第三章细胞破碎 微生物的代谢产物 Cell Disruption) 胞外口厂被子石苏瑞春在牛货幸糖 苏海使 胞内 细胞周标产赖就更如胞本考，知面包聘#。 胞外物质一发酵液预处理—澄清液 方来破琴提造级独是化学、降城的 主要划分为两大类，化学法和机械法。 成碎细胞的目的 细胞破碎和声物释放原腹 格不的 影响破碎的因素 化 知施的大小，彩状、果合物的文秋皮 主要有：或碱处电、化学状刺处建、胸溶
1 第三章 细胞破碎 （Cell Disruption） 苏海佳 生化分离工程 第三章 第三章 | 微生物的代谢产物 • 多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。 • 有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基 因工程菌产生的多数蛋白质不会被分泌到发 胞外 生化分离工程 第三章 第三章 | 酵液中，而是在细胞内沉积。脂类和一些抗 生素也是包含在生物体中。 • 目标产物就是细胞本身，如面包酵母。 胞内 细胞 生化分离工程 第三章 第三章 | 细胞破碎是指：选用物理、化学、酶或机械的 胞外物质 胞内物质 发酵液预处理——澄清液 收集菌体——细胞破碎—— 转入液相——碎片分离 生化分离工程 第三章 第三章 | 细胞破碎是指：选用物理、化学、酶或机械的 方法来破坏细胞壁或细胞膜。 主要划分为两大类，化学法和机械法。 就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏 (增大通透性)或破碎，释放其中的目标产物 破碎细胞的目的 影响破碎的因素： 生化分离工程 第三章 第三章 | 细胞的大小，形状、聚合物的交联程度 影响破碎的因素： 利用化学、生化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜 的结构，增大胞内物质的溶解速率，或完全溶 化学法 解细胞壁 形成原生质体 在渗透压作用下 压缩力和剪切力——高压匀浆、珠磨、撞击 机械法 破碎、超声波破碎 细胞破碎和产物释放原理 生化分离工程 第三章 第三章 | 解细胞壁，形成原生质体，在渗透压作用下， 细胞膜破裂释放胞内物质。 主要有：酸碱处理、化学试剂处理、酶溶 物理渗透法 渗透压冲击法和冻结—融化法
第二节细胞壁结构和化学组成 文+0+ +0+ 蛋名9阳略装裤机理四 (1)动物细胞 (2)细菌的细胞 所有的细细警由的骨秋解成 有 被醉题方：枝果精的周软的物 两销构的来唐皮和果成，专独筑的底营和交我成寄终。 2
2 细胞破碎机理 生化分离工程 第三章 第三章 | 生化分离工程 第三章 | （1）动物细胞 动物细胞 没有细胞 壁，只有 由脂质和 生化分离工程 第三章 | 蛋白质组 成的细胞 膜，易于 破碎。 所有的细菌细胞壁由坚固的骨架——肽聚糖组成 1、肽聚糖由聚糖链借短肽交联而成，网状结构， 使细胞有一定的形状和强度； 2、短肽一般由4-5个氨基酸组成，常含有D-氨基酸 （2）细菌的细胞壁 生化分离工程 第三章 第三章 | 2、短肽一般由4 5个氨基酸组成，常含有D 氨基酸 与二氨基庚二酸； 3、聚糖链由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替 通过（1-4）糖苷健连接而成。短肽接在N-胞壁酸 上，相邻的短肽交叉相连，形成网状。 生化分离工程 第三章 | 所有细菌都含有肽聚糖的网状结构。 革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，约15-50nm，肽聚糖 含量占40%一90%。其余是多糖和磷壁酸； 革兰氏阴性菌的肽聚糖层约1.5-2.0nm，外有一外 壁层约8-l0nm，由脂蛋白和脂多糖及磷脂构成的两 层外壁层。 特点： 生化分离工程 第三章 第三章 | 层外壁层。 革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，较 难破碎。 破碎阻力：肽聚糖的网状结构 网结构的致密程度和强度，与肽键的数量和交联度有关
◆ (3)酵母的细 ，西包的年的70加 特燕： 铜胞壁的刚性膏架； 酿二据镜共价连接而成的网 大若串. 壁阻力：壁结构交联的紧害程度和壁厚 真核生物的细胞 (4)植物细胞管袍成 膜中含有固醇，而原 核生物中没有。除丁 细胞膜，文核细胞具 有一些有特珠作用的 ① 桂物细棋式图 细胞器。 CO. 黄染解瓷变委他婆来二烫岛费能结构、性 来斑花素旋种青烫产的韩清 椅药豆原中 纤丝之 品物提 以质化，加电不水，不硅气 在干燥植物体中纤维素约占总重的13一12， 3
3 生化分离工程 第三章 | Gram-negative procaryotes 革兰氏阴性原核生物（E.coli） 1、里层葡聚糖的细纤维 细胞壁的刚性骨架； （3）酵母的细胞壁 组成：由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，比革 兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。 例如，面包酵母的细胞壁厚约70nm。 特点： 生化分离工程 第三章 第三章 | 1、里层葡聚糖的细纤维——细胞壁的刚性骨架； 2、覆盖在细纤维上的是一层糖蛋白； 3、外层是由1，6—磷酸二脂键共价连接而成的网 状结构的甘露聚糖； 4、其内部有甘露聚糖—酶的复合物。 破壁阻力：壁结构交联的紧密程度和壁厚。 真核生物的细胞 膜中含有固醇，而原 核生物中没有。除了 细胞膜 真核细胞具 生化分离工程 第三章 | ， 有一些有特殊作用的 细胞器。 植 物 细 胞 （4）植物细胞壁构成 生化分离工程 第三章 | 胞 模 式 图 植物细胞壁的主要组成成分是纤维素 在初生壁上还有半纤维素和果胶质 纤维素是由链状结构的-D-葡萄糖以1，4-葡萄 糖苷键结合，纤维素分子束聚集——微纤丝 —— 植物细胞壁的框架，而其他物质填充在微纤丝之 生化分离工程 第三章 第三章 | 植物细胞壁的框架，而其他物质填充在微纤丝之 间的空隙中——植物细胞壁的基本结构。 在干燥植物体中纤维素约占总重的1/3一1/2。 植物细胞在生长分化过程中，细胞壁的结构、性 质不断改变，使细胞壁具有一定的功能。 在纤维素细胞的框架中添加木质素 (gnin)将产生 木质化，增加细胞的硬度，增强细胞的支持力; 植物体暴露在空气中的表面细胞壁中添加角质 (脂 类化合物)，可使细胞壁透水性降低，增强了细胞 生化分离工程 第三章 第三章 | 某些植物细胞壁中渗人二氧化硅而发生硅质化， 加强了细胞壁的硬度。 壁的保护作用; 细胞壁还可以栓质化，使细胞不透水、不透气，增 强保护作用;
第三节细胞机械破碎法 Mechanical Disruption ★ (1)高西淘敢法 富填包酸速感地量动为堡有■站 1(s)=k.pa.No 上为破碎度常数 片述数威徽生的科类和培养泰件的不同而有 2)2N 细施被体本用包内声物释故本来景 S- 2、属领典量少在周款处壤少量禅方然鼎为 用龙国： 影响因景： 1、量用于球番和大多数如营细他； 2、度写达20%： 工、不周首种，不周生长期以及不周婚林未件。 4
4 Mechanical Disruption 生化分离工程 第三章 | 1、处理量大，破碎快，时间短，效率较高，工业规 模的重要手段； 2、作用力：挤压，剪切和撞击作用； 3、在许多情况下，细胞内含物全部释放出来； 4、由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施。 机械法破碎特点 生化分离工程 第三章 第三章 | 机械破碎主要的方法有： 珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。 （high-pressure homogenization） 原理：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减 压和高速撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历 了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造 成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放。 （1）高压匀浆法 生化分离工程 第三章 第三章 | 高速匀浆破碎的动力学方程为： a b ln 1S k P N 1 细胞破碎率S与操作压力P和循环次数N之间的关系 k为破碎速度常数 生化分离工程 第三章 第三章 | 上述参数随微生物种类和培养条件的不同而有 所差异 压力P可用动能表达： a b n S N u l k ) 2 ( 2 1 1 影响因素 细胞破碎率用包内产物释放率表示： Rmax R S 生化分离工程 第三章 第三章 | 影响因素： 1、压力、温度和通过匀浆器阀的次数，操作压力影 响最大。工业生产中常采用的压力为55－70Mpa。 2、不同菌种，不同生长期以及不同培养条件。 优点： 1、操作参数少，且易于确定； 2、样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好 3、适用于酵母和大多数细胞的破碎。 适用范围： 生化分离工程 第三章 第三章 | 1、适用于酵母和大多数细菌细胞； 2、细胞浓度可达20%； 3、团状或丝状真菌易造成堵塞，一些易损伤匀浆 阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用； 4、需设置冷却装置
(2)法(Bead milling) 可采用间秋式与连埃操作。 作用力：剪切力层之间的碰禮和磨料的漆动 =k1 t W/ 内的平 1=5 、减如真种腾百择； 之、周一地料域成，知展球成十，则孩耶本十，装民小： 经w米 b:者D0I, (3)撞击或碎 国4均收技生方支提中 的现象 5
5 原理：细胞悬浮液与玻璃珠（石英砂，或氧化铝） 一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎， （2）珠磨法（Bead milling） 作用力：剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动 生化分离工程 第三章 第三章 | 两种情况下，细胞破碎动力学可近似表示为： l k t n S 1 1 t：为细胞悬浮液在破碎室内的平均 可采用间歇式与连续操作。 间歇操作：t：为破碎操作时间 连续操作： 生化分离工程 第三章 第三章 | Q V t 停留时间 其中：V 为悬浮液体积m3，Q为悬浮液流量m3/S，S为破碎率， k为破碎速率常数，与许多因素有关。 即 1 随细胞种类而异 搅拌转速 悬浮液进料速率 微球大小 微球填充密度 细胞浓度 微球密度 温度 搅拌桨设计 破碎室的几何形状 影响 生化分离工程 第三章 第三章 | 1、随细胞种类而异； 2、同一进料速度，细胞浓度，则破碎率，能耗； 3、同一悬浮液中，破碎的能耗与破碎率成正比，提高破碎 率，导致电能消耗增加； 4、对一定细胞，存在适宜的微球粒径，通常D/d=30-100， D：微球粒径；d：目标细胞粒径。 1、操作简便稳定，破碎率可控制，易放大 2、在实验室和工业规模上已得到应用 3、适用于绝大多数微生物细胞破碎，特别对于有大 量菌丝体的微生物和一些有亚细胞器（质地坚硬） 的微生物细胞。 优点： 生化分离工程 第三章 第三章 | 缺点： 破碎过程产生大量的热能，有效能量利用率 仅为1%，应充分考虑换热。 （3）撞击破碎 原理：将细胞冷冻可使其成为刚性球体，降低破 碎的难度。 如图：细胞悬浮液以喷雾 状高速冻结 形成粒径小 生化分离工程 第三章 第三章 | ，形成粒径小 于50 m的微粒子。高 速 载气 (如氮气，流速约 300m/s)。将冻结的微粒 子送入破碎室，高速撞击 撞击板，使冻结的细胞发 生破碎。 1、细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细 胞破碎均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎 的现象。 2、细胞破碎程度可通过无级调节载气压力 (流速 )控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器 特点： 生化分离工程 第三章 第三章 | (如线粒体、叶绿体等)的回收。 3、适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎， 通常处理细胞悬浮液浓度为10%-20%。 4、实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力约50- 500cm3，而工业规模的连续处理在l0dm3/h以上
形响： 机里与空化现象起的冲和力 有美 细胞种类、浓度、处理时间以及超声波的声频 特点： 处理少量样品时操作方便，液体损伤少 空化作用 机械作用 热数应 于大规 操作，主要用于实脸室规模的细馳破碎 细胞物理玻碎法比较 第四节细胞化学破碎法 Chemical Methods 1.城处理 2.化学减荆法 利用酸碱调节值，可提高目标产物滤解度。 吸-1.5-12.5碱处理20-30咖1n可导敌期胞毫斯 优燕：价格便宜，易适于任何规模的禄作。 1).EDTA 整合州，时幅胞的外层膜有破杯作用。如B-co1i: 陵囊白关，禁活“ 磨是民微外隆质交州是之婆兰氏帆 合作用子致外层膜不穗定成去除。 6
6 （4）超声波破碎法 破碎机理：是与空化现象引起的冲击波和剪切力 有关，即空穴作用产生的空穴泡由于又受到超声 波的冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击 力压力，由此而引起悬浮细胞上产生了剪切应使 细胞内液体产生流动而使细胞破碎。 (Ultrasonication) 生化分离工程 第三章 第三章 | 空化作用 机械作用 热效应 1、处理少量样品时操作方便，液体损伤量少， 影响： 细胞种类、浓度、处理时间以及超声波的声频 特点： 生化分离工程 第三章 | 破碎率高。 2、有效能量利率极低，操作时需在冰水中进行 或通入冷却剂而增加成本，不易放大； 3、适用于大多数微生物的破碎，不适于大规模 操作，主要用于实验室规模的细胞破碎。 方法 技术 原理 效果 成本 举例 研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 超声波法 用超声波的空穴作用 使细胞破碎 适中 昂贵 细胞悬浮液小 规模处理 细胞物理破碎法比较 生化分离工程 第三章 | 机械法 使细胞破碎 规模处理 匀浆法 （孔型） 须使细胞通过的小孔 ，使细胞受到剪切力 而破碎 剧烈 适中 细胞悬浮液大 规模处理 珠磨破碎 法 细胞被玻璃珠或铁珠 捣碎 剧烈 便宜 细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理 Chemical Methods 生化分离工程 第三章 | 1. 碱处理 利用酸碱调节pH值，可提高目标产物溶解度。 pH= 11.5-12.5碱处理 20－30min可导致细胞溶解 优点：价格便宜，易适于任何规模的操作。 生化分离工程 第三章 第三章 | 缺点：pH=11－11.5的碱浓度破坏了许多生物活性 使蛋白酶失活，常伴随着蛋白的变性和降解。 2. 化学试剂法 化学渗透取决于试剂的类型和细胞壁、细胞 膜的结构与形成。 1). EDTA 生化分离工程 第三章 第三章 | 螯合剂，对细胞的外层膜有破坏作用。如E-coli； 原因：二价阳离子，尤其是Mg2＋对革兰氏阴性菌 细胞被膜以外层膜的稳定作用是重要的，EDTA的螯 合作用导致外层膜不稳定或去除
3).表面活性剂 2.有机溶剂法 设 作用是绵白质和线成白一脂界面。 3.生物法 4.细脆物瘦破碎方法 渗透压冲击法(Osmotic Shock) 原理 铁：费用高，对周长，用于原史 特： 5.冷沫一融化法(Frecring an thawing) 1、最温和的一种方法 原理 2、选择性高，秤放迷度快，工艺简单，易放大 的形成和的融化行细 个冻的目的 峡点 缺点： 存在着高益浓度对产品污染问题。 的一利用
7 可使细胞膜表面发生变化，胞内产物可以释放 出来，由于没有整体破碎细胞，可实现选择性 释放. 2). 有机溶剂法 生化分离工程 第三章 第三章 | 如采用异丙醇处理酵母，释放超氧化物歧化酶， 处理后，超氧化物歧化酶释放率达90％，纯化因 子提高25。 能够作用细胞质和细胞壁膜，膜结构中的脂蛋白 成分被或多或少地溶解，使细胞渗透作用有利于 某些蛋白的通过。如：SDS等 作用是溶解蛋白质和扰乱蛋白－脂界面。 3).表面活性剂 生化分离工程 第三章 第三章 | 化学渗透法的优点：避免大量细胞碎片，核酸留 在胞内，处理后，溶液很容易澄清，简化后处理 步骤，简单的搅拌容器代替了机械破碎设备。 缺点是价格昂贵，易污染产物，会导致产物活性和 最优产量的不可逆损失。 3. 生物法 酶溶法是利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键 而达到破壁的目的，以提高胞内产物和通透性。 优点：生物转移性强，操作条件温和、能量低、 可避免高剪切力，确保产物破坏最小。 生化分离工程 第三章 第三章 | 缺点：费用高，时间长，多用于原生质体 自溶作用是酶溶的另一种方式，通过调节温度， pH或添加有机溶剂等激活剂，诱使细胞产生溶解 自身的酶的方法，称为自溶。 渗透压冲击法（Osmotic Shock） 将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的 甘油或蔗糖溶液） 达到平衡后 介质被突然 4. 细胞物理破碎方法 原理 生化分离工程 第三章 第三章 | 甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然 稀释，或者将细胞转入缓冲液中，由于渗透压 的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入 细胞，引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而使细胞 通透性增大。 1、最温和的一种方法 2、选择性高，释放速度快，工艺简单，易放大 3、适用于易破碎的细胞，和细胞壁预先受到酶 处理的细胞，及合成受抑制而强度减弱的细胞， 特点： 生化分离工程 第三章 第三章 | 处理的细胞，及合成受抑制而强度减弱的细胞， 如动物细胞和革兰氏阴性菌。 缺点： 存在着高盐浓度对产品污染问题。 5. 冷冻－融化法 (Freczing an thawing) 破坏细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性，而 且由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗 通过水结晶的形成和随后的融化而进行细胞破碎。 原理 冷冻的目的 生化分离工程 第三章 第三章 | 透压作用下引起细胞膨胀而破裂。 本法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物 释放较为有效，但由于本法成本高，只能进行小规 模应用，且释放速率慢、产量低，另外酶易失活也 限制了它的更进一步利用。 缺点
6.胞内产物的选择性释放 问题关能：丁解标产物的性质及其所在位 ⑧原则： 朵整架晚不究金成碎、选择性导效，共他的质 透：利用两种以上的不同阶的分高过 END 8
8 6. 胞内产物的选择性释放 细胞完全破碎的缺点：所有胞内的蛋白质全部 释放出来，粘度增加，杂质增加，给后面分离 纯化带来困难。 目标：细胞不完全破碎，选择性释放，其他物质 尽量少释放，粗分。 生化分离工程 第三章 第三章 | 生化集成：利用两种以上的不同阶段的分离过程 同时进行。 原因：例如利用珠磨法破碎酵母细胞时，各种酶 的释放速度不同，靠近细胞膜和细胞壁的酶先释 放，细胞内部或细胞器内后释放。 问题关键：了解目标产物的性质及其所在位置 （1）破坏或破碎存在目标产物的位置。 如：存在于膜附近时，可采用温和的方法，如酶溶法，渗 透压冲击法和冻结—融化法； 存在于细胞质内时，只能采用强烈的机械破碎法。 原则： 生化分离工程 第三章 第三章 | 存在于细胞质内时，只能采用强烈的机械破碎法。 （2）选择性溶解目标产物 当目标物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节pH 值，离子强度或添加与目标产物具有亲和力的试剂使目标 物易于释放，其他杂质不易溶出。同时可采用生化集成 生化分离工程 第三章 |