第清鑫势处 2.1发酵液的预处理 乙1.1民晾流的特流及须关填● (1)发摩液杂质的去除：包括除去蛋白质、无机 爱醇液的特点： 离子以及色素、热原质、毒性物质等有机物质。 士拉轻龄不体装、珀 (2)改善培养液的处理性能：主要通过降低发酵 液的粘度，调节适宜的H值和温度及絮凝与凝素 等作米实现。 预处氧夫速化物质会有跑化成复中套不可少椅香养步门 根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择 14 发酵液杂质对分离提取影响最大的是： 2.1.2无机高子的去除 高价无机离子和水溶性杂蛋白☐ 离价无机离子—影响离子交换树脂对目标物的吸附 与言子的会除 一加入草酸或草酸钠 水溶性杂蛋白 加入三聚酸钠形成 影响离子交换和大网格树脂的吸附能力 可溶性络合物] 有机溶剂提取和双水相取时，产生乳化。难以分离 在常规过滤或膜过滤时，使滤速下降，污染滤膜 一加入黄血盐形成普鲁士兰沉淀 15 1
1 第二章 发酵液的预处理 和固液分离技术 苏海佳 1 02-06/2011 为什么需要预处理？ 预处理过程 固液分离目的 ：得到所需的 目标粗产物 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 预处理过程 精制过程 发酵液的特点： 1、多为悬浮液，粘度大，不易过滤 2、滤液浑浊、滤速极慢（菌体自溶，核酸、蛋白 质 其他有机粘性物质 2.1发酵液的预处理 2.1 .1发酵液的特点及预处理 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 3 质及其他有机粘性物质） 3、目标产物在发酵液中的浓度通常较低； 4、含有高价无机离子（Ca2+ , Mg2+, Fe3+ ，成分复 杂（菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基） 预处理是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤 （1）发酵液杂质的去除：包括除去蛋白质、无机 离子以及色素、热原质、毒性物质等有机物质。 （2）改善培养液的处理性能：主要通过降低发酵 液的粘度 节 宜的 值 度 絮凝与凝 发酵液预处理的目的 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 4 液的粘度，调节适宜的pH值和温度及絮凝与凝聚 等操作来实现。 根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择 发酵液杂质对分离提取影响最大的是： 高价无机离子和水溶性杂蛋白 高价无机离子——影响离子交换树脂对目标物的吸附 水溶性杂蛋白 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 5 水溶性杂蛋白 影响离子交换和大网格树脂的吸附能力 有机溶剂提取和双水相萃取时，产生乳化，难以分离 在常规过滤或膜过滤时，使滤速下降，污染滤膜 ——加入草酸或草酸钠 2.1.2 无机离子的去除 钙离子的去除 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 6 ——加入三聚磷酸钠形成 可溶性络合物 ——加入黄血盐形成普鲁士兰沉淀 镁离子的去除 铁离子的去除
21,3水溶性蛋白质的去除 1、盐折法 水球性春台质的精板：☐ 霄性物，春在普电，普电在眼范国内 脑体体系：豪水胶体。 分子周图有水化居；水化愿是夜体体系颗克的必要 根据蛋白质的特性，有几种去除方法？ 「水化 影有些折的主要因家 正电青的白在等电点钠酒白负电背的白 校好，香商价高于比底价型戴的教果特。 3、高高于强皮下，升高温发，蛋白质海解度降童 4、川值在换白政普电点对，有于数 数的种典。被政使、纯破纳、氯化的 溶没中蛋白质的聚合沉淀 2、等电点沉淀法 NH2 COOH 委面质兵有稀酸性事正电： COOH 的条下行 +H三 2
2 2.1.3水溶性蛋白质的去除 水溶性蛋白质的特征： 1、以胶体状态存在于发酵液中，其稳定性与所带电荷 有关； 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 7 2、两性物质，存在等电点，等电点多在酸性范围内。 3、加热易变性，可使溶液粘度降低，加快过滤速度 根据蛋白质的特性，有几种去除方法？ 1、盐析法 胶体体系；亲水胶体。 水溶性蛋白质的胶体特性 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 胶体体系；亲水胶体。 分子周围有水化层；水化层是胶体体系稳定的必要 条件之一。 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 － － － －－ － － － 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质 水化膜 酸 碱 碱 酸 脱水作用 脱水作用 脱水作用 生化分离工程—苏海佳 第二章 | + + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 － － － － － － － － 不稳定的蛋白质颗粒 带负电荷的蛋白质 碱 酸 脱水作用 脱水作用 脱水作用 溶液中蛋白质的聚合沉淀 1、蛋白质的相对分子量和立体结构； 结构不对称的高相对分子量蛋白质易于盐析； 2、 离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果 影响盐析的主要因素 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 比较好，含高价离子比低价型盐的效果好。 3、高离子强度下，升高温度，蛋白质溶解度降低 4、pH值在接近蛋白质等电点时，有利于盐析 • 盐的种类，硫酸铵、硫酸钠、氯化钠 2、等电点沉淀法 蛋白质通式： R NH2 COOH ——一种两性电解质 蛋白质具有弱酸性带正电： NH NH2 生化分离工程—苏海佳 第二章 | R ＋ H NH2 R NH2 COOH COO 具有弱碱性带负电： R NH2 COOH ＋ H R COOH NH3 例如： 在抗生素的生产过程中，一般将发酵液的pH值调至 2~3的偏酸性范围或8～9的偏碱性范围内，使蛋白质变 性沉淀。 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 12 条件 1、在低离子强度和pH值约为等电点的条件下进行 2、在偏酸性范围内，多通过加入无机酸（如盐酸、 磷酸和硫酸等）调节pH值完成等电点沉淀
电国日二粮多用于税水性较大的蛋白质。】 3加热法 灌熟敏能是要白质的个题将特性 →，装 技来会香生用染病特活羹 :现将电点沉淀有一定的局限性， 物质时，应该道慎收用。 玉德相视装液 宽正的 有机率剂的密度较低，产生的泥淀物易于分离 执正： 品到终级整白质实造子被择使益疫修的瓷 常用于镜的有机：和乙 2.14色东的去康 白雪以就米善附制附。 3
3 优点 范围： 一般多用于疏水性较大的蛋白质。 省去了后续的脱盐操作，并且当沉淀 操作的pH值较低时，杂蛋白更容易变性 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 缺点 极端pH值会导致某些目的产物失活，消 耗大量的酸碱。因此，采用调节pH值实 现等电点沉淀有一定的局限性。 3. 加热法 原理：热敏性是蛋白质的一个显著特性 在柠檬酸的生产过程中，将发酵液加热到80℃可以 使蛋白质变性凝固，降低发酵液的粘度，在除去杂 蛋白的同时 过滤速度也得到了提高 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 14 蛋白的同时，过滤速度也得到了提高。 该方法操作简单，成本低 缺点：导致目标产品的变性，目标产品为热敏性 物质时，应该谨慎使用。 4. 溶剂沉淀法 原理：有机溶剂使蛋白质分子表面荷电基团或亲水 基团的水化程度降低，破坏蛋白质胶体的水膜，降 低溶液的介电常数。使得蛋白质之间的静电引力增 大，产生凝聚和沉淀。 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 15 影响因素： 无机盐对蛋白质的溶解度影响很大； 在低离子强度和等电点附近，容易生成沉淀； 蛋白质相对分子质量越大，越易沉淀。 易引起目标蛋白质变性，沉淀操作必须在低温下进行 有机溶剂的密度较低，产生的沉淀物易于分离 优点： 缺点： 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 易引起目标蛋白质变性，沉淀操作必须在低温下进行 ，成本较高。一般只适用于液体处理量较少的情况。 常用于沉淀的有机溶剂：丙酮和乙醇 例如：在枯草芽孢杆菌发酵液中 加入可以生成庞 5. 吸附法 杂蛋白可以被某些吸附剂或沉淀剂吸附除去。 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 例如：在枯草芽孢杆菌发酵液中，加入可以生成庞 大凝胶的氯化钙和磷酸氢二钠，凝胶将蛋白质、菌 体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中一同除去， 还可加快过滤速率。 在发酵的过程中，培养基本身可能带入色素，如糖蜜 、玉米浸出液等都带有颜色，使得发酵液的颜色加深 ；此外，微生物在代谢过程中，本身也可能产生有色 物质。 2.1.4 色素的去除 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 吸附法——活性炭吸附，树脂 吸附等。 食品工业上的糖浆脱色时多用大网格树脂 活性炭作脱色剂对L－乳酸发酵液进行脱色 常用的脱色方法
213装酵浓火电佳纯的胀善一 2、调节H值改善过滤特性 波12×1 增大10-100商。 4数米 增大是液中体触 的大小。提富视利 需凝的优点：能耗低、易操作、工作量小 6o-8q 回 (2)富最物米每漫论
4 1、降低发酵液的粘度 目的：提高过滤速率 ℃ ° 2.1.3发酵液处理性能的改善 ——加热法和加水稀释法两种 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 例如，在40℃时，12°Be′麦芽汁的粘度为1.2×10- 3Pa·s，当温度升至75℃时，粘度可下降一半，过滤速 率加倍。对于链霉素的发酵液，在pH值3.0的条件下， 升温至70℃后维持半小时，可使液体粘度下降1/6，过 滤速率增大10-100倍。 2、 调节pH值——改善过滤特性 1、除去氨基酸和蛋白质等两性物质; 2、在膜过滤时，发酵液中的大分子物质容易吸附于 膜上，调节pH值可改变易吸附分子的电荷性质，减 少膜的堵塞和污染 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 少膜的堵塞和污染。 3、在合适的pH值下，细胞和细胞碎片及某些胶体物 质会趋于絮凝状态，形成较大的颗粒，有利于过滤 操作的进行。 2.1.4 絮凝技术 1 、增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降 速度； 目的： 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 2、降低发酵液粘度（结合其他方法，如稀释、 加热等）； 3、采用普通、简单、有效的过滤方法，实现固 液分离。 絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥 作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种 以物理的集合为主的过程 1、絮凝和凝聚的区别 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 絮凝的优点：能耗低、易操作、工作量小 凝聚：指在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的 降低，而使胶体体系不稳定的现象 （1）胶体理论 把细菌直接当作胶体溶液中的胶粒来解释絮凝 过程。絮凝是由于细胞表面的极性基团引起的表面 吸附，而使表面自由能降低的过程。 2、 絮凝机理 生化分离工程—苏海佳 第二章 | （2）高聚物架桥理论 由于细胞在表面分泌出许多高聚物如蛋白质、多糖 等，这些高聚物在细胞膜表面形成胞外纤丝。细胞 的絮凝是由于这些胞外纤丝之间架桥交联形成的。 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 24 图1－2 高分子絮凝剂的混合、吸附和絮凝作用示意图
6)家电愿强论 3、需见的家兼 有机噻相：成本高、用香大。知乙水、阿聊和甲暗 无机家刺：戴果好、向通用性不好 阳高子对常鱼电的胶触兼果桃力的火序为： “>F“>H*>Ca>g>*>a*> 业要有A山，(SO)1、NaC1、Nm,PO、CaC1,和明胶善 高分子有制物 热的高分小家根相 一亮果情、海幕或的、明胶、骨收警 优康：先奉无意，环镜夜好—绿色范湘 微在物到一季为参物中和教感、要白责 由生物户业的有家数果的代时 果可燥敏熟酬言子家架利天率，可用于食品和 在胞外环 5
5 大多数细胞表面都有一定 的电荷，絮凝过程是加入 电解质后，相同电荷的排 （3）双电层理论 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 25 斥以及细胞表面水合程度 不同而产生聚并的过程。 细胞表面的离子键和氢 键参与了这一过程。 3、常见的絮凝剂 絮凝剂从化学结构看，主要分为三类：高聚物、 无机盐、有机溶剂及表面活性剂。 有机溶剂：成本高、用量大。如乙醇、丙酮和甲醛 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 26 无机絮凝剂：效果好、但通用性不好 阳离子对带负电的胶粒凝聚能力的次序为： 主要有Al2(SO4)3、NaCl、Na3PO4、CaCl2和明胶等 Al Fe H Ca Mg K Na Li 3 3 2 2 优点 用量少（ 般以 计算） 絮凝体粗大 分 高分子有机物 共同特点：具有长链状的结构，利用长链上的活性基团 ，通过静电引力，形成架桥连接，从而生成菌团沉淀。 合成有机物：聚丙烯酰胺类絮凝剂 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 27 优点：用量少（一般以ppm计算），絮凝体粗大，分 离效果好，絮凝速度快以及种类多，使用范围广，目 前主要用于提纯杂质为蛋白质或菌丝体的发酵液。 缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺 聚丙烯酸类阴离子絮凝剂无毒，可用于食品和 医药工业中。 ——壳聚糖、海藻酸钠、明胶、骨胶等 优点：无毒无害，环境友好——绿色药剂 天然的高分子絮凝剂 无机高分子聚合物： ——聚合铝盐、聚合铁盐 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 28 由微生物产生的具有絮凝效果的代谢物 多无毒，安全性好，高效性（用量少） 微生物： ——多为多糖和核酸、蛋白质 絮凝剂种类 絮凝剂 絮凝细胞 高 聚 物 核酸 DNA 细菌 蛋白质 ------- 细菌 纤维素 ------- 酵母 聚电解质 聚丙烯酰胺 细菌 聚乙烯亚胺 细菌 多糖 葡聚糖 细菌 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 29 多糖 壳聚糖 酵母 有 机 物 溶剂 乙醇 酵母 丙酮 酵母 其他有机物 腐殖酸 酵母 鞣酸 单宁 酵母 无 机 物 金属离子 镁盐 细菌、酵母 钙盐 细菌、酵母 铝盐 酵母、藻类 自絮凝 1、滤速加快、滤液更清，改善滤液质量，去除 杂蛋白与固体杂质 2、可在胞外循环 利用基因工程手段，可以 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 30 ， 得到自身絮凝和沉降性能 很好的酵母。 不需要固定化细胞载体、成本低、节省空间、可以获 得高菌体浓度，实现连续发酵。 优点：
、路珍高地化] 厂《夜易响图素 ：B半甘（内）的分高线化 2、分学量：分于量上外，有利于架标，但水难枝种依 作业： 一有类“家”方面的小论大。 不少500。 6
6 3、酶分离纯化 细胞破碎——絮凝——酶 例： -半乳糖甘酶（胞内酶）的分离纯化 壳聚糖+聚乙酰亚胺 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 31 ——细胞破碎——离心分离——澄清液 -半乳糖甘 酶发酵液 壳聚糖+聚乙酰亚胺 CaCl2 调节pH 细胞碎片+部分可溶 -半乳糖甘酶的活性没有影响 性杂蛋白 絮凝影响因素 1、絮凝剂浓度：浓度上升，有利于架桥；浓度过多，引 起吸附饱和，形成胶粒，产生二次稳定。 2、分子量：分子量上升，有利于架桥，但水溶性降低。 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 32 3、pH值：影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影 响分子链的伸展，电离度上升，伸展状态上升。 作业： 写一篇有关“絮凝”方面的小论文。 絮 响 的 生化分离工程—苏海佳 第二章 | 33 如：絮凝剂种类，用途，影响因素，存在的 问题等。 不少于500字
