问愿系列4 三月10日到三月15日 1.复合物L,4-hO-dTpC-p原珍霉素(sTCP)在探测核糖体的A位点周围环境的时候常 技用作光亲和标记物。肽转移酶话性的亚基位点通过以下的实验确定为参与A位点RNA 结合的RNA(蛋白质？)的结构域，该探针的使用是为了获得以下信息，注意，通过sT, 即硫代核酸碱基，进行交联的机制至今不请楚。这种连接的化学稳定性是明显的。】 Pm (froyciu 1.P-s'TCPm和大肠杆南70S枝糖体在mRNA存在的情况下一起解育，P位点充满了去 酰化的RNA。这个样本用366m的紫外光进行射儿个周期以促进交联的发生。核糖体 的蛋白和RNA片断被分离，以情光成像仪检测其放射性。RNA被抽费到苯酚里，然后使用 含M尿素的38%聚丙烯酸腹凝胶电冰(PAGE)进行分析（结果见图1）。蛋白片段没有 放射性。P位点的RNA被3-CCA端突变的RNA所替代（结果见图2）. 图1.（略）
问题系列 4 三月 10 日 到 三月 15 日 1. 复合物I, 4-thio-dT-p-C-p-嘌呤霉素 (s4 TCPm) 在探测核糖体的A位点周围环境的时候常 被用作光亲和标记物。肽转移酶活性的亚基位点通过以下的实验确定为参与A位点tRNA 结合的RNA（蛋白质？）的结构域。该探针的使用是为了获得以下信息。[注意：通过s 4 T， 即硫代核酸碱基，进行交联的机制至今不清楚，但这种连接的化学稳定性是明显的。] ⅰ. [32P]-s4 TCPm和大肠杆菌 70S核糖体在mRNA存在的情况下一起孵育。P位点充满了去 酰化的tRNAPhe。这个样本用 366 nm的紫外光进行照射几个周期以促进交联的发生。核糖体 的蛋白和RNA片断被分离，以磷光成像仪检测其放射性。RNA被抽提到苯酚里，然后使用 含 7M尿素的 3.8 % 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分析（结果见图 1）。蛋白片段没有 放射性。P位点的tRNA被 3’ -CCA端突变的tRNA所替代（结果见图 2）。 图 1. (略)
Ⅱ.上还述实验中的放射性标记的RNA用核糖核酸南进行消化(NT门，在单值RNA3 的鸟原吟处将其切断)，产物在含6M尿素的24%的聚丙烯酰腹凝胶上进行电冰分析（结 果见图3).在林道1用PsTCPm作为标准。 图3.略) 面.为了确定标记的部位，在此使用了引物廷伸法（这个方法在本部分最后将做详细介 耀)，RNA被切成己知大小的片斯新然后测序，进而用木端标记（术瑞含P)的DNA可引物和聚 合衡进行分析（结果见图4）。 图4略) w,第二部的实验在从阁1所示的减胶上分离而得的具有标记的物质上进打，将这种做 射性标记的物质和CACCA-(N-Ac-Phe)一起进行期有，结果显示在图SA,Fn是示了反应的 时间和进程。在此图中，整个反应混合物会在不同的时间进行检测，反应起始的物质和其产 物都会经过NT1消化然后在含6M尿素的24%的聚丙烯酰胺凝散上进行电冰分析。抗 生素在RNA的用P)s'TCP进行起始标记的作用和其对产物形成的邦制效果分别显示在 图5B和图5C. 图5B,5C(略)
ⅱ. 上述实验中的放射性标记的RNA用核糖核酸酶进行消化（RNase T1，在单链RNA 3’ 的鸟嘌呤处将其切断），产物在含 6 M尿素的 24 ％ 的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析（结 果见图 3）。在泳道 1 用[ 32P]-s4 TCPm作为标准。 图 3. (略) ⅲ. 为了确定标记的部位，在此使用了引物延伸法（这个方法在本部分最后将做详细介 绍）。RNA被切成已知大小的片断然后测序，进而用末端标记（末端含32P）的DNA引物和聚 合酶进行分析（结果见图 4）。 图 4. (略) ⅳ. 第二部的实验在从图 1 所示的凝胶上分离而得的具有标记的物质上进行。将这种放 射性标记的物质和CACCA-(N-Ac-Phe)一起进行孵育，结果显示在图 5A。Frxn显示了反应的 时间和进程。在此图中，整个反应混合物会在不同的时间进行检测，反应起始的物质和其产 物都会经过RNase T1 消化然后在含 6 M尿素的 24％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析。抗 生素在RNA的用[ 32P]-s4 TCPm进行起始标记的作用和其对产物形成的抑制效果分别显示在 图 5B和图 5C。 图 5B, 5C (略)
问题：1.从实验1描述的核糖体在严P門sTCPm存在情况下的光分解中可以得到什么启示？ 解释图1和图2中的结果。 2图3和图4的数据告诉了你什么7 3解释图5A和5B以及5C的结果， 4画一个草图，显示这个实验怎样加深我们对于多肽形成和此过程中核糖体关键部位 的理解。显示图5A中产物的结构。 2.研究显示带有氨基酸的RNA和mRNA密码子作用，也和核霜体的0S的亚单位内的 16S的RNA作用. 1,你会用什么方法产生一个带有BABE的RNA以检测这个模型？ Ncth co)z O Bahe BRCH2-C-A1- w(cmzoi)2 【dx的5te er5与de 非.你怎样将你的新的探针送到A位点来检测保的模裂？ 五.一旦制作的探针被送到0S核糖体，后加入F2”和抗坏直酸盐以及HO让反应可以 在不月的时间进行，此法产生HO(羟自由基)，最活性的氧的还原性产物，它们和接触的 一切东西都进行反应。在反应的末尾，RNA用苯酚抽提分离出来，并且通过引物延伸法（在 问恩系列1中应用的，在本部分的最后将详细介绍)显示RNA在特异的位点能够被切割： 关于核斯体的结构和功能，这个方法给你了什么新的启示。结合课景和学习所得到的信息， 你多样利用这些知识和该实羚的结果米进行最大限度的理解，这个问思和Nalr使用的足连 实验类醒很相关。他增经用这个实验解释了核糖体的构象改变。】 引物廷伸法：检验小亚基的16SRNA(1542t)的切制位点做为一个例子，实验面在单 条件下进行，单击意味着一个分子只有一个H0切制事件发生，尽管分子1和分子2相比 可以在不同的位点核切制。为了分析切割位点。设计”端有P标记的15个的脱氧寡核苷 酸，和16SRNA的一定的留位互补，这些引物和实验中分离的RNA迅火以后，加入反转 录静，它将向引物加如入NTP直到引物移动到RNA片断的末端.这些得到廷伸的引物然后在 具有分子量标准的凝胶上进行电冰，这些廷钟的脱氧核营酸的寡豪物的大小就可以得到确 定。由于引物的大小是已知的，我们就可以确定切制的位点在哪儿
问题：1. 从实验I描述的核糖体在[ 32P]-s4 TCPm存在情况下的光分解中可以得到什么启示？ 解释图 1 和图 2 中的结果。 2. 图 3 和图 4 的数据告诉了你什么？ 3. 解释图 5A 和 5B 以及 5C 的结果。 4. 画一个草图，显示这个实验怎样加深我们对于多肽形成和此过程中核糖体关键部位 的理解。显示图 5A 中产物的结构。 2. 研究显示带有氨基酸的 tRNA 和 mRNA 密码子作用，也和核糖体的 30S 的亚单位内的 16S 的 RNA 作用。 ⅰ. 你会用什么方法产生一个带有 BABE 的 tRNA 以检测这个模型？ ⅱ. 你怎样将你的新的探针送到 A 位点来检测你的模型？ ⅲ. 一旦制作的探针被送到 70S核糖体，然后加入Fe2+和抗坏血酸盐以及H2O2让反应可以 在不同的时间进行。此法产生HO•（羟自由基），最活性的氧的还原性产物，它们和接触的 一切东西都进行反应。在反应的末尾，RNA用苯酚抽提分离出来，并且通过引物延伸法（在 问题系列 1 中应用的，在本部分的最后将详细介绍）显示RNA在特异的位点能够被切割。 关于核糖体的结构和功能，这个方法给你了什么新的启示。结合课堂和学习所得到的信息， 你怎样利用这些知识和该实验的结果来进行最大限度的理解。[这个问题和Noller使用的足迹 实验类型很相关，他曾经用这个实验解释了核糖体的构象改变。] 引物延伸法：检验小亚基的 16S RNA（1542 nt）的切割位点做为一个例子。实验ⅲ在单击 条件下进行，单击意味着一个分子只有一个HO• 切割事件发生，尽管分子 1 和分子 2 相比 可以在不同的位点被切割。为了分析切割位点，设计 5’ 端有32P标记的 15 个的脱氧寡核苷 酸，和 16S RNA的一定的部位互补，这些引物和实验ⅲ中分离的RNA退火以后，加入反转 录酶，它将向引物加入dNTPs直到引物移动到RNA片断的末端。这些得到延伸的引物然后在 具有分子量标准的凝胶上进行电泳，这些延伸的脱氧核苷酸的寡聚物的大小就可以得到确 定。由于引物的大小是已知的，我们就可以确定切割的位点在哪儿