第二十四章免疫细数检测技术(Sepr8 te and&888yo11asm1yce11) 第一节免疫细鞋的分离与纯化 Separate and purification of imunity cell) 一、细胞的分离 二，外周血单个核细融的分离 三、淋巴细围的纯化与亚群分离 四、存弹细胞的分离 第二节淋巴细鞋的数量检测(Assa厚of the1 mphocyte阳ant1ty) 一，T细胞数量检测 二、B细胞数量检测 第三节淋巴饵胞的功旋检测 (Assay of lymphocyte funetion 一、T细胞功伦检测 二，B细胞功能检测 三，NK细围活性测定 第四节吞噬细鞋功能检测(assay the macroeyt0 function） 二，巨赠细围功能检测 第二十二章 免夜细盥的分离与检测 Separate and assay of inmmity cell) 学习要点 ·不同类型免疫组胞分离的原理 ·淋巴细胞的说化与亚群分离 ·常用T、B细胞功能检测的方法和原理 免变细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，主要包括排巴细胞、单核一理 细围、树突状细胞、各种粒细脑、红细胞和肥大细鞋等。积据各类免疫细围验特的表面标志 及其特妹功能，用体外或体内方法将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来，对 其进行数量和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段，也是细胞生物学、免疫学中 进行细胞分离、培养和建立细围株等研究的重要基本技术之一：
第二十四章 免疫细胞检测技术（ Separate and assay of immunity cell） 第一节 免疫细胞的分离与纯化 （ Separate and purification of immunity cell） 一、细胞的分离 二、外周血单个核细胞的分离 三、淋巴细胞的纯化与亚群分离 四、 吞噬细胞的分离 第二节 淋巴细胞的数量检测（ Assay of the lymphocyte quantity） 一、T 细胞数量检测 二、B 细胞数量检测 第三节 淋巴细胞的功能检测 （Assay of lymphocyte function） 一、T 细胞功能检测 二、B 细胞功能检测 三、NK 细胞活性测定 第四节 吞噬细胞功能检测（assay the macrocyte function ） 二、巨噬细胞功能检测 第二十二章 免疫细胞的分离与检测 （ Separate and assay of immunity cell） 学习要点 ·不同类型免疫细胞分离的原理 ·淋巴细胞的纯化与亚群分离 ·常用 T、B 细胞功能检测的方法和原理 免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，主要包括淋巴细胞、单核-巨噬 细胞、树突状细胞、各种粒细胞、红细胞和肥大细胞等。根据各类免疫细胞独特的表面标志 及其特殊功能，用体外或体内方法将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来，对 其进行数量和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段,也是细胞生物学、免疫学中 进行细胞分离、培养和建立细胞株等研究的重要基本技术之一
第五节免度细胞的分离与纯化 Separate and purification of immunity cell) 由于检测的目的和方法不月，分离细胞的需求和技术也异。分离细胞选用的方法应 力求简便可行，收获细胞后应尽量保持其话力（性》，，保证较高的纯度和较高的获取率以用 于实验研究。分离细胞的原则一是根据各类细胞的大小，沉降率、粘附和吞檬能力加以相分， 另外则按照各类细胞的表面标志（表面抗原和受体）加以选择性分离， 免疫细型的分离方法根多，临床和科研实验中主要是根那细表面标志、理化性状 以及功能等方面的差异而设计的。采用何种方法，应根据实验的目的及所需细数的种类，纯 度及数量等要求来确定， 自细胞的分离 血中红细酸和白细围的比例的为00一1000：1，两类细鞋密度不同。其沉降速度各异， 通常用以下两种方法分离。 1,自然沉降法是利用血饵胞自然沉降率的分离方法。采集外周静脉血，肝素抗凝， 将含抗凝血的试管直立静置室温3刘-0阳后，由于红纸散沉降迪率较快。可使白细胞与之 分离。上层为该黄色血浆，成层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰自层为自细胞。吸取富含 白饵胞的饵胞群，离心洗涤后加入少量蒸愧水或含氧化镀的Gy溶液，经短时间的低渗处理， 使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞是液。 2.聚合物加速沉降法某些高分子聚合物如明胶、右旋糖府、甲基奸排素和聚乙烯赋 路烷解P)等可使红细胞凝集成串，如速红细胞沉摩，使之更号与白细胞分离。此法白细 胞获得率比自然沉降法高，但其中的明胶法可使白细鞋粘性增加。对实验产生一定影响。 二、外周血单个核细胞的分离 外周直单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,C)主要指淋巴细粒和单 核细胞。是免技学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。 C的密度与血液中的其他成分不同.血小板的密度为1.030一1.035，粒细围为1.092， 红细整为1.93，而淋巴细胞和单核细慰的密度为1.075一1.90。因此。利用一种密度介于 1.075一1.092之间、近于等渗的溶液（分层液）进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞 按其相应密度分布，从面被分离。常用的分层液有聚花糖泛影笔酸分层液法和Pcol1分 层液法两种。 (一聚，一泛飞笔肢分层液法
第五节 免疫细胞的分离与纯化 （ Separate and purification of immunity cell） 由于检测的目的和方法不同，分离细胞的需求和技术也异。分离细胞选用的方法应 力求简便可行，收获细胞后应尽量保持其活力（性），、保证较高的纯度和较高的获取率以用 于实验研究。分离细胞的原则一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以粗分， 另外则按照各类细胞的表面标志（表面抗原和受体）加以选择性分离。 免疫细胞的分离方法很多，临床和科研实验中主要是根据细胞表面标志、理化性状 以及功能等方面的差异而设计的。采用何种方法，应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯 度及数量等要求来确定。 一、 白细胞的分离 血中红细胞和白细胞的比例约为 600～1000:1，两类细胞密度不同，其沉降速度各异， 通常用以下两种方法分离。 1．自然沉降法 是利用血细胞自然沉降率的分离方法。采集外周静脉血，肝素抗凝， 将含抗凝血的试管直立静置室温 30～60min 后，由于红细胞沉降速率较快，可使白细胞与之 分离。上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞。吸取富含 白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的 Gey 溶液，经短时间的低渗处理， 使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 2．聚合物加速沉降法 某些高分子聚合物如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡 咯烷酮(PVP)等可使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。此法白细 胞获得率比自然沉降法高，但其中的明胶法可使白细胞粘性增加，对实验产生一定影响。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要指淋巴细胞和单 核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行 T 细胞和 B 细胞分离纯化的重要环节。 PBMC 的密度与血液中的其他成分不同。血小板的密度为 1.030～1.035，粒细胞为 1.092， 红细胞为 1.093，而淋巴细胞和单核细胞的密度为 1.075～1.090。因此，利用一种密度介于 1.075～1.092 之间、近于等渗的溶液(分层液)进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞 按其相应密度分布，从而被分离。常用的分层液有聚蔗糖-泛影葡胺分层液法和 Percoll 分 层液法两种。 (一)聚蔗糖-泛影葡胺分层液法
聚莲糖-泛影葡胶(f1Col1-hypaque,F-D分层液法是分离C一种单次密度梯度离心 分离法。聚在糖(f1©O11)分子量为40kD,具有高密度、低渗透压和无毒性的特点。常用的 聚整糖溶液浓度为6篇，密度为1.020。在聚证糖溶液中加入适量密度为】，200、浓度为34绕 的泛影葡胺0yau©》，以增加密度，即可配制成密度合适的聚藿糖-泛影密陵分层液。分离 人外圆血淋巴细型以密度为1，？7土0.001的分层液为最佳。不问动物血中的单个核饵胞对 分离液的密度要求各不相月，如小鼠为1.088，马为1,090： 分离细胞时，将肝素抗凝的稀释全血缓役叠如在等量的分层液上，使两者形成一个清晰 的界面。水平离心后。形成不同层次的液体和细胞区蒂，从而分离出阳C(图22-》。红细 園和粒细型密度大于分层液，同时因红细融酒聚莲糖-泛影葡胺分层液而凝集成串钱状，沉 积于分层液底部：血小板因密度小而悬浮于血案中：阳C的密度在1.076一1.090之间，稍 低于分层液，故位于血浆层和分层液的界而中，呈白膜状，吸出单个核细胞，计数，用台盼 蓝染色检查细胞活力。 本法是目前临床和科研实验中最常用的方法，其分离的纯度可达5%，细胞获取率可达 8%以上，但与室祖有关，当室温超过25℃时可影响细胞的获取率。另外在获取细胞后的试 验操作应尽量在低温(4一℃，成置冰块中)的条件下进行。 图22-1Fic0l山分层液分离单个核细胞示意图 (二)Percoll分层液法 Percol1是经过聚乙烯t略烷酮(polyvinyl pyrolidone,mP)处理的硅较顾粒混悬液， 对细散无毒性和刺瀣性。Per心ol山混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一 个违续密度梯度，将密度不同的细胞分离纯化， 将Peeo11原液（密度为1.135）与的等量双离子强度的晴酸盐缓冲液均匀混合，经高速 离心后形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，将已制备的单个核细胞悬液轻 轻叠加在该液面上，低速离心后，便得四个细鞋层，从而分离出淋巴细围（图2公-）。表层 为死细胞残片和血小板，底层为较细胞和虹细胞，中间有两层，上层富含单核细胞，下层富 含淋巴细胞。该法是分离淋巴细胞和单核细胞的一种较好的方法，淋巴细胞纯度高达9%， 单核细胞纯度可达群，但操作流程较长。步骤较烦项。试剂耗费亦较大， 图22-2 Percol小分云液分离单个核细围示意图 三、淋巴细胞的纯化与亚群分离 悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核饵胞及少量粒饵胞，红细 胞和血小板。为获得高纯度的淋巴细围成其亚群，可采用如下分离去除方法
聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque,F-H)分层液法是分离 PBMC 一种单次密度梯度离心 分离法。聚蔗糖(ficoll)分子量为 40kD，具有高密度、低渗透压和无毒性的特点。常用的 聚蔗糖溶液浓度为 6%，密度为 1.020。在聚蔗糖溶液中加入适量密度为 1.200、浓度为 34% 的泛影葡胺(hypaque)，以增加密度，即可配制成密度合适的聚蔗糖-泛影葡胺分层液。分离 人外周血淋巴细胞以密度为 1.077±0.001 的分层液为最佳。不同动物血中的单个核细胞对 分离液的密度要求各不相同，如小鼠为 1.088，马为 1.090。 分离细胞时，将肝素抗凝的稀释全血缓慢叠加在等量的分层液上，使两者形成一个清晰 的界面。水平离心后，形成不同层次的液体和细胞区带，从而分离出 PBMC(图 22-1)。红细 胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇聚蔗糖-泛影葡胺分层液而凝集成串钱状，沉 积于分层液底部；血小板因密度小而悬浮于血浆中；PBMC 的密度在 1.076～1.090 之间，稍 低于分层液，故位于血浆层和分层液的界面中，呈白膜状。吸出单个核细胞，计数，用台盼 蓝染色检查细胞活力。 本法是目前临床和科研实验中最常用的方法，其分离的纯度可达 95%，细胞获取率可达 80%以上，但与室温有关，当室温超过 25℃时可影响细胞的获取率。另外在获取细胞后的试 验操作应尽量在低温（4-8 o C，或置冰块中）的条件下进行。 图 22-1 Ficoll 分层液分离单个核细胞示意图 (二)Percoll 分层液法 Percoll 是经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒混悬液， 对细胞无毒性和刺激性。Percoll 混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一 个连续密度梯度，将密度不同的细胞分离纯化。 将 Percoll 原液(密度为 1.135)与约等量双离子强度的磷酸盐缓冲液均匀混合，经高速 离心后形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度。将已制备的单个核细胞悬液轻 轻叠加在该液面上，低速离心后，便得四个细胞层，从而分离出淋巴细胞(图 22-2)。表层 为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单核细胞，下层富 含淋巴细胞。该法是分离淋巴细胞和单核细胞的一种较好的方法，淋巴细胞纯度高达 98%， 单核细胞纯度可达 78%。但操作流程较长，步骤较烦琐，试剂耗费亦较大。 图 22-2 Percoll 分层液分离单个核细胞示意图 三、淋巴细胞的纯化与亚群分离 PBMC 悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细 胞和血小板。为获得高纯度的淋巴细胞或其亚群，可采用如下分离去除方法
(一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸偏水低渗裂解法或Q83%氯化铵处理法， (二)血小版的去除 将C悬液通过离心洗涤2一3次，常可去除C中绝大部分混条的血小板。在某些 疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用怡牛血清CS)棉度离心法去除C 中混套的血小板。 (三)单核细围和粒细数的去除 1.粘附去除法单核细胞和粒细胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖晟胶的特性，通过阳C 与玻璃或望料平亚的粘用作用，暴集的书粘用细型即为甚巴细胞。亦可应用玻璃纤米或菌聚 糖凝胶Sephadex心-10柱，清除粘附的细围，洗脱液中主要是淋巴细数。此法简便易行，对 细胞极伤极少，缺点是B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。该法去除单核 细胞后。大约96%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%， 2,我基铁松吞噬法单核细敢具有吞草现基铁粉的能力，吞常聚基铁粉后的单枝细围 密度增大，再经聚成糖泛影葡胶分层液密度棉度离心后，则单核细胞沉积于管底面被去除 也可在单核细胞悬液内加入腹基铁粉颗粒，特单核饵胞充分香壁瑕基铁粉后，用磁铁将细胞 吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细数。 3,苯丙氨酸甲盾去除法茶丙氢酸甲雷（具有亲溶酶体性质，能渗入细鞋溶酶体内 技水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破及，释放出的酶类物质可引起细散溶 解。用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细围、粒细胞和成纤维碍细围等，B细围和大多 数T细胞因缺乏溶酶体南。因而不受影响。该法去障单核细胞后，的外的单个核细胞为淋 巴细敷。话性大于9 (四)淋巴细胞亚群的分离 淋巴细胞是复柔的不均一的饵胞群体，它包括了许多形态相制而表面标志和功能各异的 细胞群和亚群。根据细胞的表面标志和功能等不同，借助多种方法分离淋巴细胞亚群。 1.E花环分离法 成熟的T细胞表南表达锦单红细胞(SC)受体，即E受体。T细园能与SC结合形成E 花环，而B细敷则不橙。经聚莲糖一泛影葡胺分层液密度梯度离心，E花环形成细胞因密度 增大面沉积子管底，再用低渗法裂解花环中的5，即可获得纯化的T细胞，悬浮在分层 液界面的细胞群富含B细胞
(一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或 0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将 PBMC 悬液通过离心洗涤 2～3 次，常可去除 PBMC 中绝大部分混杂的血小板。在某些 疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除 PBMC 中混杂的血小板 。 (三)单核细胞和粒细胞的去除 1．粘附去除法 单核细胞和粒细胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶的特性，通过 PBMC 与玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。亦可应用玻璃纤维或葡聚 糖凝胶 Sephadex G-10 柱，清除粘附的细胞，洗脱液中主要是淋巴细胞。此法简便易行，对 细胞损伤极少，缺点是 B 细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分 B 细胞丢失。该法去除单核 细胞后，大约 95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于 95%。 2．羰基铁粉吞噬法 单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞 密度增大，再经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。 也可在单核细胞悬液内加入羰基铁粉颗粒，待单核细胞充分吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞 吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3．苯丙氨酸甲酯去除法 苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内 被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶 解。用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B 细胞和大多 数 T 细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。该法去除单核细胞后，约 99%的单个核细胞为淋 巴细胞，活性大于 95%。 (四)淋巴细胞亚群的分离 淋巴细胞是复杂的不均一的细胞群体，它包括了许多形态相似而表面标志和功能各异的 细胞群和亚群。根据细胞的表面标志和功能等不同，借助多种方法分离淋巴细胞亚群。 1．E 花环分离法 成熟的 T 细胞表面表达绵羊红细胞(SRBC)受体，即 E 受体。T 细胞能与 SRBC 结合形成 E 花环，而 B 细胞则不能。经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心，E 花环形成细胞因密度 增大而沉积于管底，再用低渗法裂解花环中的 SRBC，即可获得纯化的 T 细胞，悬浮在分层 液界面的细胞群富含 B 细胞
该方法简便易行，所获细胞的纯度可达5一99%，可问时获得B细胞。缺点是E花环 形成后可能使T细围话化。用2-氢乙基异陵服溴化物(2-anino ethyl-isothiouronium bronide,AET)或神经氨酸酶neuraninidase,.N0处理SC后，可增如花环形成效果与稳定 性，从而提高T细胞的分离效率。 2,尼龙棉柱分离法 将淋巴细胞悬液如入尼龙棉柱内，B细胞易粘阳于尼龙棉纤维（聚酰陵纤推）表面，而T 细型则不易粘附，由此可将T细幽与B细胞分离，该法简便易行，不需特殊仪器，淋巴细胞 活性不受影响。所联T细園纯度可达90膺以上，B细傲纯度可达8膺。缺点是尼龙格可能选 择性潜留某些T细围亚群，尼龙棉粘阳的细胞⑧细胞和巨赠细胞)的回收率低，且可能混桑 有未流尽的T细胞和死亡饵胞： 3,亲和版结合分离法分为直接法和间接法： 直接法是用特异性抗体包被塑料平Ⅲ或细胞培养板，表达特定粮抗冢的细胞即与相应抗 体结合而被吸附于平皿或培养板表面，悬液中为不表达特定膜抗原的细围（见图223），例 如，用兔抗人Ig抗体包被平皿，再将淋巴细胞是液置于平国中温有。测B细融吸附在平组 上，而其他细胞则不能吸附，由此可分离出B细胞。T细胞及其亚群具有3、CD4、CD8抗 原，用相应的特异性抗体，通过直接法也可分离出T细园及其亚群。 见图22-3亲和分离法示意图 同接法是川羊（或兔）抗鼠【G抗体（第二抗体）包被平皿，将预先与特异性单克隆抗体结 合的淋巴细胞与之反应后，可发生吸阳国定，从而被分离。例如，将T细胞与针对某种丁 细图亚群分化抗原的特异性眼抗人单克座抗体一起温育，再置入预先包被有羊抗鼠1g的平 皿中。此时，结合有碱抗人特异性抗体的T饵胞亚群将吸用在平皿中，而其他T细胞期不核 吸附，由此即可将某一T细围亚群从T细围群体中分离出来：成熟B细围表面有鞋特的G19 和C必0抗原，用相应的特异性抗体，通过间接法也可分离出高纯度的B细胞。上述方法中 被吸附的细数可被洗酸，或从平Ⅲ表面科下。 该方法的优点是可同时法行细胞的阳性分选和阴性分达，且所铁细围量较大。缺点是将 吸附国定于柔和板上的细数速行机械性分离或璃酶处理，可能枫伤细散膜，导致胞活性降 低。细胞受体与特异性抗原结合，可引起细胞漱活。采用间接法所获洗脱细胞。其表面带有 抗原-抗体复合物，可能对细胞功修产生一定影响。因此。亲和板结合分离法一般适合进行 阴性分选。 4。免疫磁珠分离法包括直接法和间接法
该方法简便易行，所获细胞的纯度可达 95%～99%，可同时获得 B 细胞。缺点是 E 花环 形成后可能使 T 细胞活化。用 2-氨乙基异硫脲溴化物(2-amino ethyl-isothiouronium bromide,AET)或神经氨酸酶(neuraminidase,NM)处理 SRBC 后，可增加花环形成效果与稳定 性，从而提高 T 细胞的分离效率。 2．尼龙棉柱分离法 将淋巴细胞悬液加入尼龙棉柱内，B 细胞易粘附于尼龙棉纤维(聚酰胺纤维)表面，而 T 细胞则不易粘附，由此可将 T 细胞与 B 细胞分离。该法简便易行，不需特殊仪器，淋巴细胞 活性不受影响，所获 T 细胞纯度可达 90%以上，B 细胞纯度可达 80%。缺点是尼龙棉可能选 择性滞留某些 T 细胞亚群，尼龙棉粘附的细胞(B 细胞和巨噬细胞)的回收率低，且可能混杂 有未洗尽的 T 细胞和死亡细胞。 3．亲和板结合分离法 分为直接法和间接法： 直接法是用特异性抗体包被塑料平皿或细胞培养板，表达特定膜抗原的细胞即与相应抗 体结合而被吸附于平皿或培养板表面，悬液中为不表达特定膜抗原的细胞(见图 22-3)。例 如，用兔抗人 Ig 抗体包被平皿，再将淋巴细胞悬液置于平皿中温育，则 B 细胞吸附在平皿 上，而其他细胞则不能吸附，由此可分离出 B 细胞。T 细胞及其亚群具有 CD3、CD4、CD8 抗 原，用相应的特异性抗体，通过直接法也可分离出 T 细胞及其亚群。 见图 22-3 亲和分离法示意图 间接法是用羊(或兔)抗鼠 IgG 抗体(第二抗体)包被平皿，将预先与特异性单克隆抗体结 合的淋巴细胞与之反应后，可发生吸附固定，从而被分离。例如，将 T 细胞与针对某种 T 细胞亚群分化抗原的特异性鼠抗人单克隆抗体一起温育，再置入预先包被有羊抗鼠 Ig 的平 皿中。此时，结合有鼠抗人特异性抗体的 T 细胞亚群将吸附在平皿中，而其他 T 细胞则不被 吸附，由此即可将某一 T 细胞亚群从 T 细胞群体中分离出来；成熟 B 细胞表面有独特的 CD19 和 CD20 抗原，用相应的特异性抗体，通过间接法也可分离出高纯度的 B 细胞。上述方法中 被吸附的细胞可被洗脱，或从平皿表面刮下。 该方法的优点是可同时进行细胞的阳性分选和阴性分选，且所获细胞量较大。缺点是将 吸附固定于亲和板上的细胞进行机械性分离或胰酶处理，可能损伤细胞膜，导致细胞活性降 低。细胞受体与特异性抗原结合，可引起细胞激活。采用间接法所获洗脱细胞，其表面带有 抗原-抗体复合物，可能对细胞功能产生一定影响。因此，亲和板结合分离法一般适合进行 阴性分选。 4．免疫磁珠分离法 包括直接法和间接法
直接法是将转异性抗体与磁性微粒《平均直径小于1,5μ■)交联，形成免疫延珠 (gnetic beads,I)。I相与表达相应膜抗草的饵幽结合，用强醚场分离磁珠结合 细围与磁珠幸结合细胞，从而对特定细胞选行阳性或明性分选。 同接法是用羊（成兔）抗眼【G抗体（第二抗体）包鼓磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单 克隆抗体（第一抗体）的闻胞发生反应，从而对细胞进行分离。例如，将羊（域兔）抗鼠Ig抗 体（第二抗体）包按磁性微珠，形成B。将T细围与针对某种需去释的T细粒亚群表面抗原 的特异性单克隆抗体温育，再与旧温育，则需去除的T细胞亚群与呢结合，在外加磁场 的作川下，婚连同站合的饵胞一起快速高效地沉降而棱去除，留下的悬浮细胞即为所需的 T细胞亚群。 该方法的优点是可同时进行细胞的阳性分透和阴性分透，所获细围的纯度可达9济一 99%,获率高达90%，活饵胞率大于95%，其分离效果可与流式细胞术蛇美，但比后者省时且 费用低。操作简便、快速。无需特殊设备。缺点是阳性分选中抗体可导致细围活化咸细胞调 亡。 5.流式细胞术分离法 用流式细融仪可自动化地对单个细鞋选行多参数定量测定分析，从而可分选出用特异性 荧光抗体标记的阳性细胞。其优点是分离细围准确、快地，纯度达90%一100两，回收率高， 所分离的细数可保持无菌，细胞结构和生物学话性不受影响。缺点是费用昂贵，数分离的细 胞在混合群体中含量过低时，耗时较长才能获得所需数量细胞。 四、吞嫩细胞的分离 体内具有吞噬功能的细胞群按其形态的大小分为两类：一类为大吞噬细胞，即血液中的 单核细胞和组织中的巨常细胞：另一类为小吞增细胞，即中性粒细胞。这两类细胞在形态上 各具特狂，其分类和计数对诊断大多数感染性疾璃具有盈要参考价值。 1,单核细围的分离 川Pε0]1分层液法或粘图去障法可获取人外周直单核细型，但所获得的图型数量教少 (详见本章第二节)。 2,巨赠细胞的分离 用氏蟊数贴法可从人体组织渗出液中获取巨噬细胞。用斑熏乙醇浸液制激前臂内侧皮 肤，诱发无菌性皮炎，从皮泡漆出液中可获取来自皮下组织中的巨噬细胞。该法获取的巨壁 细型数量较多且纯度较高，但对皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染。应慎用
直接法是将特异性抗体与磁性微粒(平均直径小于 1.5μm)交联，形成免疫磁珠 (immunomagnetic beads,IMB)。IMB 与表达相应膜抗原的细胞结合，用强磁场分离磁珠结合 细胞与磁珠非结合细胞，从而对特定细胞进行阳性或阴性分选。 间接法是用羊(或兔)抗鼠 IgG 抗体(第二抗体)包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单 克隆抗体(第一抗体)的细胞发生反应，从而对细胞进行分离。例如，将羊(或兔)抗鼠 Ig 抗 体(第二抗体)包被磁性微珠，形成 IMB。将 T 细胞与针对某种需去除的 T 细胞亚群表面抗原 的特异性单克隆抗体温育，再与 IMB 温育，则需去除的 T 细胞亚群与 IMB 结合，在外加磁场 的作用下，IMB 连同结合的细胞一起快速高效地沉降而被去除，留下的悬浮细胞即为所需的 T 细胞亚群。 该方法的优点是可同时进行细胞的阳性分选和阴性分选，所获细胞的纯度可达 93%～ 99%，获率高达 90%，活细胞率大于 95%，其分离效果可与流式细胞术媲美，但比后者省时且 费用低，操作简便、快速，无需特殊设备。缺点是阳性分选中抗体可导致细胞活化或细胞凋 亡。 5．流式细胞术分离法 用流式细胞仪可自动化地对单个细胞进行多参数定量测定分析，从而可分选出用特异性 荧光抗体标记的阳性细胞。其优点是分离细胞准确、快速，纯度达 90%～100%，回收率高， 所分离的细胞可保持无菌，细胞结构和生物学活性不受影响。缺点是费用昂贵，拟分离的细 胞在混合群体中含量过低时，耗时较长才能获得所需数量细胞。 四、 吞噬细胞的分离 体内具有吞噬功能的细胞群按其形态的大小分为两类：一类为大吞噬细胞，即血液中的 单核细胞和组织中的巨噬细胞；另一类为小吞噬细胞，即中性粒细胞。这两类细胞在形态上 各具特征，其分类和计数对诊断大多数感染性疾病具有重要参考价值。 1．单核细胞的分离 用 Percoll 分层液法或粘附去除法可获取人外周血单核细胞，但所获得的细胞数量较少 (详见本章第二节)。 2．巨噬细胞的分离 用斑蟊敷贴法可从人体组织渗出液中获取巨噬细胞。用斑蟊乙醇浸液刺激前臂内侧皮 肤，诱发无菌性皮炎，从皮泡渗出液中可获取来自皮下组织中的巨噬细胞。该法获取的巨噬 细胞数量较多且纯度较高，但对皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染，应慎用
用腹腔渗出法可从动物（小鼠，大鼠、服服和家兔等）腹腔渗出液中分离巨噬细胞。用无 菌液体石蜻或淀粉等刻激剂注入小鼠腹整，引起无菌性炎性渗出，从腹粒渗出液中可获取大 量巨啦细鞋，所得细胞是液中？0叭一0%为巨常细胞。 第大节淋巴细胞的数量检测 Assay of the lympbocyte quantity) 不同的淋巴饵雅表面具有特定的表面标志，出此可以对不同的淋巴细幽及其亚群进行整 定和计数。 一、T细胞数量检测 (一)间接荧光免夜法 同接荧完免疫法是通过检测T细照表面的①抗原来了解外周血T细围数量和亚那的变 化：方法是：分离阳WC,分别与服抗人CD3、C①4和CB的单克隆抗体进行结合，再用荧光 素标记的羊（或兔）抗鼠【G作为第二抗体，借助单克隆抗体的介导与PC结合，在荧光是 微镜下观黎察结果，细陬膜上星现特异性荧光的雏胞即为阳性细胞。计数100一200个淋巴细 胞，根据阳性细胞确定丁细胞及其亚群的百分率。外周血T细胞及其更群的平均正常值为 3+T细胞60%-80%，M+T饵型551-60%。g+T细胞20%-30%，CDM+T细胞与C8+T饵 取的比值约为2：1。如有条件，细融经荧光抗体着染后，可用流式细園仪白动计数。快速而 准确。 二)南免度组织化学法 使用酶标记抗体与组织切片或细型涂片反应，通过衡对相应底物的罹化显色米检测细胞 的特异性表面标志，从而鉴定细胞种类或其亚群。该方法具有敏感性高，标本可长期保存， 使用一般光学显微镜就能观察结果，一般实验蜜均可开展等优点，但有时也存在非特异性染 色影响。目前常用于鉴定T细胞和亚群的南免发组凯化学法有AB配法和P即法， I.AC法将者合素与衡标生物素反应形成复合物(avidin-biotin-peroxidase copl©x,C),再与生物素化的第二抗体反应，借助T细胞的CD单克隆抗体介导和箭催化 底物的作用，可使T细胞着色。通过计数着色的阳性细胞数，可以确定T细胞及其亚群的百 分率。 2,PAP法分离C,分别与鼠抗人C3、D4,和8的单克隆抗体反应。用免抗鼠 1G起搭桥作用，其中一个F动段违接抗T细胞单克降抗体，另一个下b段连接碱性情酸倒 -抗碱性磷酸蒋(alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase,PA4P)复合物，再通 过复合物中的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,P)催化底物显色来判断C①抗原的存在
用腹腔渗出法可从动物(小鼠、大鼠、豚鼠和家兔等)腹腔渗出液中分离巨噬细胞。用无 菌液体石蜡或淀粉等刺激剂注入小鼠腹腔，引起无菌性炎性渗出，从腹腔渗出液中可获取大 量巨噬细胞，所得细胞悬液中 70%～80%为巨噬细胞。 第六节 淋巴细胞的数量检测 （ Assay of the lymphocyte quantity） 不同的淋巴细胞表面具有特定的表面标志，借此可以对不同的淋巴细胞及其亚群进行鉴 定和计数。 一、T 细胞数量检测 (一)间接荧光免疫法 间接荧光免疫法是通过检测 T 细胞表面的 CD 抗原来了解外周血 T 细胞数量和亚群的变 化。方法是：分离 PBMC,分别与鼠抗人 CD3、CD4 和 CD8 的单克隆抗体进行结合，再用荧光 素标记的羊(或兔)抗鼠 IgG 作为第二抗体，借助单克隆抗体的介导与 PBMC 结合，在荧光显 微镜下观察结果，细胞膜上呈现特异性荧光的细胞即为阳性细胞。计数 100～200 个淋巴细 胞，根据阳性细胞确定 T 细胞及其亚群的百分率。外周血 T 细胞及其亚群的平均正常值为 CD3+T 细胞 60%～80%，CD4+T 细胞 55%～60%，CD8+T 细胞 20%～30%，CD4+T 细胞与 CD8+T 细 胞的比值约为 2:1。如有条件，细胞经荧光抗体着染后，可用流式细胞仪自动计数，快速而 准确。 (二)酶免疫组织化学法 使用酶标记抗体与组织切片或细胞涂片反应，通过酶对相应底物的催化显色来检测细胞 的特异性表面标志，从而鉴定细胞种类或其亚群。该方法具有敏感性高，标本可长期保存， 使用一般光学显微镜就能观察结果，一般实验室均可开展等优点，但有时也存在非特异性染 色影响。目前常用于鉴定 T 细胞和亚群的酶免疫组织化学法有 ABC 法和 APAAP 法。 1.ABC 法将亲合素与酶标生物素反应形成复合物 (avidin-biotin-peroxidase complex,ABC)，再与生物素化的第二抗体反应，借助 T 细胞的 CD 单克隆抗体介导和酶催化 底物的作用，可使 T 细胞着色。通过计数着色的阳性细胞数，可以确定 T 细胞及其亚群的百 分率。 2．APAAP 法分离 PBMC,分别与鼠抗人 CD3、CD4、和 CD8 的单克隆抗体反应，用兔抗鼠 IgG 起搭桥作用，其中一个 Fab 段连接抗 T 细胞单克隆抗体，另一个 Fab 段连接碱性磷酸酶 -抗碱性磷酸酶(alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase,APAAP)复合物，再通 过复合物中的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ,AP)催化底物显色来判断 CD 抗原的存在
从而确定T细胞及其亚群的百分率。该方法由于使用免疫桥联技术，故其敏感性高，结果易 于判断。同时又减少了内源性酶的影响，特异性强。 (三)微量细胞毒试险 针对淋巴细胞CD分子的单克隆抗体与淋巴细胞相应的①分子结合，售助补体依赖的细 胞毒作用，可造成表达特定表面抗原的细胞损伤，破环顾的完整性，应用伊红染料渗入细胞 内，使之着染红色，面无相应D分子的细胞则不受极伤，因面不着色。在高倍镜下计数死 亡数，即可判斯特检细胞是香具有相应的①分子，从而确定T细图及其亚群，该方法简便 易行，准确性较高。 (四)花环技术 1,E花环试验 T细鞋表面有特异性绵羊红细園(S)受体，即E受体。将T细围与SC按一定比 例混匀，置4℃至少h或过夜，T细胞表面的E受体陵与SRC结合形成以T细胞为中心， 四周环绕SC的花环样结构（见图22-4），镜检计数可得总花环便t)形成率，亦脚T细胞 的百分率。如藏少淋巴细数与SC的比例，两者混合后，经短时间后即行涂片染色，仍可 见都分淋巴细胞形成花环，称为话性E(E)花环，它可使代表T细胞的一个亚群，E花环正 常值仅为Et花环的/3一1/2，约20m~40%。检测Ea花环形成细胞此Et花环形成细胞更能 反映受检者的细胞免疫水平.E花环试验(erythrocyte rosette test)是经典的细胞免疫功 能测定方法，因操作简便号行，曾被广泛使用，但影响因素多，重复性和稳定性差，不同实 险室所的数值相差较大，现逐新被CD抗原检测所代替，但考虑到方法简便，又不需要特殊 仪器，放还有一定的实用价值。 图224E花环试验结果示意图 2,葡面球菌花环法 葡萄球蛋自ASP)可与多种动物的IsGF段结合而不影响抗体的活性。应用金黄色 葡萄球菌结合单克隆抗体（直接法）或兔抗鼠【gG抗体（间接法》，所形成的SFA-1G复合物可 与表达相应膜抗原的细融结合，使金黄色葡葡球南核动吸用在细围圆围形成花环状，通过计 数花环彩成细胞百分率，从面确定T淋巴细散及其亚罪的数量： 3.抗体数敏细胞花环法 采用戊二醛交联技术将单克隆抗体成兔抗佩1G与SC结合，制成致敏的SC。抗体 致最的5可与T淋巴细胞直接或间接结合，在T淋巴细胞圆围形成花环。通过计数花环
从而确定 T 细胞及其亚群的百分率。该方法由于使用免疫桥联技术，故其敏感性高，结果易 于判断，同时又减少了内源性酶的影响，特异性强。 (三)微量细胞毒试验 针对淋巴细胞 CD 分子的单克隆抗体与淋巴细胞相应的 CD 分子结合，借助补体依赖的细 胞毒作用，可造成表达特定表面抗原的细胞损伤，破坏膜的完整性，应用伊红染料渗入细胞 内，使之着染红色，而无相应 CD 分子的细胞则不受损伤，因而不着色。在高倍镜下计数死 亡数，即可判断待检细胞是否具有相应的 CD 分子，从而确定 T 细胞及其亚群。该方法简便 易行，准确性较高。 (四)花环技术 1．E 花环试验 T 细胞表面有特异性绵羊红细胞 (SRBC) 受体，即 E 受体。将 T 细胞与 SRBC 按一定比 例混匀，置 4℃至少 2h 或过夜，T 细胞表面的 E 受体能与 SRBC 结合形成以 T 细胞为中心， 四周环绕 SRBC 的花环样结构（见图 22-4 ），镜检计数可得总花环(Et)形成率，亦即 T 细胞 的百分率。如减少淋巴细胞与 SRBC 的比例，两者混合后，经短时间后即行涂片染色，仍可 见部分淋巴细胞形成花环，称为活性 E(Ea)花环，它可能代表 T 细胞的一个亚群，Ea 花环正 常值仅为 Et 花环的 1/3～1/2，约 20%～40%。检测 Ea 花环形成细胞比 Et 花环形成细胞更能 反映受检者的细胞免疫水平。E 花环试验(erythrocyte rosette test)是经典的细胞免疫功 能测定方法，因操作简便易行，曾被广泛使用，但影响因素多，重复性和稳定性差，不同实 验室所的数值相差较大，现逐渐被 CD 抗原检测所代替，但考虑到方法简便，又不需要特殊 仪器，故还有一定的实用价值。 图 22-4 E 花环试验结果示意图 2．葡萄球菌花环法 葡萄球菌蛋白 A(SPA)可与多种动物的 IgGFc 段结合而不影响抗体的活性。应用金黄色 葡萄球菌结合单克隆抗体(直接法)或兔抗鼠 IgG 抗体(间接法)，所形成的 SPA-IgG 复合物可 与表达相应膜抗原的细胞结合，使金黄色葡萄球菌被动吸附在细胞周围形成花环状。通过计 数花环形成细胞百分率，从而确定 T 淋巴细胞及其亚群的数量。 3．抗体致敏细胞花环法 采用戊二醛交联技术将单克隆抗体或兔抗鼠 IgG 与 SRBC 结合，制成致敏的 SRBC。抗体 致敏的 SRBC 可与 T 淋巴细胞直接或间接结合，在 T 淋巴细胞周围形成花环。通过计数花环
形成率，从而确定T淋巴细取及其亚群的百分率。本法需有相应的致敏红细胞试剂，受影响 的因素较多。 二、B细购数量检测 B细髓表面有膜表面免疫球蛋白(S)、CD抗原，F©受体、补体受体、B病毒受体和 小鼠红细胞受体等标志，据此可对B细胞进行量量检测。 1,Sg的检测Sg为B细胞所特有，是鉴定B细胞的可靠指标，大多采用荧光素域 酶标记的抗人Ig抗体通过直接荧光免夜法或酶免疫组织化学法检测Sg:正常人外圆直中 5mg细胞一般为8%一12. 2.CD抗原检测B细胞表而抗原有CD19,C20、C①21，CT22和CD29等分化抗原，其 中有些是全部B细围所共有，而有些仅活化B细雅所特有，据此可用相应的系列单克隆抗体， 通过同接荧光免疫法或南免疫组织化学法加以检测。正常成年人外周血C20阳性细围的占 淋巴细胞总数的8一12%. 3,F©受体和补体受体的检测B细围表面具有与Ie段结合的受体，极易与抗原抗 体复合物中抗体F段结合，放用相应抗体致傲的红细围E》作指示物，在一定条件下。它 能与带F受体的B细数形成E弘花环，故移EA花环试验。而B细围表面的补体受体，则能 与红细胞(-抗红细胞抗体A)-补体(C们复合物(EC)中的补体相结合，从面建立EC花环试 验。但由单核细散，巨蝶细数，饭细胞以及部分T细胞也带有下或补体受体，加上该类试 验需制备新鲜指示物，操作麻烦，目前已很少应用. 3小鼠红细围受体的检测部分B细围隆与小鼠红细胞彩成花环，慢性B细胞白血病悲 者外周血淋巴细胞形成小鼠红饵胞花环半高达60%一85%，目健康人该花环率仅占总淋巴细 胞的阵一1%，据此推知形成该花环的性能是某些B细败亚群的标志，由于该方法简便，略 床可川于鉴定不问生淋巴细胞白血病： 第三节、淋巴细购的功能检测 assay of lympbocyte function) 一、T细胞功能检测 (一)T细胞增殖试验
形成率，从而确定 T 淋巴细胞及其亚群的百分率。本法需有相应的致敏红细胞试剂，受影响 的因素较多。 二、B 细胞数量检测 B 细胞表面有膜表面免疫球蛋白(SmIg)、CD 抗原、Fc 受体、补体受体、EB 病毒受体和 小鼠红细胞受体等标志，据此可对 B 细胞进行数量检测。 1．SmIg 的检测 SmIg 为 B 细胞所特有，是鉴定 B 细胞的可靠指标。大多采用荧光素或 酶标记的抗人 Ig 抗体通过直接荧光免疫法或酶免疫组织化学法检测 SmIg，正常人外周血中 SmIg+细胞一般为 8%～12%。 2．CD 抗原检测 B 细胞表面抗原有 CD19、CD20、CD21、CD22 和 CD29 等分化抗原，其 中有些是全部 B 细胞所共有，而有些仅活化 B 细胞所特有，据此可用相应的系列单克隆抗体， 通过间接荧光免疫法或酶免疫组织化学法加以检测。正常成年人外周血 CD20 阳性细胞约占 淋巴细胞总数的 8%～12%。 3．Fc 受体和补体受体的检测 B 细胞表面具有与 IgGFc 段结合的受体，极易与抗原抗 体复合物中抗体 Fc 段结合，故用相应抗体致敏的红细胞(EA)作指示物，在一定条件下，它 能与带 Fc 受体的 B 细胞形成 EA 花环，故称 EA 花环试验。而 B 细胞表面的补体受体，则能 与红细胞(E)-抗红细胞抗体(A)-补体(C)复合物(EAC)中的补体相结合，从而建立 EAC 花环试 验。但由单核细胞、巨噬细胞、NK 细胞以及部分 T 细胞也带有 Fc 或补体受体，加上该类试 验需制备新鲜指示物，操作麻烦，目前已很少应用。 3.小鼠红细胞受体的检测 部分 B 细胞能与小鼠红细胞形成花环，慢性 B 细胞白血病患 者外周血淋巴细胞形成小鼠红细胞花环率高达 60%～85%，但健康人该花环率仅占总淋巴细 胞的 5%～10%，据此推知形成该花环的性能是某些 B 细胞亚群的标志。由于该方法简便，临 床可用于鉴定不同型淋巴细胞白血病。 第三节、淋巴细胞的功能检测 （ assay of lymphocyte function） 一、T 细胞功能检测 (一)T 细胞增殖试验
T细胞在体外受到有丝分裂单成抗原的刺激后，细胞的代谢和形态发生变化。主要表现 为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应，如细胞变大、园质增多、胞质现空泡， 核染色质疏松，核仁明斐，并转化为淋巴母细胞（见表22-1）。因此，淋巴细胞增殖反应又 称淋巴细胞得细胞转化(lymphoblast transformtion), 表22-1淋巴细胞转化的形态特西 体外料激T细增殖反应的判激物包括植物直凝素(H),刀豆素A(CA)和美洲商陆 (W、白喉类毒素、依伤风类毒素、纯化蛋白行生物)和白色多珠菌等。 检测T氧胞增殖反应的方法如下： 1,形老孕检查法 分离球，与适量州混合，置37℃培养2出。取培养细酸作涂片染色，错助光学显 微镜进行检测。根据细胞的大小、核与胞质的比例、胞质的染色性以及有无核仁等特狂（见 图22-)，分别计数表转化的谦巴细胞和转化的淋巴细型，每份标本计数200个细胞，按公 式计算淋巴细陬转化率。转化率在一定程度上可反映细胞免疫功能，正常人的T细散转化率 为60m一80%，小于50%可视为降低， 转化率= 转化的淋巴细取数 转化和末转化的淋巴胞最*100% 形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室用。缺点是依 靠肉眼观察形态学变化，判断结果号受主观因素影响，重复性和准确性较差。 22-5淋巴细胞转化示意图 2.T4银找入法 T细散在有发分裂原或抗原制激下，在转化为淋巴母细胞的过程中，A合成明显增加， 且其转化程度与的合成呈正相关。在终止培养前8一16h,若将H标记的陶腺嘧壁核苷 (:T很)加入到培养液中，即被转化的淋巴细脑摄取而携入到新合成的中，培养结束后， 用液体闪烁仪测定淋巴细散内故射性核素量，记录每分钟脉冲数（心》，计算料激指数 (sti园lating index,SI),判断淋巴细胞的转化程度. s1=FH队刺澄管cm均值/对组管ca均值 计T服携入法傲感性高，客观性强，重复性好，可白动操作。但需一定设各条件，受政 射性核素半复期和污染的影响。 3.TT比色法
T 细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞的代谢和形态发生变化，主要表现 为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应，如细胞变大、胞质增多、胞质现空泡、 核染色质疏松、核仁明显，并转化为淋巴母细胞（见表 22-1）。因此，淋巴细胞增殖反应又 称淋巴细胞母细胞转化(lymphoblast transformation)。 表 22-1 淋巴细胞转化的形态特征 体外刺激 T 细胞增殖反应的刺激物包括植物血凝素 (PHA)、刀豆素 A(ConA)和美洲商陆 (PWM)、白喉类毒素、破伤风类毒素、纯化蛋白衍生物(PPD)和白色念珠菌等。 检测 T 细胞增殖反应的方法如下： 1．形态学检查法 分离 PBMC，与适量 PHA 混合，置 37℃培养 72h。取培养细胞作涂片染色，借助光学显 微镜进行检测。根据细胞的大小、核与胞质的比例、胞质的染色性以及有无核仁等特征(见 图 22-5)，分别计数未转化的淋巴细胞和转化的淋巴细胞，每份标本计数 200 个细胞，按公 式计算淋巴细胞转化率。转化率在一定程度上可反映细胞免疫功能，正常人的 T 细胞转化率 为 60%～80%，小于 50%可视为降低。 转化率= 100% 转化和未转化的淋巴细胞数 转化的淋巴细胞数 形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点是依 靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。 图 22-5 淋巴细胞转化示意图 2．3 H-TdR 掺入法 T 细胞在有丝分裂原或抗原刺激下，在转化为淋巴母细胞的过程中，DNA 合成明显增加， 且其转化程度与 DNA 的合成呈正相关。在终止培养前 8～16h，若将 3 H 标记的胸腺嘧啶核苷 ( 3 H-TdR)加入到培养液中，即被转化的淋巴细胞摄取而掺入到新合成的 DNA 中。培养结束后， 用液体闪烁仪测定淋巴细胞内放射性核素量，记录每分钟脉冲数(cpm)，计算刺激指数 (stimulating index，SI)，判断淋巴细胞的转化程度。 SI=PHA 刺激管 cpm 均值/对照管 cpm 均值 3 H-TdR 掺入法敏感性高，客观性强，重复性好，可自动操作。但需一定设备条件，受放 射性核素半衰期和污染的影响。 3．MTT 比色法