温州医学院文本人类白细胞抗原分型_临床免疫学检验第二十七章.doc_大学文库

3 由于每份抗血清的特异性程度、效价不等，故 HLA 抗原的指定多不能单靠一份血清的结果。一般要求每种特异性最好能有 3 份以上的抗血清，然后根据多数原则指定抗原。表 33-2 HLA-A 抗原分型举例 NS ALS A 1 A 2 69 A 2 A 3 A 1 23 24 A 9 A 23 31 33 A 24 2403 A 10 A 25 26 A 25 A 26 34 66 A 33 34 A 33 34 68 A 11 A 11 A 1101 34 68 1A 1B 1C 1D 1E 1F 2F 2E 2D 02C 2B 2A 3A 3B 3C 3D 3E 3F 4F 标本 1 1 8 1 1 1 1 8 8 2 6 1 1 1 2 1 1 8 8 8 标本 2 1 8 1 8 8 2 1 1 8 1 1 1 1 2 8 8 1 1 1 结果：标本 1HLA-A 抗原表型为：A24、A1101 标本 2HLA-A 抗原表型为：A2、 A33 三、技术要点㈠血清板制备及保存商品化的血清板有 60 孔和 72 孔的，其下有一小平面，相当于一低倍镜视野。由于实验的总容量为 15～17μl，故全部实验在石蜡油下进行。在小孔中先加石蜡油，再加抗体 1μl，并设阴性、阳性对照，编写工作记录单。HLA 的抗体过去主要来自产妇，现在也有单克隆抗体可供使用。血清板内所加的抗体应包括该地区常见的特异性。每个特异性最好有 3 份以上抗体。检测Ⅱ类抗原时，需用血小板吸收抗血清以除去其中Ⅰ类抗体。制好的血清板存于-80℃，单克隆抗体血清板可存于 -20℃。用时解冻。㈡淋巴细胞检测Ⅰ类抗原可用淋巴细胞悬液或 T 淋巴细胞，检测 HLA-Ⅱ类抗原用 B 淋巴细胞。淋巴细胞悬液多由外周血以密度梯度离心法分离，也可从脾或淋巴结分离，淋巴细胞悬液要避免红细胞、血小板过多污染。B 细胞可用尼龙毛法或绵羊红细胞玫瑰花结法从淋巴细胞悬液中分离。现有商品免疫磁珠（Fluoro Beads），即一种表面结合有 T 或 B 细胞特有的 CD 分子单克隆抗体、可荧光染色、可磁化的金属颗粒。通过 CD 抗体与细胞特异性的结合，受磁力的吸引而分离。㈢补体补体用兔补体，20 只以上兔的血清混合。为保持补体活性，应当日分离血清，小量分装冻存，用时融化，用后弃去

问反应条件料有温度应在20一5℃之间。因为在分型血清中有可能存在细胞毒冷抗体，温度过低。可能会造成假阳性结果。料有时同应严格遵守，如时间不足，将使某些抗体反应不被显示。产生假阴性结果。封间过长，有可能使某生胥交叉反应是示出米，产生假阳性结果。四、方法评价血清学分型技术创立30多年，分型技术本身不断完善，首先是微量化，其次单克隆抗体的应用，提高了标准抗体的特异性，简化了抗血清筛选的过程，面免疫磁珠淋巴细胞分离技术使工、B淋巴细园的分离简便快速。CTC试险对Ⅲ1类A、B抗原分型结果基本可靠，仍是目前围A~【类抗原分型技术的主要方法之一。但对Ⅱ英抗的检测精差。总的说来山清学方法仅能检出A分子的超型和亚型，不能分拥同一特异性内不同的等位基因，故仅悬一种低分拼的分型方法。C除用于定型外，尚可用于抗体锦选及交叉配合试险。在交义配合试验中，用受者血清与供者淋巴细胞进行CD配试验，以检测受者体内是否存在抗供者LA抗原的抗体。第二节A细胞学分型法围AⅡ类抗原中的D与课抗凰过去均采用细胞学分型法检测，故又称D抗原(1 ymphocyte defimed antigen),。该法是以混合淋巴细散培养(mixed lymphocyte culture,LC)作为基罐技术。将两个个体的淋巴细鞋在体外共同料有，如果细胞表面的组织相容性抗源相同成相容，则相互刺激作用很小：如双方抗原不相容，则相互刺激转化为淋巴母细胞，细胞分裂增箱。增角的强度可通过形态学观黎，计算转化细酸的百分率或通过测定细胞转化过程中摄取州标记的陶腺嘧定核目的量来表示。此反应中各自淋巴细胞既可以是刺激细胞又是反应细胞，故又称为双向汇试验。实际工作中，为使结果分析简单化，常用单向C试验进行围-D、乱A-P抗原分型。根据试验中所用标准细胞的不同，又有阴性分型法和阳性分型法之分。 (1)阴性分型法，又称纯合子分型细胞法，将己知围太D抗原的纯合子分型细胞(h0 ozygote typing cell,TC)用丝裂霉素C(mitomycin C)或X线醒射处理，成为只有抗原激发能力而无增殖反应能力的“刺攆细胞”。将刺潘细胞与未经过这种处理的待测淋巴细胞进行混合培养6天，以摄入量判定结果。如出现淋巴细胞增殖反应。G用增高，则该特测淋巴细胞上不具有与“刺激细围”上相同的D抗原。如不增殖，G不增高则两者具有相同抗原。 (2☒阳性分型法：又称预致敏淋巴细胞定型法(primed1 mphocyte test,PLT),首先取有一个单倍体相同的两个个体的淋巴细胞进行混合培养，例如一个为/h,另一个为a/C,先将/c经X线照射作为制激细围，则反应细散a/凸只对©单倍体抗源起反应。经14天混合培养，反应细胞分裂增

4 ㈣反应条件孵育温度应在 20～25℃之间，因为在分型血清中有可能存在细胞毒冷抗体，温度过低，可能会造成假阳性结果。孵育时间应严格遵守，如时间不足，将使某些抗体反应不被显示，产生假阴性结果。时间过长，有可能使某些弱交叉反应显示出来，产生假阳性结果。四、方法评价血清学分型技术创立 30 多年，分型技术本身不断完善，首先是微量化，其次单克隆抗体的应用，提高了标准抗体的特异性，简化了抗血清筛选的过程，而免疫磁珠淋巴细胞分离技术使 T、B 淋巴细胞的分离简便快速。CDC 试验对 HLA-Ⅰ类 A、B 抗原分型结果基本可靠，仍是目前 HLA-Ⅰ类抗原分型技术的主要方法之一。但对Ⅱ类抗原的检测稍差。总的说来血清学方法仅能检出 HLA 分子的超型和亚型，不能分辨同一特异性内不同的等位基因，故仅是一种低分辨的分型方法。CDC 除用于定型外，尚可用于抗体筛选及交叉配合试验。在交叉配合试验中，用受者血清与供者淋巴细胞进行 CDC 试验，以检测受者体内是否存在抗供者 HLA 抗原的抗体。第二节 HLA 细胞学分型法 HLA-Ⅱ类抗原中的 D 与 DP 抗原过去均采用细胞学分型法检测，故又称 LD 抗原（lymphocyte defined antigen），。该法是以混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture，MLC）作为基础技术。将两个个体的淋巴细胞在体外共同孵育，如果细胞表面的组织相容性抗原相同或相容，则相互刺激作用很小；如双方抗原不相容，则相互刺激转化为淋巴母细胞，细胞分裂增殖。增殖的强度可通过形态学观察，计算转化细胞的百分率或通过测定细胞转化过程中摄取 3 H 标记的胸腺嘧啶核苷的量来表示。此反应中各自淋巴细胞既可以是刺激细胞又是反应细胞，故又称为双向 MLC 试验。实际工作中，为使结果分析简单化，常用单向 MLC 试验进行 HLA-D、HLA-DP 抗原分型。根据试验中所用标准细胞的不同，又有阴性分型法和阳性分型法之分。 ⑴阴性分型法：又称纯合子分型细胞法，将已知 HLA-D 抗原的纯合子分型细胞（homozygote typing cell,HTC）用丝裂霉素 C（mitomycin C）或 X 线照射处理，成为只有抗原激发能力而无增殖反应能力的“刺激细胞”。将刺激细胞与未经过这种处理的待测淋巴细胞进行混合培养 6 天，以 3 H 摄入量判定结果。如出现淋巴细胞增殖反应，cpm 增高，则该待测淋巴细胞上不具有与“刺激细胞”上相同的 HLA-D 抗原。如不增殖，cpm 不增高则两者具有相同抗原。 ⑵阳性分型法：又称预致敏淋巴细胞定型法（primed lymphocyte test,PLT），首先取有一个单倍体相同的两个个体的淋巴细胞进行混合培养，例如一个为 a/b,另一个为 a/c。先将 a/c 经 X 线照射作为刺激细胞，则反应细胞 a/b 只对 c 单倍体抗原起反应。经 9-14 天混合培养，反应细胞分裂增

殖逐渐停止，最后培养中面下已致敏的记忆细围，称为税致敏淋巴细图，分装液氮保存。风T试验时，以预政敏淋巴细胞作为反应细胞，受检者细胞经共袋莓素C(■tomycin C)或x线照射处理后作为刺藏细胞，将两种组胞混合培养。当受检者淋巴细胞具有与预致敏淋巴细胞免疫记忆的-即抗原相同时，1一2天后者即产生增殖反应。反之则不出现反应。团A细胞分型法由于分型标准细胞米源困难以及操作繁琐，实验流程长，近年米已被基因分型技术取代。第三节A的基因分型技术 0世纪0年代后，围A分子结构与基因核背酸序列分析研究的日登深入，许多新的等位基因被发现和确定。A等位基因序列间的高度同源性，致C试验出现较多、较强的交叉反应。C试验已不能检测到所有的等位基因及等位基因亚型的编码产物。近0年以来随着分子生物学技术的发展，尤其是聚合解链反应《黑)技术的创立，国内外己将ⅢA分型技术由经具的血清学技术转向分子生物学技术。目前常用的基因分型方法都在像基础上进行，它运较CC试验分辨率高。如C 只晚检出R4,分子生物学法则可检出限0101一*0124甚至更多。常用的方法有：C-序列特异引物分型法(polymerase chain reaction with sequence specific primer,PCR-SS),PC顺序特异性靠核昏酸探针杂交法(olymerase chain reaction1 th sequence-specifie oligonucleotide probe hybridization.PCR-SS0)、PCR-序列测定法(CR-sequencing)以及PCg- 限制性片段长度多志性分析法(estriction fragment1 ength polymorphis通，FP)等，现介招如下。一。景-序列特异引物分型法 19附2年累-序列特异引物分型技术（家-SSP)被用于LA的分型。该方法的原理是编码各种 A抗原表型的等位基因均可用相应的序列特异性引物(sequence specific priner,SSP)进行扩增，通过控制CR反应条作，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因，并设内对照以控制质量。扩增的！产物借助琼脂糖凝胶电冰，根据内对照条带的出现判定实验结果是否有效，根据是否存在特异性产物的电球条带直接速行围4基因分析。其主要步露如下： 1.基因N提取 2。根据A核苷酸碱基序列设计引物一套多对 3.PCR扩增目的林因底马 4.琼脂糖极校电冰 5.结果判断 5

5 殖逐渐停止，最后培养中留下已致敏的记忆细胞，称为预致敏淋巴细胞，分装液氮保存。PLT 试验时，以预致敏淋巴细胞作为反应细胞，受检者细胞经丝裂霉素 C（mitomycin C）或 X 线照射处理后作为刺激细胞，将两种细胞混合培养。当受检者淋巴细胞具有与预致敏淋巴细胞免疫记忆的 HLA-DP 抗原相同时，1-2 天后者即产生增殖反应，反之则不出现反应。 HLA 细胞分型法由于分型标准细胞来源困难以及操作繁琐，实验流程长，近年来已被基因分型技术取代。第三节 HLA 的基因分型技术 20 世纪 60 年代后，HLA 分子结构与基因核苷酸序列分析研究的日益深入，许多新的等位基因被发现和确定。HLA 等位基因序列间的高度同源性，致 CDC 试验出现较多、较强的交叉反应，CDC 试验已不能检测到所有的等位基因及等位基因亚型的编码产物。近 20 年以来随着分子生物学技术的发展，尤其是聚合酶链反应（PCR）技术的创立，国内外已将 HLA 分型技术由经典的血清学技术转向分子生物学技术。目前常用的基因分型方法都在 PCR 基础上进行，它远较 CDC 试验分辨率高。如 CDC 只能检出 DR4，分子生物学法则可检出 DR4*0401～*0424 甚至更多。常用的方法有：PCR-序列特异引物分型法（polymerase chain reaction with sequence specific primer, PCR-SSP）、PCR 顺序特异性寡核苷酸探针杂交法（ polymerase chain reaction with sequence-specific oligonucleotide probe hybridization,PCR-SSO）、PCR-序列测定法（PCR-sequencing）以及 PCR- 限制性片段长度多态性分析法（restriction fragment length polymorphism,RFLP）等，现介绍如下。一．PCR-序列特异引物分型法 1992 年 PCR-序列特异引物分型技术（PCR-SSP）被用于 HLA 的分型。该方法的原理是编码各种 HLA 抗原表型的等位基因均可用相应的序列特异性引物（sequence specific primer，SSP）进行扩增，通过控制 PCR 反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因，并设内对照以控制质量。扩增的 DNA 产物借助琼脂糖凝胶电泳，根据内对照条带的出现判定实验结果是否有效，根据是否存在特异性产物的电泳条带直接进行 HLA 基因分析。其主要步骤如下： 1．基因 DNA 提取 2．根据 HLA 核苷酸碱基序列设计引物一套多对 3． PCR 扩增目的基因 DNA 4．琼脂糖凝胶电泳 5．结果判断

图33-3PCR-SSP分型示意图用SS即分型法分辨度高，特异性强。扩增后处理过程简单，只需借助琅脂糖凝胶电林，根据是否出现特异性阳性条带判断结果。是目前应用最多的技术，该技术的最新进展包括：全自动化 PR-SSP技术，微量SS即技术，可用于用4I,I类抗原全套分型。二。P⑧顺序特异性寡核杆酸深针杂交法 1986年C像顺序特异性靠核日酸探针欢交法(CR-S0)首先用于HA-1基因的分里，其基本原理是，采用心R技术，以A特异性引物扩增目的NA,将扩增产物转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与放射性核素(P)或津放射性物质（解、地高辛等）标记的人工合成序列特异性寡核昔酸(SS0)探针进行杂交，根据其能否结合从而分裤出几乎所有己知序列的等位基因的转异性。主要实验步置： 1.制备基因组剧 2.P0g扩增 3。将目的风点样于尼龙膜上 4.预条交（加入预条交液） 5.杂交（加入杂交液和标记好的寡核皆酸深针）】 6.洗限（去除多余探针）】 7,检测杂交信号分子杂交可分为两种类型： 1。正向染交将代R扩增产物经碱变性后，点于销酸纤维素暖尼龙限上，用带有标记的序列特异性寡核酸在适当温度下杂交，再经洗膜，最后机据标记物的不同，采取相应的检测方法，显现染交信号。根据桑交结果判断待测标本的基因重。 2.反向杂交与正向杂交相反，反向条交是将非标记的序列特异性素核苷酸圆定在膜上，然后与带有标记物的C3产物条交. 由于【类抗原的等位基因比Ⅱ类的复染，故所需550深针量度大，而且各等位基因之间存在序列共享现象，因此该方法目前主要用于Ⅱ类抗原的检测。三。P0R-序列测定法 L六【类和Ⅱ类基因的NA序列己经明确，根据己知序列合成同义引物(sse)及反义引物 (antisense),扩增单链NA片段直接进行单蛙序列测试.将4种荧光标记的双税氧核糖核苷酸与质板NM末端碱基在C用稀环过程中结合后，再用高分辨率的案内桥院胺凝胶电袜，用自动测序仪

6 图 33-3 PCR-SSP 分型示意图 HLA-SSP 分型法分辨度高，特异性强，扩增后处理过程简单，只需借助琼脂糖凝胶电泳，根据是否出现特异性阳性条带判断结果。是目前应用最多的技术，该技术的最新进展包括：全自动化 PCR-SSP 技术、微量 SSP 技术，可用于 HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原全套分型。二．PCR 顺序特异性寡核苷酸探针杂交法 1986 年 PCR 顺序特异性寡核苷酸探针杂交法（PCR-SSO）首先用于 HLA-Ⅱ基因的分型，其基本原理是，采用 PCR 技术，以 HLA 特异性引物扩增目的 DNA，将扩增产物转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与放射性核素（32P）或非放射性物质（酶、地高辛等）标记的人工合成序列特异性寡核苷酸（SSO）探针进行杂交，根据其能否结合从而分辨出几乎所有已知序列的等位基因的特异性。主要实验步骤： 1．制备基因组 DNA 2． PCR 扩增 3．将目的 DNA 点样于尼龙膜上 4．预杂交（加入预杂交液） 5．杂交（加入杂交液和标记好的寡核苷酸探针） 6．洗膜（去除多余探针） 7．检测杂交信号分子杂交可分为两种类型： 1．正向杂交将 PCR 扩增产物经碱变性后，点于硝酸纤维素或尼龙膜上，用带有标记的序列特异性寡核苷酸在适当温度下杂交，再经洗膜，最后根据标记物的不同，采取相应的检测方法，显现杂交信号。根据杂交结果判断待测标本的基因型。 2．反向杂交与正向杂交相反，反向杂交是将非标记的序列特异性寡核苷酸固定在膜上，然后与带有标记物的 PCR 产物杂交。由于Ⅰ类抗原的等位基因比Ⅱ类的复杂，故所需 SSO 探针量庞大，而且各等位基因之间存在序列共享现象，因此该方法目前主要用于Ⅱ类抗原的检测。三．PCR-序列测定法 HLA-Ⅰ类和Ⅱ类基因的 DNA 序列已经明确，根据已知序列合成同义引物（sense）及反义引物（antisense），扩增单链 DNA 片段直接进行单链序列测试。将 4 种荧光标记的双脱氧核糖核苷酸与膜板 DNA 末端碱基在 PCR 循环过程中结合后，再用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳，用自动测序仪

温州医学院 文本 人类白细胞抗原分型_临床免疫学检验第二十七章

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