问愿系列6 4月23日一5月3日 【.即0伴侣蛋白分子有尉于多种蛋白质在细胞中的折叠（包括胞质中新合成的蛋自 质)，蛋白质到细胞器（如线较体）中的转位，以及蛋白质复合体的装配和解聚。共作侣分子 p40s参与新叠时对底物的特异性有帮助。在课复上，我们已介绍了D四K和Da(分别 为Hsp0和Hp40s的例子)，并对Du或的底物特性进行了讨论，国没有流到研究这特性 的实验方法。关于方法的问愿进一步说也是关于D的转性以及其与决定DaK的转性的 相似性的问题。这一方法在与多肽包基蛋白体中临近氨基酸相互作用的多种系统中均适用。 在体内，已确定有14种蛋白质与DKD山系饶相互作用，且它们的序列已知。有一 种方法可以检测与固体纤维素支持物相连的13肚.我们也已合成了包括这14种蛋白质完整 序列的愁链。合成肽链与相邻肽链之间有10个残基的重叠。之前对于DK和D的实验 已经证明这些蛋白质可与合适的肽链紧密结合，并且这种结合不受所莲纤维素的影响。 我们已做了几个实验来研究D」的底物特性以及与D水相以点和不同点。从实验中 得到了以下瓷料。合成了四种蛋白质(DK,2P,S3和荧光素酶)包含相忽序列同隔的 肽链并通过a(BAlh》:间隔与纤谁素连接。将Dn(50nM)与之连接并在TisC口西7.6 100 mM NaCl.6.4mMKC1.0.05%Tween,25℃环境下温和招动30分钟。法去多余的Dna, 用半干馒转移法将其与肚战连接的Dna转移到PVDF膜上，用Da特异性多克降抗体和 碱性磷酸酶偶联的二抗检测转移的D山。碱性磷酸酶雁化使一种化学发光底物水解，该过 程可用荧光成像系绕检测。根据参考序列(AKTLILSHLRFVV)的信号强度（设定为1O0) 来规定其相对强度。 四种蛋白质的肚皓印迹检测结果如图1所示。按荧光成像信号确定的它们与D的亲 和力强弱排列。亲和力变化较大，那些>40的粮定义为高亲和力，并对其进行了进一步研究。 对错合紧密的肽链的成分参肌整个文库进行了规定（黑色条柱），并将其与对DK所做的 类似实验进行了对比（白色条柱），结果如图2A和2B, 最后，对D侧紧密结合型肽链62的一个一致基序进行了研究。将序列上移两个残琴 使德本核销定在第10位的较大的芳香族残基上。酸性线基，大的德水性芳香族残基，碱性 残基在每个位置出现的顿率的百分数分别用白条，凰条和灰条表示。结果如图2C。 阁3A是示了Dn和DaK与荧光素酶中肚结合情况的比较。检测到的与D结合的 荧光素南源性的多肽用竖条表示。整条的长度反映了该肽与D的彩和力。黑条代表以前 已梭白类为DaK结合肚的多肚. 图1 图3 (图暗)
问题系列 6 4 月 23 日—5 月 3 日 1．Hsp70 伴侣蛋白分子有助于多种蛋白质在细胞中的折叠（包括胞质中新合成的蛋白 质），蛋白质到细胞器(如线粒体)中的转位，以及蛋白质复合体的装配和解聚。共伴侣分子 Hsp40s 参与折叠时对底物的特异性有帮助。在课堂上，我们已介绍了 DnaK 和 DnaJ（分别 为 Hsp70 和 Hsp40s 的例子），并对 DnaK 的底物特性进行了讨论，但没有谈到研究这一特性 的实验方法。关于方法的问题进一步说也是关于 DnaJ 的特性以及其与决定 DnaK 的特性的 相似性的问题。这一方法在与多肽包括蛋白体中临近氨基酸相互作用的多种系统中均适用。 在体内，已确定有 14 种蛋白质与 DnaK/DnaJ 系统相互作用，且它们的序列已知。有一 种方法可以检测与固体纤维素支持物相连的 13 肽。我们也已合成了包括这 14 种蛋白质完整 序列的肽链。合成肽链与相邻肽链之间有 10 个残基的重叠。之前对于 DnaK 和 DnaJ 的实验 已经证明这些蛋白质可与合适的肽链紧密结合，并且这种结合不受所连纤维素的影响。 我们已做了几个实验来研究 DnaJ 的底物特性以及与 DnaK 相似点和不同点。从实验中 得到了以下资料。合成了四种蛋白质（DnaK，λP，p53 和荧光素酶）包含相邻序列间隔的 肽链并通过 α（β-Ala）2 间隔与纤维素连接。将 DnaJ（50 nM）与之连接并在 Tris-HCl Ph 7.6, 100 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05%Tween , 25℃环境下温和摇动 30 分钟。洗去多余的 DnaJ， 用半干燥转移法将其与肽链连接的 DnaJ 转移到 PVDF 膜上。用 DnaJ 特异性多克隆抗体和 碱性磷酸酶偶联的二抗检测转移的 DnaJ。碱性磷酸酶催化使一种化学发光底物水解，该过 程可用荧光成像系统检测。根据参考序列（AKTLILSHLRFVV）的信号强度（设定为 100） 来规定其相对强度。 四种蛋白质的肽链印迹检测结果如图 1 所示。按荧光成像信号确定的它们与 DnaJ 的亲 和力强弱排列。亲和力变化较大，那些>40 的被定义为高亲和力, 并对其进行了进一步研究。 对结合紧密的肽链的成分参照整个文库进行了规定（黑色条柱），并将其与对 DnaK 所做的 类似实验进行了对比（白色条柱）。结果如图 2A 和 2B。 最后，对 DnaJ 紧密结合型肽链 62 的一个一致基序进行了研究。将序列上移两个残基 使疏水核锚定在第 10 位的较大的芳香族残基上。酸性残基，大的疏水性芳香族残基，碱性 残基在每个位置出现的频率的百分数分别用白条，黑条和灰条表示。结果如图 2C。 图 3A 显示了 DnaJ 和 DnaK 与荧光素酶中肽结合情况的比较。检测到的与 DnaJ 结合的 荧光素酶源性的多肽用竖条表示。竖条的长度反映了该肽与 DnaJ 的亲和力。黑条代表以前 已被归类为 DnaK 结合肽的多肽。 图 1 图 3 （图略）
思考题： 1,描述检测结合D山的方法， 2,图1中螺项资料网明了D山与多肽结合的结构规， 3,关于D与特异氢基酸结合的特异性，图2B中有什么描述？实验结果是否阀明 了Dn在体内的假想功能？为什么？在这项研究中是如何比较D和DaK结 合多肽的特异性的？ 4,图2C中的资料又进一步对D结合多肽的特异性作出了多样的说明？ 5.从来自荧光素南的多肽的资料中，对于D山和DK的特异性我们如道了写什 么？ 6.画出Dna的账物结合位点的模式阁。 2。用基因学方法（基因微除）和化学基因学方法（该途径中一个酶催化步置的特异种制因 子)对某一代谢途径进行探测可以得到关干这条特异性途径的功能的重要信息。从链酶菌中 分离得到的天然产物ctacystin在蛋白体的功能的研究中丰常有用。【acta3stin和它的代谢 产物如图4所示。 Lacn竹梭用于研究过一条代谢途径，即机体对病毒入侵产生免疫反应的机制。病 毒蛋白质可粮降解并递呈到T细胞表面从而引发免疫反应。主要组织相容性复合物1类分子 (MHCI)主要是与米自病毒蛋白质的器9个氢基酸残基特异性结合，这些肽片段大多数是 由蛋白质在胞质中降解产生，并以特殊的方式转运进入内质网腔中，在椰儿这些MHCI类， 多肽片段与微球蛋白结合形成复合物，该复合物通过高尔基体转运到质膜上，肽片段暴露在 耀图表面上，与MHC1形成复合物。这一过程（抗原通呈）使得T细脑可以检测合成异质 和异常蛋白质的饵胞。最近，对需费！类分子递型的抗原的递呈机制进行了研究，结果如下 所述. 有假设认为Lactacystin或者它的一种代刻产物可以特异性灭话蛋白体，为了验证这一 机制是香正确，分别用细型粗提物，蛋白体醉片以及纯化的20S和30S蛋白体对H卧 Lactacystin进行了检测。经过料有，SDS-PAGE电淋和荧光图象摄影得到结果如图5A。为 了更加i详细的解释这些结果，又将20s蛋白体与黄光标记的Lactacystin一起培养，通过二 维PAGE电冰分析，并用特异抗体对其a亚基和B亚基进行esem印迹，结果如图5B. 往意B亚基包括LAMP2,LMP7,Y,X,乙.MECL-1等。此外，还用荧光底物对20S和 26S蛋白体的多重活性进行了研究. 思考愿： 7.关于Lactacystin的作用对象，货料说明了什么？请解释为什么图4和图5中的资 料会让你得出这一结论. 8。请据我们在课纹上关于蛋自酶作用机制的W论，推测Lactacystir的作用机制。 9.从表1的数据中可以得出关于Lactacyst口和它的代谢产物B内酯的什么结论了
思考题： 1． 描述检测结合 DnaJ 的方法。 2． 图 1 中哪项资料阐明了 DnaJ 与多肽结合的结构域。 3． 关于 DnaJ 与特异氨基酸结合的特异性 ，图 2B 中有什么描述？实验结果是否阐明 了 DnaJ 在体内的假想功能？为什么？在这项研究中是如何比较 DnaJ 和 DnaK 结 合多肽的特异性的？ 4． 图 2C 中的资料又进一步对 DnaJ 结合多肽的特异性作出了怎样的说明？ 5． 从来自荧光素酶的多肽的资料中，对于 DnaJ 和 DnaK 的特异性我们知道了写什 么？ 6． 画出 DnaJ 的底物结合位点的模式图。 2．用基因学方法（基因敲除）和化学基因学方法（该途径中一个酶催化步骤的特异抑制因 子）对某一代谢途径进行探测可以得到关于这条特异性途径的功能的重要信息。从链酶菌中 分离得到的天然产物 lactacystin 在蛋白体的功能的研究中非常有用。Lactacystin 和它的代谢 产物如图 4 所示。 Lactacystin 曾被用于研究过一条代谢途径，即机体对病毒入侵产生免疫反应的机制。病 毒蛋白质可被降解并递呈到 T 细胞表面从而引发免疫反应。主要组织相容性复合物 I 类分子 （MHC I）主要是与来自病毒蛋白质的 8-9 个氨基酸残基特异性结合。这些肽片段大多数是 由蛋白质在胞质中降解产生，并以特殊的方式转运进入内质网腔中，在那儿这些 MHC I 类、 多肽片段与微球蛋白结合形成复合物，该复合物通过高尔基体转运到质膜上，肽片段暴露在 细胞表面上，与 MHC I 形成复合物。这一过程（抗原递呈）使得 T 细胞可以检测合成异质 和异常蛋白质的细胞。最近，对需要 I 类分子递呈的抗原的递呈机制进行了研究，结果如下 所述。 有假设认为 Lactacystin 或者它的一种代谢产物可以特异性灭活蛋白体。为了验证这一 机制是否正确，分别用细胞粗提物，蛋白体碎片以及纯化的 20S 和 30S 蛋白体对[ 3 H]- Lactacystin 进行了检测。经过孵育，SDS-PAGE 电泳和荧光图象摄影得到结果如图 5A。为 了更加详细的解释这些结果，又将 20S 蛋白体与荧光标记的 Lactacystin 一起培养，通过二 维 PAGE 电泳分析，并用特异抗体对其 α 亚基和 β 亚基进行 Western 印迹，结果如图 5B。 注意 β 亚基包括 LAMP2，LMP7，Y，X，Z，MECL-1 等。此外，还用荧光底物对 20S 和 26S 蛋白体的多重活性进行了研究。 思考题： 7． 关于 Lactacystin 的作用对象，资料说明了什么？请解释为什么图 4 和图 5 中的资 料会让你得出这一结论。 8． 请根据我们在课堂上关于蛋白酶作用机制的讨论，推测 Lactacystin 的作用机制。 9． 从表 1 的数据中可以得出关于 Lactacystin 和它的代谢产物 β-内酯的什么结论？
基于我们己学习过的关于Lactacystin的知识，下面米讨论一下多肽向T维胞表面递呈 的机制。为了研究问题。我们将卵请蛋白作为递呈的抗原的前体。首先月1acn或不 用Lactacystin处理抗原速呈细散。然后用可表达高水平T门RNA多聚酶的重组牛显病毒感 染，再用包含T7启动子和卵清蛋自©DNA的质较转染。间隔一定时间让其完成抗原递呈， 然后风定细胞，并用抗原特异性单克隆抗体检测细胞表面是香存在包含卵清蛋白尊性 SIINFEKL胜段的K。MHCI分子。用两种不月的细系(E36.12.4和DAP348)进行上述 实验，得到的结果知图6所示。（注意：L是C末端连有一个餐基的多肚，是一种人造蛋 白酶抑制剂。)如图6C所示，在卵清蛋白的基因中表达了包含可产生SIINFEKL的微基因 的cDNA. (图略) 思考题： 10. 对于蛋白体在抗原递呈中的作用，图6表明了什么？ 11. 给出保银到的其它对组以支特你的结论
基于我们已学习过的关于 Lactacystin 的知识，下面来讨论一下多肽向 T 细胞表面递呈 的机制。为了研究问题，我们将卵清蛋白作为递呈的抗原的前体。首先用 Lactacystin 或不 用 Lactacystin 处理抗原递呈细胞，然后用可表达高水平 T7 RNA 多聚酶的重组牛痘病毒感 染，再用包含 T7 启动子和卵清蛋白 cDNA 的质粒转染。间隔一定时间让其完成抗原递呈， 然后固定细胞，并用抗原特异性单克隆抗体检测细胞表面是否存在包含卵清蛋白源性 SIINFEKL 肽段的 Kb MHC I 分子。用两种不同的细胞系（E36.12.4 和 DAP34.8）进行上述 实验, 得到的结果如图 6 所示。(注意：LLnL 是 C 末端连有一个醛基的多肽, 是一种人造蛋 白酶抑制剂。) 如图 6C 所示，在卵清蛋白的基因中表达了包含可产生 SIINFEKL 的微基因 的 cDNA。 （图略） 思考题： 10． 对于蛋白体在抗原递呈中的作用，图 6 表明了什么？ 11． 给出你想到的其它对照以支持你的结论