第六章 食品中蛋白质的测定 【教学目标】： 1.掌握蛋白质、蛋白质消化的概念和知识； 2.了解蛋白质测定的原理、方法，熟练地掌握常量凯氏定氮法，掌握样品消化、蒸馏、吸 收的操作技能。 蛋白质是生命的物质基础，是构成人体及动植物细胞组织的重要成发之一，蛋白质在 体内有构成新生组织、修补组织及制造体内氧化还原所必需的酶和激素等生命基础物质的 用途及作用。食品中蛋白质含量的多少，不仅表示食品的质量，而且也关系着人体的健康。 因此，其蛋白质的含量有一定的规定。 一、标准方法（GB5009.5—85） （一）半微量凯氏定氮法 1 原理 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分 解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸 标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 2 试剂 所有度剂均用不含氨的蒸馏水配制。 （1）硫酸铜（CuSO4•5H2O）； （2）硫酸钾； （3）硫酸； （4）硼酸溶液（20g/L）； （5）混合指示液：1 份（1g/L）甲基红乙醇溶液与 5 份 1g/L 溴甲酚绿乙醇溶液临用时混 合。也可用 2 份（1g/L）甲基红乙醇溶液与 1 份 1g/L 次甲基蓝乙醇溶液，临用时混合。 （6）氢氧化钠溶液（400g/L）; (7) 标 准 滴 定 溶 液 ： 硫 酸 标 准 溶 液 [c(1/2H2SO4)=0.0500moL/L] 或 盐 酸 标 准 溶 液 [c(HCI)=0.0500moL/L]。 3 仪器 定氮蒸馏装置如图 3-5 所示。1-电炉；2-水蒸气发生器（2L 平底烧瓶）；3-螺旋夹； 4-小玻杯及棒状玻塞；5-反应室；6-反应室外层；7-橡皮管及螺旋夹；8-冷凝管；9-蒸馏液 接收瓶 4 操作方法 (1)样品处理：精密称取 0.02-2.00g 固体样品或 2.00-5.00g 半固体样品或吸取 10.00-20.00mL 液体样品（约相当于氮 30-40mg），移入干燥的 100mL 或 500mL 定氮瓶中，加入 0.2g 硫 酸铜，3g 硫酸钾及 20mL 硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45°斜于于小孔的 石棉网上，小心加热，待内容物全部碳化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体 微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热 0.5h。取下放冷，小心加 20mL 水，放冷 后，移入 100mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度， 混匀备用。同时做试剂空白试验。 (2)按图 3-5 装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约三分之二处，加甲基红指示剂数滴 及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水 蒸气发生瓶内的水。 (3)向接收瓶内加入 10mL 20g/L 硼酸溶液及混合指示剂 1-2 滴，并使冷凝管下端插入液面 下，吸取 10.0mL 样品消化稀释液，由小漏斗流入反应室，并以 10mL 水洗涤小烧杯使流入 反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞，将 10mL 400g/L 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞， 使其缓慢流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小烧杯中，以防漏气，夹紧螺旋夹 7， 开始蒸馏，蒸气通入反应室，使氨通过冷凝管而入接收瓶内，蒸馏 5min，移动接收瓶，使 冷凝管下端离开液面，再蒸馏 1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以 硫酸或盐酸标准溶液（0.05moL/L）滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时准确吸取 10mL 试剂
第六章 食品中蛋白质的测定 【教学目标】： 1.掌握蛋白质、蛋白质消化的概念和知识； 2.了解蛋白质测定的原理、方法，熟练地掌握常量凯氏定氮法，掌握样品消化、蒸馏、吸 收的操作技能。 蛋白质是生命的物质基础，是构成人体及动植物细胞组织的重要成发之一，蛋白质在 体内有构成新生组织、修补组织及制造体内氧化还原所必需的酶和激素等生命基础物质的 用途及作用。食品中蛋白质含量的多少，不仅表示食品的质量，而且也关系着人体的健康。 因此，其蛋白质的含量有一定的规定。 一、标准方法（GB5009.5—85） （一）半微量凯氏定氮法 1 原理 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分 解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸 标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 2 试剂 所有度剂均用不含氨的蒸馏水配制。 （1）硫酸铜（CuSO4•5H2O）； （2）硫酸钾； （3）硫酸； （4）硼酸溶液（20g/L）； （5）混合指示液：1 份（1g/L）甲基红乙醇溶液与 5 份 1g/L 溴甲酚绿乙醇溶液临用时混 合。也可用 2 份（1g/L）甲基红乙醇溶液与 1 份 1g/L 次甲基蓝乙醇溶液，临用时混合。 （6）氢氧化钠溶液（400g/L）; (7) 标 准 滴 定 溶 液 ： 硫 酸 标 准 溶 液 [c(1/2H2SO4)=0.0500moL/L] 或 盐 酸 标 准 溶 液 [c(HCI)=0.0500moL/L]。 3 仪器 定氮蒸馏装置如图 3-5 所示。1-电炉；2-水蒸气发生器（2L 平底烧瓶）；3-螺旋夹； 4-小玻杯及棒状玻塞；5-反应室；6-反应室外层；7-橡皮管及螺旋夹；8-冷凝管；9-蒸馏液 接收瓶 4 操作方法 (1)样品处理：精密称取 0.02-2.00g 固体样品或 2.00-5.00g 半固体样品或吸取 10.00-20.00mL 液体样品（约相当于氮 30-40mg），移入干燥的 100mL 或 500mL 定氮瓶中，加入 0.2g 硫 酸铜，3g 硫酸钾及 20mL 硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45°斜于于小孔的 石棉网上，小心加热，待内容物全部碳化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体 微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热 0.5h。取下放冷，小心加 20mL 水，放冷 后，移入 100mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度， 混匀备用。同时做试剂空白试验。 (2)按图 3-5 装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约三分之二处，加甲基红指示剂数滴 及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水 蒸气发生瓶内的水。 (3)向接收瓶内加入 10mL 20g/L 硼酸溶液及混合指示剂 1-2 滴，并使冷凝管下端插入液面 下，吸取 10.0mL 样品消化稀释液，由小漏斗流入反应室，并以 10mL 水洗涤小烧杯使流入 反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞，将 10mL 400g/L 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞， 使其缓慢流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小烧杯中，以防漏气，夹紧螺旋夹 7， 开始蒸馏，蒸气通入反应室，使氨通过冷凝管而入接收瓶内，蒸馏 5min，移动接收瓶，使 冷凝管下端离开液面，再蒸馏 1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以 硫酸或盐酸标准溶液（0.05moL/L）滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时准确吸取 10mL 试剂
空白消化液按（3）操作。 5 计算 100 100 10 1 2 0.014 − = F m V V c X .（3-9） 式中：X-样品中蛋白质的含量，g/100g(g/100mL); V1-样品消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL; V2-试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL; c-硫酸或盐酸标准溶液的浓度，moL/L; 0.014-1.00mL 硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000moL/L]或盐酸[c(HCI)=1.000moL/L]标准溶液 中相当的氮的质量，g; m-样品的质量(或体积)，g 或 mL; F-氮换算为蛋白质的系数。一般食物为 6.25；乳制品为 6.38；面粉为 5.70；玉米、 高梁为 6.24；花生为 5.46；米为 5.95；大豆及其制品为 5.71；肉与肉制品为 6.25；大麦、 小米、蒸麦、燕麦、裸麦为 5.83；芝麻、向日葵为 5.30。 6 说明 (1) 凯氏定氮法测定氮的含量，依据蛋白质中含氮的多少，换算为蛋白质的含量。 (2) 消化过程中，加入硫酸钾可以提高反应温度，加入硫酸铜作为催化剂，提高反应 速度。 (3) 蒸馏过程中，不能使系统漏气，放入碱液时，应小心、缓慢。 (4) 食品中含氮量一般为 15％-17.6％，根据不同食品含氮量略有差异，采用不同的换 算系数。以上换算系数是食品中含氮量为 16％的氮换算为蛋白质的系数。 (5) 食品中还有非蛋白质物质含氮，故用此法测定蛋白质称为粗蛋白。 (6) 蒸馏时，蒸汽发生要充足，均匀，加碱要够量，动作要快，防止氨损失。冷凝管出口应浸入吸收 液中，防止氨损失。 (7) 我国规定含乳饮料中蛋白质≽1.0％。 二、参考方法 （一）全量凯氏定氮法 1 原理 蛋白质为含氮有机物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的 氨与硫酸结合成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸的标准 溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 2 试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。 （1）硫酸铜； （2）硫酸钾； （3）硫酸； （4）混合指示液：1 份 1g/L 甲基红乙醇溶液与 5 份 1g/L 溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合， 也可用 2 份 1g/L 甲基红乙醇溶液与 1 份 1g/L 次甲基蓝乙醇溶液。临用时混合。 （5）氢氧化钠溶液（400g/L）; （6）硼酸溶液（20g/L）； （7）标准滴定 溶液：硫酸标 准溶液[ c(1/2H2SO4)=0.0500moL/L]或盐酸标准溶液 [c(HCI)=0.0500moL/L] 3 仪器 凯氏定氮装置如图 3-6 所示。 1-500mL 定氮瓶；2-定氮蒸馏球；3-节流夹；4-漏斗；5-冷凝 管；6-接收瓶 4 操作方法
空白消化液按（3）操作。 5 计算 100 100 10 1 2 0.014 − = F m V V c X .（3-9） 式中：X-样品中蛋白质的含量，g/100g(g/100mL); V1-样品消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL; V2-试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL; c-硫酸或盐酸标准溶液的浓度，moL/L; 0.014-1.00mL 硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000moL/L]或盐酸[c(HCI)=1.000moL/L]标准溶液 中相当的氮的质量，g; m-样品的质量(或体积)，g 或 mL; F-氮换算为蛋白质的系数。一般食物为 6.25；乳制品为 6.38；面粉为 5.70；玉米、 高梁为 6.24；花生为 5.46；米为 5.95；大豆及其制品为 5.71；肉与肉制品为 6.25；大麦、 小米、蒸麦、燕麦、裸麦为 5.83；芝麻、向日葵为 5.30。 6 说明 (1) 凯氏定氮法测定氮的含量，依据蛋白质中含氮的多少，换算为蛋白质的含量。 (2) 消化过程中，加入硫酸钾可以提高反应温度，加入硫酸铜作为催化剂，提高反应 速度。 (3) 蒸馏过程中，不能使系统漏气，放入碱液时，应小心、缓慢。 (4) 食品中含氮量一般为 15％-17.6％，根据不同食品含氮量略有差异，采用不同的换 算系数。以上换算系数是食品中含氮量为 16％的氮换算为蛋白质的系数。 (5) 食品中还有非蛋白质物质含氮，故用此法测定蛋白质称为粗蛋白。 (6) 蒸馏时，蒸汽发生要充足，均匀，加碱要够量，动作要快，防止氨损失。冷凝管出口应浸入吸收 液中，防止氨损失。 (7) 我国规定含乳饮料中蛋白质≽1.0％。 二、参考方法 （一）全量凯氏定氮法 1 原理 蛋白质为含氮有机物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的 氨与硫酸结合成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸的标准 溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 2 试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。 （1）硫酸铜； （2）硫酸钾； （3）硫酸； （4）混合指示液：1 份 1g/L 甲基红乙醇溶液与 5 份 1g/L 溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合， 也可用 2 份 1g/L 甲基红乙醇溶液与 1 份 1g/L 次甲基蓝乙醇溶液。临用时混合。 （5）氢氧化钠溶液（400g/L）; （6）硼酸溶液（20g/L）； （7）标准滴定 溶液：硫酸标 准溶液[ c(1/2H2SO4)=0.0500moL/L]或盐酸标准溶液 [c(HCI)=0.0500moL/L] 3 仪器 凯氏定氮装置如图 3-6 所示。 1-500mL 定氮瓶；2-定氮蒸馏球；3-节流夹；4-漏斗；5-冷凝 管；6-接收瓶 4 操作方法
（1）精密称取 0.20—2.00g 固体样品或 2-5g 半固体样品或吸取 10-20mL 液体样品(相当于 氮 30-40mg)，小心移入已干燥的 500mL 定氮瓶中，加入 0.5g 硫酸铜，10g 硫酸钾及 20mL 硫酸，稍摇匀后，于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45°斜支于有小圆孔的石棉网上，小心加 热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体沸腾（微沸）。至 液体呈蓝色澄清透明后，再继续加热 0.5h，放冷，小心加入 200mL 水，再放冷，连接已 准备好的蒸馏装置上，塞紧瓶口，冷凝管下端插入接收瓶液面下，接收瓶内盛有（20g/L）， 硼酸溶液 50mL 及 2-3 滴混合指示液。 （2）放松节流夹，通过漏斗倒入 70-80mL（400g/L）氢氧化钠溶液，并振摇定氮瓶，至 内容物转为深蓝色或产生褐色沉淀，再倒入 100mL 水，夹紧节流夹，加热蒸馏，至氨被完 全蒸出。停止加热前，先将接收瓶放下少许，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏 1min，然 后停止加热，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。 （3）以硫酸或盐酸标准溶液（0.0500moL/L）滴定至灰色为终点。同时做试剂空白试验。 5 计算 100 1 2 0.014 − = F m V V c X .（3-10） 式中 X-样品中蛋白质的含量，g/100g(g/100mL); V1-样品消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL; V2-试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL; c-硫酸或盐酸标准溶液的浓度，moL/L; 0.014-1.00mL 硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000moL/L]或盐酸[c(HCI)=1.000moL/L]标准溶液 中相当的氮的质量，g; m-样品的质量(或体积)，g 或 mL; F-氮换算为蛋白质的系数。 6 说明 本法为直接蒸馏法，蒸馏终点的确定对测定样品含量的准确程度影响很大，一般样品 馏出液超过 250mL，氮可完全蒸出，注意蒸馏时勿烧干
（1）精密称取 0.20—2.00g 固体样品或 2-5g 半固体样品或吸取 10-20mL 液体样品(相当于 氮 30-40mg)，小心移入已干燥的 500mL 定氮瓶中，加入 0.5g 硫酸铜，10g 硫酸钾及 20mL 硫酸，稍摇匀后，于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45°斜支于有小圆孔的石棉网上，小心加 热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体沸腾（微沸）。至 液体呈蓝色澄清透明后，再继续加热 0.5h，放冷，小心加入 200mL 水，再放冷，连接已 准备好的蒸馏装置上，塞紧瓶口，冷凝管下端插入接收瓶液面下，接收瓶内盛有（20g/L）， 硼酸溶液 50mL 及 2-3 滴混合指示液。 （2）放松节流夹，通过漏斗倒入 70-80mL（400g/L）氢氧化钠溶液，并振摇定氮瓶，至 内容物转为深蓝色或产生褐色沉淀，再倒入 100mL 水，夹紧节流夹，加热蒸馏，至氨被完 全蒸出。停止加热前，先将接收瓶放下少许，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏 1min，然 后停止加热，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。 （3）以硫酸或盐酸标准溶液（0.0500moL/L）滴定至灰色为终点。同时做试剂空白试验。 5 计算 100 1 2 0.014 − = F m V V c X .（3-10） 式中 X-样品中蛋白质的含量，g/100g(g/100mL); V1-样品消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL; V2-试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL; c-硫酸或盐酸标准溶液的浓度，moL/L; 0.014-1.00mL 硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000moL/L]或盐酸[c(HCI)=1.000moL/L]标准溶液 中相当的氮的质量，g; m-样品的质量(或体积)，g 或 mL; F-氮换算为蛋白质的系数。 6 说明 本法为直接蒸馏法，蒸馏终点的确定对测定样品含量的准确程度影响很大，一般样品 馏出液超过 250mL，氮可完全蒸出，注意蒸馏时勿烧干