以适当的格式输入氨基酸序列， 并用程序ClustalW(p卤ikuw》进行拌列分析.【为正确输入序列，可 点击帮尉：并进行输入，他们会以FASTA作为例子米介绍如何进行格式亿，在上面的 结构分析中（而），你应该已经将F149,K165和Y158选出米了，这些残基在你找到的序 列中是保守的马？有报道在结核分枝杆茵中，通过晶体结构分析发现，其底物（厅酸硫 醚)的结合位点与195-219残基有美。通过以上的结构分析，你认为这种说法正确吗： 如果正确，那么ClustalW的序列分析将告诉我们FAS1和FAS两类什么信息？ 通过很多还原酶（超过50种目前已知）的结构序列分析显示，所有蛋自家族成员中， 其序列根少相同。但那些保存的残基，总是与雁化、调节或蛋白一蛋白间相互作川直接 相关
问题： i． 画一张二级结构的草图（包括所有的螺旋和折叠），并标明螺旋或 β 链的起止部位。 ii．此蛋白的活化位点处有 2 个反应底物：NAD+ （尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，这是我们在 5.07 课程中学习过在氧化/还原反应中最重要的两个辅酶之一）和反式-2-十六烯酰-(N- 乙酰半胱酰胺)。CoA被N-乙酰-巯基乙胺（HS(CH2)2NHCOCH3, NAC）取代。首先，思 考此酶催化的化学反应。思考两个底物的相对结合部位及此结构中这两个部位间是否存 在化学作用，这很重要。请写出还原机制，注明辅助因子NADH/NAD+ 的作用。晶体化 时为什么要用NAD+ ？ iii．注意辅助因子的作用产物，并画出此产物与底物脂肪酸间的反应。指出两者之间的反应 距离以及哪些活性位点的氨基酸残基对催化最重要。推测出活化位点处哪些侧链在 NAC －不饱和脂肪酸硫醚的还原中起重要作用。 iv． 注意脂酸结合区的结构。描述其环境，也就是说，侧链氨基酸的主要性质。脂肪酸底物 的构象有何特殊？ 2．请点击进入以下网站http://www.ncbi.nlm.nih.gor/ 并查找烯酰-ACP还原酶的数据（蛋白 质）。找出它在大肠杆菌（FAS I，主要合成短链脂肪酸），幽门螺旋杆菌，结核分枝杆 菌和包皮分枝杆菌中的序列。前两个属于FAS I酶家族，只作用于 16C以下的脂酸硫醚， 而后两个属于FAS II家族，作用于 16C~26 C的脂酸硫醚。以适当的格式输入氨基酸序列， 并用程序ClustalW（http://www.ebi.ac.uk/clustalw）进行排列分析。[为正确输入序列，可 点击帮助，并进行输入。他们会以FASTA作为例子来介绍如何进行格式化。]在上面的 结构分析中（iii），你应该已经将F149，K165 和Y158 选出来了，这些残基在你找到的序 列中是保守的吗？有报道在结核分枝杆菌中，通过晶体结构分析发现，其底物（脂酸硫 醚）的结合位点与 195~219 残基有关。通过以上的结构分析，你认为这种说法正确吗？ 如果正确，那么ClustalW的序列分析将告诉我们FASI和FASII两类什么信息？ 通过很多还原酶（超过 50 种目前已知）的结构序列分析显示，所有蛋白家族成员中， 其序列很少相同，但那些保存的残基，总是与催化、调节或蛋白－蛋白间相互作用直接 相关
3.在5.07课程中，已经学习了糖得解逢径中的酶和调节。尽管生化学家己经研究此途径儿 十年了，人们还是会想用在体外研究的爱据来棱拟出体内酵解过程。最近，Tusk等 (E1.Bi0chem.267.5313-242000)发现，尽管代谢物和酶沫度与生长情况下的一样， 们预测代谢的道动过程时仍有间愿。 i,代谢物的浓度用复合辞灭法测得。例如，G-6-P,F-6-P,F-l6-P2,ATP,ADP,AMP, NAD等的浓度可通过在冷过氯酸溶液中猝灭后测得。是取物被中和后，特定的代谢物 可月静法进行定量测定。总之，这种方法会产生哪些情误呢？ i.用于计算的酶活性参数（如k©，kct/Km等）是在ImL容量的比色杯中测得的，例如， 丙制酸激酶(Q1》催化的反应，用分光光度法测得其最大反应速度为30um心贴/ mn/me蛋白，被氧化的NADH的量可用34Omm的光吸收值(A340nm》的截少米计算 (e340=6.2×10Mcm')。丙解酸激酶分子量为50Da,他门测得在340nm的光吸 收值(OD)在1mm内变化为1
3．在 5.07 课程中，已经学习了糖酵解途径中的酶和调节。尽管生化学家已经研究此途径几 十年了，人们还是会想用在体外研究的数据来模拟出体内酵解过程。最近，Teusink 等 （Eur.J. Biochem. 267, 5313-24(2000)）发现，尽管代谢物和酶浓度与生长情况下的一样， 但预测代谢的流动过程时仍有问题。 i． 代谢物的浓度用复合猝灭法测得。例如，G-6-P，F-6-P，F-1,6-P2，ATP，ADP，AMP， NAD 等的浓度可通过在冷过氯酸溶液中猝灭后测得。提取物被中和后，特定的代谢物 可用酶法进行定量测定。总之，这种方法会产生哪些错误呢？ ii．用于计算的酶活性参数（如kcat，kcat/Km等）是在 1mL容量的比色杯中测得的。例如， 丙酮酸激酶（eqn 1）催化的反应，用分光光度法测得其最大反应速度为 340 μmols／ min／mg蛋白，被氧化的NADH的量可用 340nm的光吸收值（A 340nm）的减少来计算 （ε340 = 6.2 × 103 M-1 cm-1 ）。丙酮酸激酶分子量为 50 kDa，他们测得在 340nm的光吸 收值（OD）在 1min内变化为 1
pyruvate kinase PEP +ADP ATP +pyruvate NADH lactate dehydrogenase NAD" Eq.1 lactate 现在己经测出不同有机体内糖得解途径相关南的浓度，其浓度大约在0.1~mM之间， ⅱ中给出的信息解释了为什么他门测定南活性的方法是有问题的。提示，思考一下他 们是在什么样的条件下将体外数据与体内的对比的？
现在已经测出不同有机体内糖酵解途径相关酶的浓度，其浓度大约在 0.1~1mM 之间。 ii 中给出的信息解释了为什么他们测定酶活性的方法是有问题的。提示，思考一下他 们是在什么样的条件下将体外数据与体内的对比的？