第十章 蛋白质的测定 第一节 食品中 pro 的含量 ⚫ 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大。由 C、H、O、N、S 五种元素组成。 蛋白质溶液是典型的胶体分散系，是具有光学活性的两性物质。 ⚫ 食品中蛋白质的含量分布是不平衡的。一般植物组织的含量低于动物组织。 植物中 pro 含量很少，一般为 0.5—3%（鲜重），在果实中一般为 0.4—1.5%（鲜重）， 黄豆中 pro 可达 40%。由动物中肌肉及内脏中 pro 含量校多。牛肉 20.1%,乳粉 26.2% ⚫ 蛋白质的定量是基于测定总有机氮。但某些物质又含有大量的非蛋白氮化合物 （如马铃薯等），必须把 pro 提出来，分别测总氮及非蛋白氮就得到纯蛋白氮。Pro 的量一般是按照总氮量乘上一个合适的蛋白质换算系数来求得的。这个系数决定于 物质中 pro 的含氮量。Pro 的含氮量一般为 15—17.6% 。如为 16%则换算系数为=6.25 （鸡蛋、青豆、肉、玉米等） 第二节 pro 定量法 ⚫ 物理方法：折射率、比重、紫外吸收等方法，操作简便。 ⚫ 化学方法：凯氏定氮法、杜马法、双缩脲法、福林(Folin)——酚试剂法、染料结合 法。 ⚫ 这些方法中定氮法、双缩脲法，物理法，是利用 pro 共性（如含氮量、肽键、折射 率等）的方法。其它方法是利用 pro 的特定氨基酸残基（芳香基、酸性基团、碱性 基团等）的方法。 最基本和最常用的方法是测定总氮量，再由总氮量计算蛋白 质含量。凯氏定氮法和杜马法。 ⚫ 凯氏定氮法：最准确和操作最简单的方法之一同时测定多个样品是法定的标准检方 法。 ⚫ 杜马法：多半用于有机分析，很少用于食品分析 ⚫ 双缩脲反应法：在碱性环境中，双缩脲与 CuSO4 结合生成红紫色的络合物，此法称 为双缩脲反应法。双缩脲法和酚试剂法是生物领域进行科学研究经常使用的方法。 ⚫ 染料结合法：正在急速发展的新方法。 ⚫ 一、半微量凯氏定氮法（微量、常量凯氏定氮法） ⚫ 1、原理：蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化使蛋白质分解。分解的氨与硫酸生成 硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨分离。用硼酸吸收后，再用标准硫酸或盐酸滴定，根据 酸的消耗量乘以换算系数。即为蛋白质含量。 ⚫ 2、过程：消化——蒸馏——吸收与滴定 ⚫ （1）消化：样品中含氮有机化合物经浓 H2SO4 加热消化，SO2 使 N 还原为 NH3 气，NH3 与硫酸结合成（NH3）2SO4。硫酸使有机物脱水，有机物炭化生成碳，C 将 H2SO4 还原为 SO2，C 变为 CO2。SO2 使 N 还原为 NH3，SO2 氧化为 SO3， NH3+H2SO4————（NH4）2SO4 ⚫ （2）蒸馏：（NH3）2SO4 在碱性条件下，释放出氨。 ⚫ （3）吸收与滴定：蒸馏时放出的氨，可用一定量的标准硫酸溶液吸收，用标准 NaOH 反滴定过量的 H2SO4，（或用硼酸溶液吸收，再用标准 HCL 或 H2SO4 溶液直接滴 定。）则计算出总氮量，推算 pro 含量。 ⚫ 反应如下：2CH3CHNH2COOH+13H2SO4—— ⚫ （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O （ pro 为氨基丙酸） ⚫ （NH4）2SO4+2NaOH——２NH3+2H2O+Na2SO4 ⚫ NH4HB4O7+HCL+5H2O——NH4CL+4H3BO3
第十章 蛋白质的测定 第一节 食品中 pro 的含量 ⚫ 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大。由 C、H、O、N、S 五种元素组成。 蛋白质溶液是典型的胶体分散系，是具有光学活性的两性物质。 ⚫ 食品中蛋白质的含量分布是不平衡的。一般植物组织的含量低于动物组织。 植物中 pro 含量很少，一般为 0.5—3%（鲜重），在果实中一般为 0.4—1.5%（鲜重）， 黄豆中 pro 可达 40%。由动物中肌肉及内脏中 pro 含量校多。牛肉 20.1%,乳粉 26.2% ⚫ 蛋白质的定量是基于测定总有机氮。但某些物质又含有大量的非蛋白氮化合物 （如马铃薯等），必须把 pro 提出来，分别测总氮及非蛋白氮就得到纯蛋白氮。Pro 的量一般是按照总氮量乘上一个合适的蛋白质换算系数来求得的。这个系数决定于 物质中 pro 的含氮量。Pro 的含氮量一般为 15—17.6% 。如为 16%则换算系数为=6.25 （鸡蛋、青豆、肉、玉米等） 第二节 pro 定量法 ⚫ 物理方法：折射率、比重、紫外吸收等方法，操作简便。 ⚫ 化学方法：凯氏定氮法、杜马法、双缩脲法、福林(Folin)——酚试剂法、染料结合 法。 ⚫ 这些方法中定氮法、双缩脲法，物理法，是利用 pro 共性（如含氮量、肽键、折射 率等）的方法。其它方法是利用 pro 的特定氨基酸残基（芳香基、酸性基团、碱性 基团等）的方法。 最基本和最常用的方法是测定总氮量，再由总氮量计算蛋白 质含量。凯氏定氮法和杜马法。 ⚫ 凯氏定氮法：最准确和操作最简单的方法之一同时测定多个样品是法定的标准检方 法。 ⚫ 杜马法：多半用于有机分析，很少用于食品分析 ⚫ 双缩脲反应法：在碱性环境中，双缩脲与 CuSO4 结合生成红紫色的络合物，此法称 为双缩脲反应法。双缩脲法和酚试剂法是生物领域进行科学研究经常使用的方法。 ⚫ 染料结合法：正在急速发展的新方法。 ⚫ 一、半微量凯氏定氮法（微量、常量凯氏定氮法） ⚫ 1、原理：蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化使蛋白质分解。分解的氨与硫酸生成 硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨分离。用硼酸吸收后，再用标准硫酸或盐酸滴定，根据 酸的消耗量乘以换算系数。即为蛋白质含量。 ⚫ 2、过程：消化——蒸馏——吸收与滴定 ⚫ （1）消化：样品中含氮有机化合物经浓 H2SO4 加热消化，SO2 使 N 还原为 NH3 气，NH3 与硫酸结合成（NH3）2SO4。硫酸使有机物脱水，有机物炭化生成碳，C 将 H2SO4 还原为 SO2，C 变为 CO2。SO2 使 N 还原为 NH3，SO2 氧化为 SO3， NH3+H2SO4————（NH4）2SO4 ⚫ （2）蒸馏：（NH3）2SO4 在碱性条件下，释放出氨。 ⚫ （3）吸收与滴定：蒸馏时放出的氨，可用一定量的标准硫酸溶液吸收，用标准 NaOH 反滴定过量的 H2SO4，（或用硼酸溶液吸收，再用标准 HCL 或 H2SO4 溶液直接滴 定。）则计算出总氮量，推算 pro 含量。 ⚫ 反应如下：2CH3CHNH2COOH+13H2SO4—— ⚫ （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O （ pro 为氨基丙酸） ⚫ （NH4）2SO4+2NaOH——２NH3+2H2O+Na2SO4 ⚫ NH4HB4O7+HCL+5H2O——NH4CL+4H3BO3
⚫ 3、样品的分解条件： ⚫ 在消化过程中，为了加速分解过程，常加入下列物质： ⚫ （1）K2SO4 或 Na2SO4 作用：是提高溶液的沸点，加速对有机物的分解作用。 Na2SO4 不及 K2SO4 效果好。 ⚫ （2）催化剂：而且 Hgo.Hg 是剧毒物质。注意通风污染环境价格贵。 ⚫ a.CuSO4 作催化剂呈蓝色，还可作下一步蒸馏时作碱性反应的指示剂。 ⚫ b.氧化汞和汞：HgO 是效能较高的催化剂，可得氮的最佳回收率。注意：容易生成 硫化汞沉淀可使反应液引起暴沸，防止暴沸的措施是添加锌粒。而且 Hgo.Hg 是剧 毒物质。注意通风污染环境价格贵。 ⚫ c.硒粉：催化效能较强，可大大缩短消化 时间，但用量不宜过多，消化时间不可过 久，并小心控制温度，否则将引起氮素损失。 ⚫ (3)氧化剂：添加氧化剂是帮助有机物消化，但要防止 NH3 进一步氧化为 N。 ⚫ a.次氯酸钾和高锰酸钾：强氧化剂会使氨氧化为氮而损失，一般不易使用，但含 C 高时，可用 KmnO4 。 ⚫ b.过氧化氢：消化速度高，操作简便，须冷却后加入过氧化氢。 ⚫ 4、具体操作步骤： ⚫ （1）、消化： ⚫ 精密称取固体样品 0.2—2g,半固态 2—5g 液体样品 10—20ml 于凯氏烧瓶 （30—50ml）加入无水 K2SO42g,CuSO40.2 H2SO4 20ml 。 凯氏烧瓶成 45 倾斜先 小火加热待泡沫停止后加大火（330—400），直到溶液澄清透明为止（3—4h)。冷却 后加水定容（数次冲洗，使溶液全部注入容瓶） ⚫ （2）、蒸馏： ⚫ 将 2%硼酸溶液 10ml 放入 100ml 三角瓶中，加入甲基红混和指示剂 5 滴，将冷凝管 尖端浸入液面下。将凯氏烧瓶中的内容物移入蒸馏瓶中 40%NaOH10ml 加热蒸馏， 至硼酸液由酒红色变为蓝绿色时，继续蒸馏 5 分钟，将冷凝管尖端提出液面，冲洗 尖端。 ⚫ （3）、滴定： ⚫ 馏出液用 0.01N 标准 HCL 溶液滴定，直到 蓝绿色变为灰紫色。并将滴定结果用空 白试验校正。 ⚫ （4）、计算： ⚫ 蛋白质（%）=（V1-V2）*N*0.014*6.25/W *100 ⚫ V1—品滴定时用去 0.01mol 标准 HCL 液毫升数 ⚫ V2—空白滴定时用去 0.01molHcL 毫升数 ⚫ N—标准 HCL 溶液的当量浓度 ⚫ 0.014—1ml1molHCL 相当于 0.014g 氮 ⚫ 6.25—N 的 pro 换算系数 ⚫ W—样品克数 ⚫ 二、常量凯氏定氮法： ⚫ 1、消化：样品中含氮有机化合物经浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水，然后，有 机物炭化生成碳；碳将硫酸还原为 SO2，本身则变成二氧化碳；二氧化硫使氮还原 为氨，本身则氧化为 SO3，而消化过程生成的氢，又加速了氨的形成。在反应过程 中，生成物水和 SO3 逸去，而 NH3 则与硫酸结合成硫酸铵，留在溶液中。 ⚫ 2、蒸馏：硫酸铵在碱性条件下，释放出氨。 ⚫ 3、吸收与滴定：蒸馏过程中所放出的氨，可用一定量的标准硫酸溶液吸收，然后再
⚫ 3、样品的分解条件： ⚫ 在消化过程中，为了加速分解过程，常加入下列物质： ⚫ （1）K2SO4 或 Na2SO4 作用：是提高溶液的沸点，加速对有机物的分解作用。 Na2SO4 不及 K2SO4 效果好。 ⚫ （2）催化剂：而且 Hgo.Hg 是剧毒物质。注意通风污染环境价格贵。 ⚫ a.CuSO4 作催化剂呈蓝色，还可作下一步蒸馏时作碱性反应的指示剂。 ⚫ b.氧化汞和汞：HgO 是效能较高的催化剂，可得氮的最佳回收率。注意：容易生成 硫化汞沉淀可使反应液引起暴沸，防止暴沸的措施是添加锌粒。而且 Hgo.Hg 是剧 毒物质。注意通风污染环境价格贵。 ⚫ c.硒粉：催化效能较强，可大大缩短消化 时间，但用量不宜过多，消化时间不可过 久，并小心控制温度，否则将引起氮素损失。 ⚫ (3)氧化剂：添加氧化剂是帮助有机物消化，但要防止 NH3 进一步氧化为 N。 ⚫ a.次氯酸钾和高锰酸钾：强氧化剂会使氨氧化为氮而损失，一般不易使用，但含 C 高时，可用 KmnO4 。 ⚫ b.过氧化氢：消化速度高，操作简便，须冷却后加入过氧化氢。 ⚫ 4、具体操作步骤： ⚫ （1）、消化： ⚫ 精密称取固体样品 0.2—2g,半固态 2—5g 液体样品 10—20ml 于凯氏烧瓶 （30—50ml）加入无水 K2SO42g,CuSO40.2 H2SO4 20ml 。 凯氏烧瓶成 45 倾斜先 小火加热待泡沫停止后加大火（330—400），直到溶液澄清透明为止（3—4h)。冷却 后加水定容（数次冲洗，使溶液全部注入容瓶） ⚫ （2）、蒸馏： ⚫ 将 2%硼酸溶液 10ml 放入 100ml 三角瓶中，加入甲基红混和指示剂 5 滴，将冷凝管 尖端浸入液面下。将凯氏烧瓶中的内容物移入蒸馏瓶中 40%NaOH10ml 加热蒸馏， 至硼酸液由酒红色变为蓝绿色时，继续蒸馏 5 分钟，将冷凝管尖端提出液面，冲洗 尖端。 ⚫ （3）、滴定： ⚫ 馏出液用 0.01N 标准 HCL 溶液滴定，直到 蓝绿色变为灰紫色。并将滴定结果用空 白试验校正。 ⚫ （4）、计算： ⚫ 蛋白质（%）=（V1-V2）*N*0.014*6.25/W *100 ⚫ V1—品滴定时用去 0.01mol 标准 HCL 液毫升数 ⚫ V2—空白滴定时用去 0.01molHcL 毫升数 ⚫ N—标准 HCL 溶液的当量浓度 ⚫ 0.014—1ml1molHCL 相当于 0.014g 氮 ⚫ 6.25—N 的 pro 换算系数 ⚫ W—样品克数 ⚫ 二、常量凯氏定氮法： ⚫ 1、消化：样品中含氮有机化合物经浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水，然后，有 机物炭化生成碳；碳将硫酸还原为 SO2，本身则变成二氧化碳；二氧化硫使氮还原 为氨，本身则氧化为 SO3，而消化过程生成的氢，又加速了氨的形成。在反应过程 中，生成物水和 SO3 逸去，而 NH3 则与硫酸结合成硫酸铵，留在溶液中。 ⚫ 2、蒸馏：硫酸铵在碱性条件下，释放出氨。 ⚫ 3、吸收与滴定：蒸馏过程中所放出的氨，可用一定量的标准硫酸溶液吸收，然后再
用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸溶液，这样便可计算出总氮量，进而推算出 蛋白质含量。 ⚫ 此法的消化原理和步骤与半微量凯氏定氮法基本上一致，所不同的是样品量 和试剂用量不同，另有一套适合于常量测定的仪器装置。 ⚫ 三、含硝食品的测定： ⚫ 一般，在生物材料中，亚硝酸盐含量很少，可是，有的样品中硝酸盐含量较大，例 如菠菜、萝卜、胡萝卜等蔬菜（根部尤其）和西瓜、甜瓜、草莓等水果（特别是外 果和皮部）其硝酸盐含量有时可高达 1000ppm，要准确测定这些样品中总氮量时则 需要特殊的操作。 ⚫ 方法提要：（以硝酸盐、亚硝酸盐形式存在的氮在前述凯氏法中消化时将成为硝酸和 亚硝酸挥发损失。）实验中加入水杨酸使硝态氮变成硝基水杨酸固定下来，加入硫代 硫酸钠使其还原为氨基化合物，在浓硫酸作用下分解，最后变成硫酸铵，然后按凯 氏法定氮。 ⚫ 四、染料结合法 ⚫ 方法提要：凡是来源相同的蛋白质，碱性（或酸性）氨基酸的含量，大体上是相同 的。利用这个特点，加入过量的酸性（或碱性）染料，使其和蛋白质形成不溶性盐 而沉淀析出。用分光光度计测定未反应的染料量，然后根据算出来的结合染料量求 出蛋白质含量。 ⚫ 五、其他方法 ⚫ 1、双缩脲法：双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物此反应称为 双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故能呈此反应。 ⚫ 2、紫外线吸收光谱法：是直接测定芳香族氨基酸对紫外线吸收光谱（酪氨酸和色氨 酸的最大吸收为 280 纳米）及肽键对紫外线吸收光谱（肽键的最大吸收为 190 纳米） 来定量蛋白质的一种分析方法。紫外线吸收光谱法首先用来测定牛乳中的蛋白质含 量，用这个方法也可测定小麦面粉、豆类、蛋黄及肉制品的蛋白质含量。 ⚫ 3、酚试剂法：酚试剂法就是来自酚试剂（磷钼酸、磷钨酸的混合液）和蛋白质中芳 香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸）的呈色反应与双缩脲反应的复合方法
用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸溶液，这样便可计算出总氮量，进而推算出 蛋白质含量。 ⚫ 此法的消化原理和步骤与半微量凯氏定氮法基本上一致，所不同的是样品量 和试剂用量不同，另有一套适合于常量测定的仪器装置。 ⚫ 三、含硝食品的测定： ⚫ 一般，在生物材料中，亚硝酸盐含量很少，可是，有的样品中硝酸盐含量较大，例 如菠菜、萝卜、胡萝卜等蔬菜（根部尤其）和西瓜、甜瓜、草莓等水果（特别是外 果和皮部）其硝酸盐含量有时可高达 1000ppm，要准确测定这些样品中总氮量时则 需要特殊的操作。 ⚫ 方法提要：（以硝酸盐、亚硝酸盐形式存在的氮在前述凯氏法中消化时将成为硝酸和 亚硝酸挥发损失。）实验中加入水杨酸使硝态氮变成硝基水杨酸固定下来，加入硫代 硫酸钠使其还原为氨基化合物，在浓硫酸作用下分解，最后变成硫酸铵，然后按凯 氏法定氮。 ⚫ 四、染料结合法 ⚫ 方法提要：凡是来源相同的蛋白质，碱性（或酸性）氨基酸的含量，大体上是相同 的。利用这个特点，加入过量的酸性（或碱性）染料，使其和蛋白质形成不溶性盐 而沉淀析出。用分光光度计测定未反应的染料量，然后根据算出来的结合染料量求 出蛋白质含量。 ⚫ 五、其他方法 ⚫ 1、双缩脲法：双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物此反应称为 双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故能呈此反应。 ⚫ 2、紫外线吸收光谱法：是直接测定芳香族氨基酸对紫外线吸收光谱（酪氨酸和色氨 酸的最大吸收为 280 纳米）及肽键对紫外线吸收光谱（肽键的最大吸收为 190 纳米） 来定量蛋白质的一种分析方法。紫外线吸收光谱法首先用来测定牛乳中的蛋白质含 量，用这个方法也可测定小麦面粉、豆类、蛋黄及肉制品的蛋白质含量。 ⚫ 3、酚试剂法：酚试剂法就是来自酚试剂（磷钼酸、磷钨酸的混合液）和蛋白质中芳 香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸）的呈色反应与双缩脲反应的复合方法