问题系列3 完成时间：3月1日-3月8日 1.斯托米琼斯Stormy Jones)是一个惠有家族性高胆圆醇血症的6岁女孩，她的血浆胆固醇 浓度为1000m(是正常孩子的6倍)。为挽数性命。地进行了心胜和肝移植。之后服用 斯汀炎降脂药美维诺林。检测其血浆胆固醇和放射性标记DL的水平，其数据如图1， 根据己学的有关胆固醇体内平衡的知识，解释在器官移植后及服用美维诺林后，胆固同 和LD儿水平变化的原因. 图1（略） 2.倍半萜合成酶（又称萜环化酶）可催化集磷酸法尼酯(PP)转化成30多种己知的需 环化物。正如在课堂上看到的。作用于FP的酶在结构上有很高的同源性，温和突变及进 化最大限度地增如了（相关酶蛋白）产物的多样性。目马兜铃需合成群的结构已经弄清楚 了，此酶衡化下列反应(g1). 1.闲明异戊场焦晴酸(IPP)和二甲内烯磷酸(DAP甲)转变为FPP的机制。也就是说， 写出合成途径与化学反应， i,闲明以下机制：FP州1)怎样通过10碳环的中间物(3)最终转变为马兜铃烯2)： 写出每个反应及相关的中间产物。【提示，回忆羊毛因醇的生物合成过程和第一部分给出 的中何产物的反应类型，以及正骤离子易于通过氢化物转移dd加s小、口H阴离子 转移成脱质子化进行重排。1
问题系列 3 完成时间: 3 月 1 日~3 月 8 日 1．斯托米.琼斯(Stormy Jones)是一个患有家族性高胆固醇血症的 6 岁女孩，她的血浆胆固醇 浓度为 1000 mg/dL（是正常孩子的 6 倍）。为挽救性命，她进行了心脏和肝移植，之后服用 斯汀类降脂药美维诺林，检测其血浆胆固醇和放射性标记[ 125I]-LDL的水平，其数据如图 1。 根据已学的有关胆固醇体内平衡的知识，解释在器官移植后及服用美维诺林后，胆固醇 和 LDL 水平变化的原因。 图 1（略） 2．倍半萜合成酶（又称萜环化酶）可催化焦磷酸法尼酯（FPP）转化成 300 多种已知的萜 环化物。正如在课堂上看到的，作用于 FPP 的酶在结构上有很高的同源性，温和突变及进 化最大限度地增加了（相关酶蛋白）产物的多样性。目前马兜铃萜合成酶的结构已经弄清楚 了，此酶催化下列反应（Eq.1）。 i． 阐明异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲丙烯焦磷酸（DMAPP）转变为 FPP 的机制，也就是说， 写出合成途径与化学反应。 ii．阐明以下机制： FPP(1)怎样通过 10 碳环的中间物(3)最终转变为马兜铃烯(2)。 写出每个反应及相关的中间产物。[提示，回忆羊毛固醇的生物合成过程和第一部分给出 的中间产物的反应类型，以及正碳离子易于通过氢化物转移(hydride shifts)、CH3阴离子 转移或脱质子化进行重排。]
图2 reduA apprp f和Rnc.tr6 e chont1ky 从a+1n十长me diate5 ○ 。)圆，A deNoT CHs go-ps sprethca女a he led Ttu的n+he lp to ma%aeIf化rzarmn5 mab uih en分3oeto2
图 2
3。在这个问题中，你需要设计一对寡豪单链DNA引物。用我们在课登讨论中讲到的能特 异降解甲基化DNA的定点诱变方法，将耶尔森南素合成蛋自HMWP叫中KS组件上活性位 点的半统氨酸转变成丙氨酸。写出详细的步骤！（即，打印出口uW结果，蛋白幅译结果 等，当然还包基所有月题的答案。) i.利用GenBank,查找鼠疫事尔森南的HMWPI的基因全序列。（提示：虽然蛋白金 名为HMWPI,但其基因名为i印I) B.利用hp:As.expasy.ogr/tools/dnahtml提侯的工具，将核苷酸序列困译成蛋白质.选 择输出格式为“compact《简洁)”。 i面.利川GenBank,查找其它编码KS蛋白的基因序列如我们在课堂i讨论中提到的 E.co的FabB:然后对HMWP1和这些KS蛋白进行C1staW分析，以梗能找到 HMWPI的KS组件。ClustalW分析还能告诉你HMWPI上煤个半就氨酸残基最可 能是活性华肤氯酸。 作.再利用Ey工具将编码HMWP叫KS组件的核背酸序列译成蛋白质，这次选 择输出格式为“includes nucleotide sequence(包括核苷酸序列)”。 V,利用HMWP1中KS组件的核暂酸序列和蛋白序列的数据，设计一对寡核背酸引物， 可以将半忙氨酸定点诱变成丙氨酸。设计引物的原则包括： ◆两个诱变引物必须包含我们想要的突变序列，并能与载体质较的对应链互补退 火 引物的长度为25-45个碱基，并且胜域温度(T)应大于或等于78℃。通常用下 面的公式估算引物的T.: T.=81.5+041(GC)-675N-%错配率 ·N为引物的碱基数 ·GC百分率和错配百分率相对于整个长度计算 若要计算某些新入成剩除突变引物的T。则可用下面的修正公式 T.=81.5+041(%GC)-675N 这里的N不但括要插入成剩除的碱基数， ◆想要诱变的部分（别障或插入必须位于引物的中间，其前后都要有10一15个正 确的碱基序列。 引物的GC含量应最少不低于40%，并且引物术端最好为一个域多个C成G, 利用下面的遗传密码表。将半甓氢酸编码转换成丙氮酸。一旦设计出前瑞引物。就能利用下 面这个网站提供的工具设计出反向引物： http://arep.med harvard.edw/adna/propects/utilities/revcomp.html
3．在这个问题中，你需要设计一对寡聚单链 DNA 引物，用我们在课堂讨论中讲到的能特 异降解甲基化 DNA 的定点诱变方法，将耶尔森菌素合成蛋白 HMWP1 中 KS 组件上活性位 点的半胱氨酸转变成丙氨酸。写出详细的步骤！（即，打印出 Clustal W 结果，蛋白翻译结果 等，当然还包括所有问题的答案。） i． 利用 GenBank，查找鼠疫耶尔森菌的 HMWP1 的基因全序列。（提示：虽然蛋白命 名为 HMWP1，但其基因名为 irp1） ii．利用 http:/us.expasy.ogr/tools/dna.html 提供的工具，将核苷酸序列翻译成蛋白质，选 择输出格式为“compact（简洁）”。 iii． 利用 GenBank，查找其它编码 KS 蛋白的基因序列(如我们在课堂讨论中提到的 E.coli 的 FabB)；然后对 HMWP1 和这些 KS 蛋白进行 ClustalW 分析，以便能找到 HMWP1 的 KS 组件。ClustalW 分析还能告诉你 HMWP1 上哪个半胱氨酸残基最可 能是活性半胱氨酸。 iv． 再利用 Expasy 工具将编码 HMWP1 KS 组件的核苷酸序列翻译成蛋白质，这次选 择输出格式为“includes nucleotide sequence（包括核苷酸序列）”。 v． 利用 HMWP1 中 KS 组件的核苷酸序列和蛋白序列的数据，设计一对寡核苷酸引物， 可以将半胱氨酸定点诱变成丙氨酸，设计引物的原则包括： 两个诱变引物必须包含我们想要的突变序列，并能与载体质粒的对应链互补退 火。 引物的长度为 25~45 个碱基，并且融链温度(Tm)应大于或等于 78℃。通常用下 面的公式估算引物的Tm： Tm = 81.5 + 0.41(%GC) – 675/N – %错配率 z N 为引物的碱基数 z GC 百分率和错配百分率相对于整个长度计算 若要计算某些插入或删除突变引物的Tm，则可用下面的修正公式： Tm = 81.5 + 0.41(%GC) – 675/N 这里的 N 不包括要插入或删除的碱基数。 想要诱变的部分(删除或插入)必须位于引物的中间，其前后都要有 10~15 个正 确的碱基序列。 引物的 GC 含量应最少不低于 40%，并且引物末端最好为一个或多个 C 或 G。 利用下面的遗传密码表，将半胱氨酸编码转换成丙氨酸，一旦设计出前端引物，就能利用下 面这个网站提供的工具设计出反向引物。 http://arep.med.harvard.edu/adna/projects/utilities/revcomp.html
速传密码 (图，略) i.有时需要用SDM定点诉变)建立一个突变体库，例如，把活性位点半氨酸不贝诱 变成丙氨酸，面且可以诱变为20种天然氨基酸的任何一种。通过我们在课堂讨论中 学习的方法，解释怎样进行简单的SDM,提示：不需要用不同的引物重复20次SDM. 4.蛋白A和蛋白B一起催化合成复合物I(结构见下图)。蛋白B的基因结构已经给出。 为了研究蛋白B霍化的化学反应的顺序，进行了质(MS)游分析。在30℃下，将纯化的蛋 白B与辅因子、甲基丙二酰CoA及蛋白A中阿体复合物混合5min,反应停止后，在温和 条件下用藕蛋白刷水解蛋白B。将分解片段如入反相高效液相层析柱进行分离，获得与 ACW酰基载体蛋白)姐件相关的片段，并进行ES/FTMS分析，可观察到以下质请片段：30,116 0,194和30208gmal.(注意：含有泛酰氨基乙硫醇臂的蛋白B的分子量为0,000gm©). 请参考质洲分析结果，写出蛋白B催化生成亿合物1的生物合成途径， HO. KS AT MT KR DH Ox ACP TE OH Protein A Protein A. intemed ate complex
遗传密码 （图，略） i． 有时需要用 SDM(定点诱变)建立一个突变体库，例如，把活性位点半胱氨酸不只诱 变成丙氨酸，而且可以诱变为 20 种天然氨基酸的任何一种。通过我们在课堂讨论中 学习的方法，解释怎样进行简单的 SDM。提示：不需要用不同的引物重复 20 次 SDM。 4．蛋白 A 和蛋白 B 一起催化合成复合物 I（结构见下图）。蛋白 B 的基因结构已经给出。 为了研究蛋白 B 催化的化学反应的顺序，进行了质（MS）谱分析。在 30℃下，将纯化的蛋 白 B 与辅因子、甲基丙二酰 CoA 及蛋白 A-中间体复合物混合 5min，反应停止后，在温和 条件下用胰蛋白酶水解蛋白 B。将分解片段加入反相高效液相层析柱进行分离，获得与 ACP(酰基载体蛋白)组件相关的片段，并进行 ES/FTMS 分析，可观察到以下质谱片段：30, 116; 30,194 和 30,208 g/mol。(注意：含有泛酰氨基乙硫醇臂的蛋白 B 的分子量为 30,000 g/mol)。 请参考质谱分析结果，写出蛋白 B 催化生成化合物 1 的生物合成途径