第十四章特异性抗体的制备技术 Preparation Technique of Specifie Antibody 第一节免疫原的制备(Iuno这en Preparation) 一，颗粒性免疫原的制备 二、可溶性免疫原制备 三、人工抗原的制备 四、佐剂 第二节免技血清的制备Preparation of Immane Serun 一、选择免疫动物 二，免疫方法 三、动物采血法 四、免疫血清的纯化 五、抗血清的鉴定与保存 第三节单克隆抗体制备技术Preparation of Monoclonal Ant1body) 一、柔交宿技术的基本原理 二、单克隆抗体的批量生产 第四节基因工程抗体技术(Genetic engineering加tibody Technique) 一、人源化抗体 二、小分子抗体 三、双特异性抗体 四、抗体胞合蛋白 五、抗体库技术 学习要点 ·蛋白质的提筑·免疫动物的方法 ·免疫血清的纯化与鉴定·条交粒技术的基本原理 ·基因工程抗体的类型·抗体库技术流程 抗体是生物学及医学领域中应用最广“泛的制剂。免疫学检验中尤其需要各式各样的抗 体。抗体的质量直接关系到检验方法的特异性和敏感性，因此抗体的制备是免疫学技术的基
第十四章 特异性抗体的制备技术 Preparation Technique of Specific Antibody 第一节 免疫原的制备(Immunogen Preparation) 一、颗粒性免疫原的制备 二、可溶性免疫原制备 三、人工抗原的制备 四、佐 剂 第二节 免疫血清的制备(Preparation of Immune Serum) 一、选择免疫动物 二、免疫方法 三、动物采血法 四、免疫血清的纯化 五、抗血清的鉴定与保存 第三节 单克隆抗体制备技术(Preparation of Monoclonal Antibody) 一、杂交瘤技术的基本原理 二、单克隆抗体的批量生产 第四节基因工程抗体技术(Genetic engineering Antibody Technique) 一、人源化抗体 二、小分子抗体 三、双特异性抗体 四、抗体融合蛋白 五、抗体库技术 学习要点 ·蛋白质的提纯 ·免疫动物的方法 ·免疫血清的纯化与鉴定 ·杂交瘤技术的基本原理 ·基因工程抗体的类型·抗体库技术流程 抗体是生物学及医学领域中应用最广泛的制剂，免疫学检验中尤其需要各式各样的抗 体。抗体的质量直接关系到检验方法的特异性和敏感性，因此抗体的制备是免疫学技术的基
础。些今为止，抗体制备技术的发展己经历了三个阶段，用纯化抗原免疫动物获得的直清彩 克隆抗体(polyelona】ntibody,PcAh)为第一代抗体，用B细型索交瘤技术制备的单克隆 抗体onoclonal antibody,MeAb)为第二代抗体，第三代为基因工程抗体(genetic engineerin暖antibody)。上述抗体的制备方法与特点各不相月，本章将分别介绍。 第一节免疫原的制备 免疫螺折伦敢发机体免夜系统产生特异性抗体或政敏淋巴细胞的抗原。免疫单的纯度可 直接影响抗血清的特异性，因此抗体制备的首要工作是制备并纯化免疫原。自然条件下的免 技原，绝大多数是由多种成分构成的混合体，所以必须从复杂的混合体中提取出某种单一成 分，经纯化后才可用做免疫原制备相应的抗体。根据免疫原的性质及米薄不同，其纯化方法 也有所不问。 一、颗粒性免授原的制备 天然的颗粒性免疫原主要是指人，动物或寄生虫的细胞以及细商抗原等，制备方法相对 较简单。 《一)绵羊红细胞的制备 绵羊红细融是制备溶血素的免疫源，制备方法是采集健康绵羊的静脉血，立即注入无菌 带有玻璃珠的三角烧搬内，充分摇动15一20ai,以除去纤维蛋白，即得抗凝绵单全血。免 麦动物前，取适量抗凝血于离心管中，以无菌生理盐水洗涤细胞3次（每次000p国离心 1Omi),然后取压积红细胞，稀释成10心/l浓度的细胞是液，即可应用. 《二)细菌免疫原的制备 选用经鉴定合格的标准商株，接种于国体或液体培养基，置温箱37℃培养2h增菌后 处理。茵体抗原需要10℃水浴2~2，角杀商并酸坏鞭毛抗原后应用：而癯毛抗原要用有动 力的百株，商液用0.3%~0.5⅓甲径处理：细菌毒素抗单则应在杀商后再加入0.5%1% 氧化钙溶液方可使用。有些寄生虫卵也可制成抗原悬凌供免疫用。 此外，某些细胞膜成分经打碎后亦可制成颗粒性抗原。 二、可溶性免疫原制备 蛋白质、细首毒素、糖蛋白、脂蛋白、酶类和核酸等均为可溶性抗原，它们大部分来源 于组织和细胞，成分复杂，免度动物前需要选行纯化，其制备过程一般包括以下步露：①选
础。迄今为止，抗体制备技术的发展已经历了三个阶段，用纯化抗原免疫动物获得的血清多 克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)为第一代抗体，用 B 细胞杂交瘤技术制备的单克隆 抗体(monoclonal antibody, McAb)为第二代抗体，第三代为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。上述抗体的制备方法与特点各不相同，本章将分别介绍。 第一节 免疫原的制备 免疫原指能激发机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。免疫原的纯度可 直接影响抗血清的特异性，因此抗体制备的首要工作是制备并纯化免疫原。自然条件下的免 疫原，绝大多数是由多种成分构成的混合体，所以必须从复杂的混合体中提取出某种单一成 分，经纯化后才可用做免疫原制备相应的抗体。根据免疫原的性质及来源不同，其纯化方法 也有所不同。 一、颗粒性免疫原的制备 天然的颗粒性免疫原主要是指人、动物或寄生虫的细胞以及细菌抗原等，制备方法相对 较简单。 （一）绵羊红细胞的制备 绵羊红细胞是制备溶血素的免疫原，制备方法是采集健康绵羊的静脉血，立即注入无菌 带有玻璃珠的三角烧瓶内，充分摇动 15～20min，以除去纤维蛋白，即得抗凝绵羊全血。免 疫动物前，取适量抗凝血于离心管中，以无菌生理盐水洗涤细胞 3 次（每次 2000 rpm 离心 10min），然后取压积红细胞，稀释成 106 /ml 浓度的细胞悬液，即可应用。 （二）细菌免疫原的制备 选用经鉴定合格的标准菌株，接种于固体或液体培养基，置温箱 37℃培养 24h 增菌后 处理。菌体抗原需要 100℃水浴 2～2.5h 杀菌并破坏鞭毛抗原后应用；而鞭毛抗原要用有动 力的菌株，菌液用 0.3％～0.5％甲醛处理；细菌毒素抗原则应在杀菌后再加入 0.5％～1％ 氯化钙溶液方可使用。有些寄生虫卵也可制成抗原悬液供免疫用。 此外，某些细胞膜成分经打碎后亦可制成颗粒性抗原。 二、可溶性免疫原制备 蛋白质、细菌毒素、糖蛋白、脂蛋白、酶类和核酸等均为可溶性抗原，它们大部分来源 于组织和细胞，成分复杂，免疫动物前需要进行纯化。其制备过程一般包括以下步骤：①选
取合适的组织和饵粒将其破碎，②选用适当的方法从粗织和细围匀浆中提取目的蛋白或其他 抗原，③采用层析法等将可溶性抗原进一步纯化，④鉴定抗原的纯度。 《一)组织和细型可溶性抗原的目提 若要从组织细胞中取得可溶性抗原，则需要将组织细胞进行必要的预处理，以释救细胞 内组分： 「，组织匀聚的制备用于制备免疫源的组织材料必颈是新鲜暖低温保存的。获得材料后 应立即去除包膜或结蜂组织及大血管，脏器应用含0.5儿%，的生理盐水进行灌洗，去除 血管内残留的血液，并洗去血迹及污物：然后将洗净的组织剪成0.3一0.5c小块，加入适 量生理盐水，装入捣碎机简内以100Or/■的速度间断粉醉，制成组织匀浆，组织匀浆经过 2000一3000r/in离心10in后分成两部分：沉淀物内含大量的组织细散及其绵片：上清液 为提取可溶性抗原的原料，在提取前还必须进行高速离心去除微小的细胞碎片及组织， 2,细胞的破醉动物的细胞容易破碎，而微生物细胞因有细胞壁等结构，较为空州。有 时难以酸醉。以下介绍几种常用的细围破碎方法。 1)南处理法溶菌酶、纤维素南以及蜗牛酶等在一定的条件下能清化细菌和组织细 胞。例如溶茵酶在碱性环境中，对革兰阳性画的饵胞壁可产生溶商作用。该法适川于多种微 生物细陬的溶解，具有作用条件温和、不易破坏内含物成分，可以控制细幽壁损坏程度等优 点。 2)超声破碎法超声波的机城振动可桂流体局部减压，引发内部发生液体蓬动、藏 形成与清失，由此产生根大的压力而使细围破碎。超声波所使用的類率从1一kH不等。 进行超声破辞细图时，必须间量进行，一次超声1一2min,急时间为10一15ai。因长时间 超声会产热，可导致抗原酸坏。用超声酸碎细園，方法简单且省时，对一般组织细围破碎效 果好，而对于细菌，特别是对真菌的厚限孢子效果不佳。 3)该聪法冷冻可使饵胞内水分形成冰品以及胞内外溶剂浓度突然政变而导资饵胞膜 与细胞内颠较被破坏。其方法是将待破碎的细胞置干一0℃冰箱内完全冻结，然后让其在 30一37℃中缓慢雕化。如此反复两次，大都分组织细胞及细胞内的颗粒均可被破坏。该法适 用于组织细胞的碳醉，而对微生物细园的作用较差。 4)表面活性剂处理法在适当的H、温度及低离子强度的条件下，表面活性剂可与 脂蛋白彩成微泡，使细胞根的通透性改变面导致细胞溶解。常用的表面活性剂有十二抗林硫 酸钠、聚山梨葡、二乙基十六烷基溴等。此法作用比较温和，多用于酸醉细菌。在提取核酸 时，常用该法破碎跑
取合适的组织和细胞将其破碎，②选用适当的方法从组织和细胞匀浆中提取目的蛋白或其他 抗原，③采用层析法等将可溶性抗原进一步纯化，④鉴定抗原的纯度。 （一） 组织和细胞可溶性抗原的粗提 若要从组织细胞中取得可溶性抗原，则需要将组织细胞进行必要的预处理，以释放细胞 内组分。 1．组织匀浆的制备用于制备免疫原的组织材料必须是新鲜或低温保存的。获得材料后 应立即去除包膜或结缔组织及大血管，脏器应用含 0.5g/L NaN3 的生理盐水进行灌洗，去除 血管内残留的血液，并洗去血迹及污物；然后将洗净的组织剪成 0.3～0.5cm3 小块，加入适 量生理盐水，装入捣碎机筒内以 1000r/min 的速度间断粉碎，制成组织匀浆。组织匀浆经过 2000～3000r/min 离心 10min 后分成两部分：沉淀物内含大量的组织细胞及其碎片；上清液 为提取可溶性抗原的原料，在提取前还必须进行高速离心去除微小的细胞碎片及组织。 2．细胞的破碎动物的细胞容易破碎，而微生物细胞因有细胞壁等结构，较为坚固，有 时难以破碎。以下介绍几种常用的细胞破碎方法。 1）酶处理法 溶菌酶、纤维素酶以及蜗牛酶等在一定的条件下能消化细菌和组织细 胞。例如溶菌酶在碱性环境中，对革兰阳性菌的细胞壁可产生溶菌作用。该法适用于多种微 生物细胞的溶解，具有作用条件温和、不易破坏内含物成分、可以控制细胞壁损坏程度等优 点。 2）超声破碎法 超声波的机械振动可使流体局部减压，引发内部发生液体流动、漩 涡形成与消失，由此产生很大的压力而使细胞破碎。超声波所使用的频率从 1～20kHz 不等。 进行超声破碎细胞时，必须间歇进行，一次超声 1～2min，总时间为 10～15min。因长时间 超声会产热，可导致抗原破坏。用超声破碎细胞，方法简单且省时，对一般组织细胞破碎效 果好，而对于细菌，特别是对真菌的厚膜孢子效果不佳。 3）冻融法 冷冻可使细胞内水分形成冰晶以及胞内外溶剂浓度突然改变而导致细胞膜 与细胞内颗粒被破坏。其方法是将待破碎的细胞置于-20℃冰箱内完全冻结，然后让其在 30～37℃中缓慢融化。如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒均可被破坏。该法适 用于组织细胞的破碎，而对微生物细胞的作用较差。 4）表面活性剂处理法 在适当的 pH、温度及低离子强度的条件下，表面活性剂可与 脂蛋白形成微泡，使细胞膜的通透性改变而导致细胞溶解。常用的表面活性剂有十二烷基硫 酸钠、聚山梨酯、二乙基十六烷基溴等。此法作用比较温和，多用于破碎细菌。在提取核酸 时，常用该法破碎细胞
(二)蛋白质的提纯 组织细胞的相提液中除了含有所需要的蛋白质抗原成分外，还含有其他蛋白质、多糖， 脂类和核酸等成分。提纯抗原就是为了除去上述其他成分，蛋白质纯化方法属于生物化学技 术，以下具作简要介留 1,超速离心法此法分离和纯化抗愿的原理是利用各组分在梯度液中沉降的速度不 同，而使具有不同沉降速度的组分处于不月密度棉度层内，达到彼此分离的目的。常用的密 度梯度介质有莲糖，甘油、CC1等。 用超速离心法分离和纯化抗罩时，除个别成分外，很难将某一抗原成分分离出来，故只 用于少数大分子抗原的分离，如14、C1、甲状腺球蛋白等，以及某些比重较轻的抗原物 质，如载霜蛋白A、B等。而不适用于大多数蛋白质抗原， 2,遮择性沉淀法通常利用各种蛋白质分子理化特性的差异，采用不同的沉淀剂域 改变某些条件促使某一蛋白质抗原成分沉淀，从面达到纯化的目的。最常用的方法是盐析沉 淀法。 1)盐析法蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面离子及其周围水分子 的数目。在蛋白质溶液中加入高浓度中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质， 可使蛋白质分子周围的水化层减离乃至消失，同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度 发生改变，违成蛋白质表面的电荷大量被中和，又导致蛋白质溶解度更如降低，从面使蛋白 质分子之间聚集而沉淀，称为“盐析”，因各种蛋白质在不问盐浓度中的溶解度不月，其出 现盐析的先后顺序也不同，可使某种蛋白质从其他蛋白中分离出来。最常用的盐溶液是 3裤一作饱和度的硫酸铵，盐析法荷单方便，可用于蛋白质抗草的相提，Y缘蛋白的提取， 蛋白质的浓缩等，但盐析法提纯的抗原纯度不高，只适用于抗原的初步纯化 2)高分子有机聚合物沉淀法聚乙二醇(olyethyleneglycol,.EG)等水溶性聚合物在 溶液的H、离子强度和温度等条件固定时，可选择性沉淀不同分子量的蛋自质。一般情况 下，蛋白质分子量越大，被沉淀时所需EG浓度越低。例如，浓度为3%一4%的PEG可沉 淀免疫复合物。6%一7%可沉淀1W,12%一15%可沉淀其他球蛋白，25%可沉淀白蛋白。 其作用机制目前还不十分清楚。 3)有机溶闲沉淀法有机溶剂可峰低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力， 使蛋白分子聚集而沉淀。另外。有机溶剂与水作用，可导致蛋白质的水化层减露。从而破坏 蛋白质分子的稳定性，所以蛋白质在一定浓度的有机溶剂中可沉淀析出。常用的有机溶剂为 乙醇与丙铜。使用该法必须在低于0℃的湿度下进行，以防止蛋白变性
（二）蛋白质的提纯 组织细胞的粗提液中除了含有所需要的蛋白质抗原成分外，还含有其他蛋白质、多糖、 脂类和核酸等成分。提纯抗原就是为了除去上述其他成分。蛋白质纯化方法属于生物化学技 术，以下只作简要介绍。 1．超速离心法 此法分离和纯化抗原的原理是利用各组分在梯度液中沉降的速度不 同，而使具有不同沉降速度的组分处于不同密度梯度层内，达到彼此分离的目的。常用的密 度梯度介质有蔗糖、甘油、CsCl 等。 用超速离心法分离和纯化抗原时，除个别成分外，很难将某一抗原成分分离出来，故只 用于少数大分子抗原的分离，如 IgM、C1q、甲状腺球蛋白等，以及某些比重较轻的抗原物 质，如载脂蛋白 A、B 等，而不适用于大多数蛋白质抗原。 2．选择性沉淀法 通常利用各种蛋白质分子理化特性的差异，采用不同的沉淀剂或 改变某些条件促使某一蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。最常用的方法是盐析沉 淀法。 1）盐析法蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面离子及其周围水分子 的数目。在蛋白质溶液中加入高浓度中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质， 可使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度 发生改变，造成蛋白质表面的电荷大量被中和，又导致蛋白质溶解度更加降低，从而使蛋白 质分子之间聚集而沉淀，称为“盐析”。因各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，其出 现盐析的先后顺序也不同，可使某种蛋白质从其他蛋白中分离出来。最常用的盐溶液是 33%～50%饱和度的硫酸铵。盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提、γ球蛋白的提取、 蛋白质的浓缩等，但盐析法提纯的抗原纯度不高，只适用于抗原的初步纯化。 2）高分子有机聚合物沉淀法聚乙二醇（polyethyleneglycol, PEG）等水溶性聚合物在 溶液的 pH、离子强度和温度等条件固定时，可选择性沉淀不同分子量的蛋白质。一般情况 下，蛋白质分子量越大，被沉淀时所需 PEG 浓度越低。例如，浓度为 3％～4％的 PEG 可沉 淀免疫复合物，6％～7％可沉淀 IgM，12％～15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。 其作用机制目前还不十分清楚。 3）有机溶剂沉淀法有机溶剂可降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力， 使蛋白分子聚集而沉淀。另外，有机溶剂与水作用，可导致蛋白质的水化层减弱，从而破坏 蛋白质分子的稳定性，所以蛋白质在一定浓度的有机溶剂中可沉淀析出。常用的有机溶剂为 乙醇与丙酮。使用该法必须在低于 0℃的温度下进行，以防止蛋白变性
》核酸沉淀剂法当提取的蛋白质抗犀液中含有大量核酸成分封，需用核酸沉淀剂去除。 常用的方法是在提取液中加入硫酸鱼精蛋白、氯化锰或链荷素等，也可用核糖核酸酶体解法 除去核酸成分。 3,凝敢层析法主要利用凝胶的分子饰作用，将不同分子量的蛋白质进行分离。凝 陵是具有三推空间多孔网状结构的物质，经过适当的溶液处理后。装入层析柱。当含有多种 分子量的蛋白质溶液缓慢地流经凝敢层析柱时，大分子蛋白质因直径较大不易进入凝胶颗粒 的微孔内，只能面在颗粒的间隙，因此在洗脱时能很快地由上面下移动，随洗颗液最先流出。 小分子蛋白质可进入凝胶颗粒的微孔内，洗悦时向下移动的速度较慢，则较退棱洗脱，这样， 通过凝欧的分子筛作用，蛋白质分子由大到小依次分离出来。 4.离子交换层析是通过化学反应将带电离子基团引入纤雀素或凝胶，使之成为离 子交换剂，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。由于各种蛋白质所带的电荷量不同，与纤维 素成凝胶结合的能力就有差别。当洗脱时，逐渐增加流动相的离子强度，使溶液中的离子与 蛋自质竟争纤维素上的电荷位点，不同等电点的蛋自质就可分别解离下来。常用于蛋白质分 离的离子交换利有以下几种：①具有离子交换基团的纤谁素；②具有离子交换基团的交联 葡聚糖、琅脂糖及聚丙烯酰按凝散：③凝散合成的高度交联树脂。 5.亲和层析亲和层析是利用生物大分子与其配体之间所具有的专一柔和力面设计 的层析技术，具有专一亲和力的生物大分子与其配体包括：抗原和抗体、酶和所拘制剂（成 底物)、N和、激素和受体等体系。贝要将对应体系中的一方偶联于不溶性支持物上， 就可从混合物中专一地分离和提纯相应的另一方。与上述其他纯化方法相比，亲和层析法的 优点是具有更有效的纯化作用，而且分离远速，有时仅一步即呵达到饨化的目的： 免发亲和层析专指将抗原或抗体连接于固相支持物，制成免技吸附剂，以分离纯化相应 的特异性抗体或抗原。要达到良好的纯化效果，抗原及其相应的抗体需要符合以下要求：① 抗原成抗体必须具备单一特异性，②抗厚与抗体之间有较强的亲和力，③作为配体应具有一 个适当的化学基团，可用米连接支持物，但又不影响配体与相应抗源或抗体结合的亲和性， 常用的固相支持物有琼霜糖及聚丙烯酰胶凝胶等。 (三)免夜球蛋白片段的制备 免授球蛋白具有抗原性，可作为免疫原免疫动物制备相应的抗体。如果将免疫球蛋白分 解成片段，如F阳段、Fab段、轻链等制备相应的抗血清，用于免疫球蛋白的检测，则具有 更高的分辨能力。免疫球蛋白片段主要制备方法如下：
4)核酸沉淀剂法当提取的蛋白质抗原液中含有大量核酸成分时，需用核酸沉淀剂去除。 常用的方法是在提取液中加入硫酸鱼精蛋白、氯化锰或链霉素等。也可用核糖核酸酶降解法 除去核酸成分。 3．凝胶层析法 主要利用凝胶的分子筛作用，将不同分子量的蛋白质进行分离。凝 胶是具有三维空间多孔网状结构的物质，经过适当的溶液处理后，装入层析柱。当含有多种 分子量的蛋白质溶液缓慢地流经凝胶层析柱时，大分子蛋白质因直径较大不易进入凝胶颗粒 的微孔内，只能留在颗粒的间隙，因此在洗脱时能很快地由上而下移动，随洗脱液最先流出。 小分子蛋白质可进入凝胶颗粒的微孔内，洗脱时向下移动的速度较慢，则较迟被洗脱。这样， 通过凝胶的分子筛作用，蛋白质分子由大到小依次分离出来。 4．离子交换层析 是通过化学反应将带电离子基团引入纤维素或凝胶，使之成为离 子交换剂，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。由于各种蛋白质所带的电荷量不同，与纤维 素或凝胶结合的能力就有差别。当洗脱时，逐渐增加流动相的离子强度，使溶液中的离子与 蛋白质竞争纤维素上的电荷位点，不同等电点的蛋白质就可分别解离下来。常用于蛋白质分 离的离子交换剂有以下几种：①具有离子交换基团的纤维素 ；②具有离子交换基团的交联 葡聚糖、琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶；③凝胶合成的高度交联树脂。 5．亲和层析 亲和层析是利用生物大分子与其配体之间所具有的专一亲和力而设计 的层析技术。具有专一亲和力的生物大分子与其配体包括：抗原和抗体、酶和酶抑制剂（或 底物）、DNA 和 RNA、激素和受体等体系。只要将对应体系中的一方偶联于不溶性支持物上， 就可从混合物中专一地分离和提纯相应的另一方。与上述其他纯化方法相比，亲和层析法的 优点是具有更有效的纯化作用，而且分离迅速，有时仅一步即可达到纯化的目的。 免疫亲和层析专指将抗原或抗体连接于固相支持物，制成免疫吸附剂，以分离纯化相应 的特异性抗体或抗原。要达到良好的纯化效果，抗原及其相应的抗体需要符合以下要求：① 抗原或抗体必须具备单一特异性，②抗原与抗体之间有较强的亲和力，③作为配体应具有一 个适当的化学基团，可用来连接支持物，但又不影响配体与相应抗原或抗体结合的亲和性。 常用的固相支持物有琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶等。 （三）免疫球蛋白片段的制备 免疫球蛋白具有抗原性，可作为免疫原免疫动物制备相应的抗体。如果将免疫球蛋白分 解成片段，如 Fc 段、Fab 段、轻链等制备相应的抗血清，用于免疫球蛋白的检测，则具有 更高的分辨能力。免疫球蛋白片段主要制备方法如下：
1,分离事共价键肽链亚单位之间常为丰共价键的结合，如氢键、疏水键及静电引力等。 这些健结合力较弱，可经酸、碱、瓢或等将其新开制备片段。一种方法是改变出法：蛋 白质解离的州监界植在3一4（骏基滴定范圆）和9~10（赖氢酸一酪氨酸滴定范围），当加 入酸或碱使低于3或高于0时，肽链亚单位就会解离。第二种方法是变性刺法多数蛋 白在8lL眠域6©L盐酸有中会发生变性，从面导政肽蛙亚单位解离。此法也可用于载 脂蛋白抗厚的解离和胶原肚的提取。 2。分离共价键二硫健是连接免疫球蛋白的共价健，解离肽链间的二魔健可将轻链与重 鲑分开。解离的方法有氧化法和还原法。目前还原法使用较多，即将二硫健还原成流基，使 得二硫键斯裂。但还单的疏基极不稳定，去障还原剂后，又可再重新结合成二硫健。因此需 要用碘乙酸或碘代乙酰陵进行羧甲基化以封闭随基。氧化法的优点是切开二硫健后，肽链不 能重新形成二硫键，便于秋链的饨化，但色氨酸侧歧可能因氧化作用面枝破坏。 3,澳化氰裂解法溴化氰通过与蛋白质中的甲硫氨酸侧随的硫随基起反应，生成溴化亚 氨内酯。后者与水反应，将肽链断裂。 4.酶表解法刷解法专一性较好，不良反应少。不羽的片段可用不同的南进行裂解。如 木瓜酶可将1G裂解成为两个F油和一个Fe片段，胃蛋白酶可将IG裂解成为一个F(山)： 片受和几个小肽段，袜蛋白酶则将G夜解成不规则的肽链。实际应用中，常用木瓜酶切得 F©段作为抗原，以制备抗重链血清，用胃蛋白酶切得F(b”):作为抗体试剂： 《四》纯化抗罩的鉴定 纯化抗原的鉴定主要包括含量检测，分子量的寥定，纯度整定以及免度活性鉴定等。墓 定的方法多种多样，图每一种方法只能描述抗原性质的某一方面，一般可选用几种方法联合 应用。如：①厦白含量的测定可采用双缩服法或酚试剂法，如果抗原极为宝贵，可用紫外光 吸收法：②测定分子量一般用聚丙烯酰胶凝胶电泳法：③纯度鉴定常用聚丙烯酰胶凝胶电泳 法、免疫电泳法和结品法：④免疫活性鉴定用免疫双扩散法减免疫电冰法。 三、人工抗原的制备 人工抗原是指经过人工修饰的半抗原性免疫原，例如多糖、多肽、御体董素、脂防胺、 类霜质、核酸以及化学物质等。半抗原不能直接用作免疫原，只有把这些半抗原与蛋白质等 大分子物质结合后，才能刺藏机体产生抗体或致敏淋巴细围，用于偶眠半抗原的大分子物质 称为载体。 《一)载体的选择 载体的卖型及其与半抗原站合的方法可影响半抗原免疫原诱导免疫应答的效果，常用
1．分离非共价鍵肽链亚单位之间常为非共价键的结合，如氢键、疏水鍵及静电引力等。 这些键结合力较弱，可经酸、碱、胍或脲等将其断开制备片段。一种方法是改变 pH 法：蛋 白质解离的 pH 临界值在 3～4（羧基滴定范围）和 9～10（赖氨酸－酪氨酸滴定范围），当加 入酸或碱使 pH 低于 3 或高于 10 时，肽链亚单位就会解离。第二种方法是变性剂法：多数蛋 白在 8mol/L 脲或 6mol/L 盐酸胍中会发生变性，从而导致肽链亚单位解离。此法也可用于载 脂蛋白抗原的解离和胶原肽的提取。 2．分离共价鍵二硫键是连接免疫球蛋白的共价键，解离肽链间的二硫键可将轻链与重 链分开。解离的方法有氧化法和还原法。目前还原法使用较多，即将二硫键还原成巯基，使 得二硫键断裂。但还原的疏基极不稳定，去除还原剂后，又可再重新结合成二硫键。因此需 要用碘乙酸或碘代乙酰胺进行羧甲基化以封闭巯基。氧化法的优点是切开二硫键后，肽链不 能重新形成二硫键，便于肽链的纯化，但色氨酸侧链可能因氧化作用而被破坏。 3．溴化氰裂解法溴化氰通过与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚 氨内酯。后者与水反应，将肽链断裂。 4．酶裂解法酶解法专一性较好，不良反应少。不同的片段可用不同的酶进行裂解。如 木瓜酶可将 IgG 裂解成为两个 Fab 和一个 Fc 片段，胃蛋白酶可将 IgG 裂解成为一个 F(ab＇)2 片段和几个小肽段，胰蛋白酶则将 IgG 裂解成不规则的肽链。实际应用中，常用木瓜酶切得 Fc 段作为抗原，以制备抗重链血清，用胃蛋白酶切得 F(ab＇)2 作为抗体试剂。 （四）纯化抗原的鉴定 纯化抗原的鉴定主要包括含量检测、分子量的鉴定、纯度鉴定以及免疫活性鉴定等。鉴 定的方法多种多样，但每一种方法只能描述抗原性质的某一方面，一般可选用几种方法联合 应用。如：①蛋白含量的测定可采用双缩脲法或酚试剂法，如果抗原极为宝贵，可用紫外光 吸收法；②测定分子量一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳法；③纯度鉴定常用聚丙烯酰胺凝胶电泳 法、免疫电泳法和结晶法；④免疫活性鉴定用免疫双扩散法或免疫电泳法。 三、人工抗原的制备 人工抗原是指经过人工修饰的半抗原性免疫原，例如多糖、多肽、甾体激素、脂肪胺、 类脂质、核酸以及化学物质等。半抗原不能直接用作免疫原，只有把这些半抗原与蛋白质等 大分子物质结合后，才能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。用于偶联半抗原的大分子物质 称为载体。 （一） 载体的选择 载体的类型及其与半抗原结合的方法可影响半抗原免疫原诱导免疫应答的效果，常用
的载体有蛋白质类、多肽类聚合物和大分子聚合物等。 1。蛋白质类蛋白质作为一种常用的良好载体，以白蛋白使用最为普漏。因为白蛋 白具有较高的溶解度，免疫原性强，取材方便等特点。常用的有牛血清白蛋白、人血清白蛋 白、血监蛋自、兔血清自蛋白等。 2,多肽聚合物多肽聚合物是由人工合成的，也是良好的载体。常用的为多聚懒氨 酸，分子量高达十几万到几十万，多聚赖氨酸可与半抗原的品或-00出结合，所制备的半 抗原免夜鼎可刺激动物产生高滴度、高紊和力的抗体， 3,大分子聚合物是指骏甲基纤维素，聚乙烯比暗统酮等。它们均可与半抗原 结合，再加入福氏佐剂则可诱导动物产生高效价的抗体， 《二)率抗螺，与我体的连接 半抗原与载体的连接方法有物理吸附法和化学方法，物理吸附的载体有聚乙烯戴咯统丽 和瘦甲基纤维素等，它们通过电荷和微孔来吸附半抗原。化学方法是利用某些功能基团肥半 抗螺连接到载体上，这些载体包括蛋白质类和人工合成的多聚赖氨酸。根据半抗单的化学结 构不同。它们与载体连接的方法亦不同，主要有以下三种形式： ,带有游离氨基或游离瘦基以及两种基团都有的抗原，可直接与载体连接。脑啡 肽、胃篷煮、胰高血糖素、前列粮素等多肽激煮类，自身有游离的氨基或陵基。瘦基可用碳 化二亚胺法和混合酸研法与载体氨基形成稳定的肽键.面带氨基的率抗原则可与载体瘦基增 合，还可借助双功能试剂如戊二醛等与载体氨基连接。 2.带有羟基、醛基、解基的率抗原，如糖、多糖、醇、酚、核苷以及留族激素等，不 能直接与载体连接，需要用化学方法改造成骏基后才能与载体连接，例如破廚酸肝法可将带 险基的半抗原改造成带腹基的半抗原琥珀酸生物，酸甲基羟腹法适用干带制基华抗原的改 透等。 3.芳香族半抗原由于环上带有瘦基，它邻位上的氯银活泼。极易取代。一般先将骏帮 芳香按与氨基苯丙酸或对氨基马尿酸等进行重氯化反应，然后用碳化二亚胶法使半抗原上的 骏基与载体氢基缩合形成肽键：也可让半抗原的骏基先与载体缩合，再法行重氨化反应。 (三)筑原免变原的鉴定 率抗原与载体结合的数目与免孩原性相关。一般认为至少要20个以上的半抗原分子连 接到一个载体分子上，才能有效地产生抗体。因此，当半抗里与载体连接完成后，应测定载 体上所结合的半抗原量，常用吸收光讲分析法测定。 四、佐剂
的载体有蛋白质类、多肽类聚合物和大分子聚合物等。 1．蛋白质类 蛋白质作为一种常用的良好载体，以白蛋白使用最为普遍。因为白蛋 白具有较高的溶解度，免疫原性强，取材方便等特点。常用的有牛血清白蛋白、人血清白蛋 白、血蓝蛋白、兔血清白蛋白等。 2．多肽聚合物 多肽聚合物是由人工合成的，也是良好的载体。常用的为多聚赖氨 酸，分子量高达十几万到几十万，多聚赖氨酸可与半抗原的-NH2 或-COOH 结合，所制备的半 抗原免疫原可刺激动物产生高滴度、高亲和力的抗体。 3．大分子聚合物 是指羧甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮等。它们均可与半抗原 结合，再加入福氏佐剂则可诱导动物产生高效价的抗体。 （二）半抗原与载体的连接 半抗原与载体的连接方法有物理吸附法和化学方法。物理吸附的载体有聚乙烯吡咯烷酮 和羧甲基纤维素等，它们通过电荷和微孔来吸附半抗原。化学方法是利用某些功能基团把半 抗原连接到载体上，这些载体包括蛋白质类和人工合成的多聚赖氨酸。根据半抗原的化学结 构不同，它们与载体连接的方法亦不同，主要有以下三种形式： 1．带有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原，可直接与载体连接。如脑啡 肽、胃泌素、胰高血糖素、前列腺素等多肽激素类，自身有游离的氨基或羧基。羧基可用碳 化二亚胺法和混合酸酐法与载体氨基形成稳定的肽键。而带氨基的半抗原则可与载体羧基缩 合，还可借助双功能试剂如戊二醛等与载体氨基连接。 2．带有羟基、醛基、酮基的半抗原，如糖、多糖、醇、酚、核苷以及甾族激素等，不 能直接与载体连接，需要用化学方法改造成羧基后才能与载体连接。例如琥珀酸酐法可将带 羟基的半抗原改造成带羧基的半抗原琥珀酸衍生物，羧甲基羟胺法适用于带酮基半抗原的改 造等。 3．芳香族半抗原由于环上带有羧基，它邻位上的氢很活泼，极易取代。一般先将羧基 芳香胺与氨基苯丙酸或对氨基马尿酸等进行重氮化反应，然后用碳化二亚胺法使半抗原上的 羧基与载体氨基缩合形成肽键；也可让半抗原的羧基先与载体缩合，再进行重氮化反应。 （三）半抗原免疫原的鉴定 半抗原与载体结合的数目与免疫原性相关。一般认为至少要 20 个以上的半抗原分子连 接到一个载体分子上，才能有效地产生抗体。因此，当半抗原与载体连接完成后，应测定载 体上所结合的半抗原量，常用吸收光谱分析法测定。 四、佐 剂
佐制(ad加Wat)是指问抗原一起吸风先注则于机体，能够增强机体免夜应答成改变免 疫应容类型的物质。佐剂本身可以有免疫单性，也可以没有免夜源性。 《一》佐剂的种类 限多物质军可作为佐剂，通常按有无免疫厚性分为两类：一种是本身具有免疫愿性的佐 剂，如细胞因子、微生物及其产物，包括百日喷杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及细菌 脂多糖等：另一种本身无免疫原性，如液体石蜡、羊毛脂、氢氧化铝、表面活性剂等。目前 应用最多的是福氏佐剂(Freund adjuvant)。它是由液体右蜡、单毛霜和卡介前混合而成. 榴氏佐剂又可分为两种：①不完全摇氏性剂。是由液体石蜡与羊毛脂按1一5：1比例混合而 成：②福氏光全佐剂，在不光全佐剂中加卡介苗终浓度为2一20g/l)。即成为完全福氏 佐剂。在免疫动物时，应先将福氏桂剂与抗原按1：1体积比混匀，制成“油包水”乳化液， 《二》佐剂的作用机理 佐剂的作用机理较为复杂，至今尚未完全清楚。归纳起米主要有以下几种作用：①可以 增加抗原的表而积和政变抗原活性基团构重，从而增强抗原的免疫原性：②作剂与抗原混合 可改变抗原的物理性状，易于刺激机体同部引起肉芽肿，延长抗原在同部组凯的贮存时间， 使抗原缓慢释放：③增强巨堂细围的吞噬作用，刺激淋巴细胞增生，从而促进体液免夜，细 胞免疫和非特异性免授功能。 第二节免夜血清的制备 用生化杭原免疫动物是制备免变血请的通用方法，由于纯化的抗原常常带有多个抗原决 定能，免疫动物后可刺激产生针对同一抗原不月决定银的抗体，所以免疫血清实质上包奢了 多种质与量均不问的抗体，故称多克隆抗体。其特异性和效价与免夜原以及免疫动物的方式 有很大的美系 一、选择免疫动物 用于制备免疫血清的动物主要有辅乳类和禽类。常用的是家兔，绵羊，程鼠、小白鼠和 鸡等，有时根据需要尚可采川山羊和马。具体透并时要考虑如下因素： 《一)抗原与动物种属的关系 一最米说，抗星的米源与免疫动物的亲缘关系越运，免疫源性越强，产生的免夜效果越 好。而同种系或彩缘关系较近者，免授效果差，其至不产生抗体。例如鸡与鸭、兔与大鼠之 间不适于作免疫动物。 (二)动物的个体状况
佐剂（adjuvant）是指同抗原一起或预先注射于机体，能够增强机体免疫应答或改变免 疫应答类型的物质。佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。 （一）佐剂的种类 很多物质都可作为佐剂，通常按有无免疫原性分为两类：一种是本身具有免疫原性的佐 剂，如细胞因子、微生物及其产物，包括百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及细菌 脂多糖等；另一种本身无免疫原性，如液体石蜡、羊毛脂、氢氧化铝、表面活性剂等。目前 应用最多的是福氏佐剂(Freund adjuvant)。它是由液体石蜡、羊毛脂和卡介苗混合而成。 福氏佐剂又可分为两种：①不完全福氏佐剂，是由液体石蜡与羊毛脂按 1～5：1 比例混合而 成；②福氏完全佐剂，在不完全佐剂中加卡介苗(终浓度为 2～20mg/ml)，即成为完全福氏 佐剂。在免疫动物时，应先将福氏佐剂与抗原按 1:1 体积比混匀，制成 “油包水”乳化液。 （二）佐剂的作用机理 佐剂的作用机理较为复杂，至今尚未完全清楚，归纳起来主要有以下几种作用：①可以 增加抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；②佐剂与抗原混合 可改变抗原的物理性状，易于刺激机体局部引起肉芽肿，延长抗原在局部组织的贮存时间， 使抗原缓慢释放；③增强巨噬细胞的吞噬作用，刺激淋巴细胞增生，从而促进体液免疫、细 胞免疫和非特异性免疫功能。 第二节 免疫血清的制备 用纯化抗原免疫动物是制备免疫血清的通用方法。由于纯化的抗原常常带有多个抗原决 定簇，免疫动物后可刺激产生针对同一抗原不同决定簇的抗体，所以免疫血清实质上包含了 多种质与量均不同的抗体，故称多克隆抗体。其特异性和效价与免疫原以及免疫动物的方式 有很大的关系。 一、选择免疫动物 用于制备免疫血清的动物主要有哺乳类和禽类。常用的是家兔、绵羊、豚鼠、小白鼠和 鸡等，有时根据需要尚可采用山羊和马。具体选择时要考虑如下因素： （一）抗原与动物种属的关系 一般来说，抗原的来源与免疫动物的亲缘关系越远，免疫原性越强，产生的免疫效果越 好。而同种系或亲缘关系较近者，免疫效果差，甚至不产生抗体。例如鸡与鸭、兔与大鼠之 间不适于作免疫动物。 （二）动物的个体状况
动物的年龄与健康状况可影响所产生抗体的效价，年龄太小者容号产生免疫耐受，而年 老体衰者，免疫应答能力低下，不号产生高效价抗体。所以透择的动物必领是适龄、健壮、 体重符合要求而且无感染的正常动物。 (三)抗单的性质 对于不月性质的免疫原，适用的动物亦有所不同。蛋白质抗原一般适用千大部分动物， 但有些动物体内因为有类似物质成其他的原因，对某些蛋白质免疫反应极差。如家兔对牌岛 素、绵羊对正、山羊对多种酶类均不易产生抗体。因此，酶宜选用露鼠、那体藏素宜选用 家兔作为免疫动物。 4,免疫血清用量和要求 对免疫血清需求量大时，，型选用马、驴和绵羊等大动物。若需求量少则可选用家鱼， 群鼠和鸡等小动物.另外，按免疫动物的不同，所获得的抗体有R型(bbit)和H型(hose) 之分。R型是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，具有较宽的抗源抗体反应合适比例范围， 适用于作诊断试剂：H型是用马等大动物免疫铁得的抗体，抗原抗体反应合适比例较窄，一 般用作免疫治疗（抗毒素血清）。 二、免疫方法 在免疫动物过程中主要应考虑免疫原的剂量，免疫途径，加强免及的时间与次数以及佐 剂的选择等几方面因素对免度效果的影响。 《一》免整原的剂量 免疫原的接种剂量按抗原本身免疫原性的强弱、动物的个体状志和免疫时间来确定，一 般认为。免疫原的剂量适当加大，时何间隔廷长，可获得高效价的抗体，免疫原剂量过大 暖过小都容易引起免疫耐受。第一次免疫时免疫剂量不宜过大，以免接种过量的免疫原。导 致免疫麻绑，如强免技时可增大抗原剂量。 《二)免疫间隔时阿 免技间隔时间是影响抗体产生的重要因素，尤其是首次与第二次免疫接种的间隔更应 注意。首次免疫接种后，因机体正处于武别抗原和进行B细胞活化增箱阶段，如果很快 进行第二次抗单刺激极易造成免疫钟制。一般蛋白质抗原以间隔10一20天为好，二次后间 隔7一10天加强免疫一次。若间隔时间太长，则刺激变弱，抗体效价不高。而竿抗星的接种 间隔要求长一些。整个免疫过程一般接种5一8次。 (三)免夜途径
动物的年龄与健康状况可影响所产生抗体的效价，年龄太小者容易产生免疫耐受，而年 老体衰者，免疫应答能力低下，不易产生高效价抗体。所以选择的动物必须是适龄、健壮、 体重符合要求而且无感染的正常动物。 （三）抗原的性质 对于不同性质的免疫原，适用的动物亦有所不同。蛋白质抗原一般适用于大部分动物， 但有些动物体内因为有类似物质或其他的原因，对某些蛋白质免疫反应极差，如家兔对胰岛 素、绵羊对 IgE、山羊对多种酶类均不易产生抗体。因此，酶宜选用豚鼠、甾体激素宜选用 家兔作为免疫动物。 4． 免疫血清用量和要求 对免疫血清需求量大时，，应选用马、驴和绵羊等大动物。若需求量少则可选用家兔、 豚鼠和鸡等小动物。另外，按免疫动物的不同，所获得的抗体有 R 型(rabbit)和 H 型(horse) 之分。 R 型是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，具有较宽的抗原抗体反应合适比例范围， 适用于作诊断试剂；H 型是用马等大动物免疫获得的抗体，抗原抗体反应合适比例较窄，一 般用作免疫治疗（抗毒素血清）。 二、免疫方法 在免疫动物过程中主要应考虑免疫原的剂量、免疫途径、加强免疫的时间与次数以及佐 剂的选择等几方面因素对免疫效果的影响。 （一）免疫原的剂量 免疫原的接种剂量按抗原本身免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。一 般认为，免疫原的剂量适当加大，时间间隔延长，可获得高效价的抗体，但免疫原剂量过大 或过小都容易引起免疫耐受。第一次免疫时免疫剂量不宜过大，以免接种过量的免疫原，导 致免疫麻痹，加强免疫时可增大抗原剂量。 （二） 免疫间隔时间 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，尤其是首次与第二次免疫接种的间隔更应 注意。首次免疫接种后，因机体正处于识别抗原和进行 B 细胞活化增殖阶段，如果很快 进行第二次抗原刺激极易造成免疫抑制。一般蛋白质抗原以间隔 10～20 天为好，二次后间 隔 7～10 天加强免疫一次，若间隔时间太长，则刺激变弱，抗体效价不高。而半抗原的接种 间隔要求长一些。整个免疫过程一般接种 5～8 次。 （三）免疫途径
抗原进入机体的途径与抗原的吸收、代谢速度有很大的关系。常用的免疫途径有静脉、 肌肉、皮下、皮内、腹腔、淋巴结、脾脏等。皮内或皮下接种时一般采用多点法注射，如足 掌、背部两侧、耳后和被窝淋巴结网围等处。如抗原极宝贵可采取淋巴结内微量接种法。静 脉或腹腔注射法多用于顾粒性抗原或加强免疫接种。 三，动物采血法 在采集免疫血清之前，要预先进行抗体效价测定。若抗体效价达到要求，应在末次免孩 后一周及时采血，否则效价将会下降，常用动物采血法有以下几种， (一》颈动脉放血法 此法成血量较多，家兔、绵羊、山羊等动物采血皆可用该法。先将动物仰面博于动物因 定架上。在筑部外侧切开皮肤，分离颈总动隙，插入动林插管，将血液引入玻璃器皿， (二》静味采血法 此种采血法可隔日进行一次，有时可采集较多血液。如锦羊可从颈静脉采血，一次可采 集00■1血液，而后立即国输%葡萄糖盐水，三天后还可采血。动物体息一周后再加成免 疫一次。又可采直2次。小佩往往用断尾或摘原球法采血，每鼠仅得直液1一1.51。 (三)心航采血 将动物国定于仰卧位，在其病壁探明心脏搏动最明显处，用16号针头在该部位与胸壁 成5”角穿刺。本法常用于家兔、豚鼠和鸡等小动物，但操作不当，则容易引起动物中途 死亡， 采集动物血液后，应尽快分离出血清，分离方法通常采用室温自然凝血，再置于37℃ 温箱1，然后放4℃冰箱待血块收缩后，收集血清。 四、免疫血清的纯化 由抗累免疫动物制备的免疫血清是成分复杂的混合物，除了含有特异性抗体外，还存在 非特异性抗体和其他的血清成分。因此，在应用抗血清前必须先行纯化，以去除桑抗体防止 血清中的其他成分干扰试聚结果。 (一)纯化特异性抗体 在免疫血请的制备过程中，有时由于免疫原不纯，含有性质相近的桑抗原，常导致其能 条抗体产生混杂与血清中。为了得到单价特异性抗血清。可深用亲和层析法和吸附法除去无 关的杂抗体， I,彩和层析法将相应的象抗原交民到Sepharose 48上，装柱后，将欲纯化的免疫血清 通过亲和层析柱，使杂抗体吸附干柱上，瓷脱液则为特异性抗体
抗原进入机体的途径与抗原的吸收、代谢速度有很大的关系。常用的免疫途径有静脉、 肌肉、皮下、皮内、腹腔、淋巴结、脾脏等。皮内或皮下接种时一般采用多点法注射，如足 掌、背部两侧、耳后和腋窝淋巴结周围等处。如抗原极宝贵可采取淋巴结内微量接种法。静 脉或腹腔注射法多用于颗粒性抗原或加强免疫接种。 三、动物采血法 在采集免疫血清之前，要预先进行抗体效价测定。若抗体效价达到要求，应在末次免疫 后一周及时采血，否则效价将会下降。常用动物采血法有以下几种。 （一）颈动脉放血法 此法放血量较多，家兔、绵羊、山羊等动物采血皆可用该法。先将动物仰面缚于动物固 定架上，在颈部外侧切开皮肤，分离颈总动脉，插入动脉插管，将血液引入玻璃器皿。 （二）静脉采血法 此种采血法可隔日进行一次，有时可采集较多血液。如绵羊可从颈静脉采血，一次可采 集 300ml 血液，而后立即回输 10%葡萄糖盐水，三天后还可采血。动物休息一周后再加强免 疫一次，又可采血 2 次。小鼠往往用断尾或摘眼球法采血，每鼠仅得血液 1～1.5ml。 （三）心脏采血 将动物固定于仰卧位，在其胸壁探明心脏搏动最明显处，用 16 号针头在该部位与胸壁 成 45°角穿刺。本法常用于家兔、豚鼠和鸡等小动物，但操作不当，则容易引起动物中途 死亡。 采集动物血液后，应尽快分离出血清，分离方法通常采用室温自然凝血，再置于 37℃ 温箱 1h，然后放 4℃冰箱待血块收缩后，收集血清。 四、免疫血清的纯化 由抗原免疫动物制备的免疫血清是成分复杂的混合物，除了含有特异性抗体外，还存在 非特异性抗体和其他的血清成分。因此，在应用抗血清前必须先行纯化，以去除杂抗体防止 血清中的其他成分干扰试验结果。 (一)纯化特异性抗体 在免疫血清的制备过程中，有时由于免疫原不纯，含有性质相近的杂抗原，常导致其他 杂抗体产生混杂与血清中。为了得到单价特异性抗血清，可采用亲和层析法和吸附法除去无 关的杂抗体。 1．亲和层析法将相应的杂抗原交联到 Sepharose 4B 上，装柱后，将欲纯化的免疫血清 通过亲和层析柱，使杂抗体吸附于柱上，洗脱液则为特异性抗体