温州医学院文本酶免疫技术_临床免疫学检验第二十章.doc_大学文库

·异相酶免疫技术及其常用技术类型·解联免疫吸用试验的基本导理 ·酶联免夜吸附试验的方法类型 ·斑点酶免变吸附试险原理 ·免疫清滤试验的源理 ·免度层析试验原理 ·免疫印迹法星理第一节概述一、原理衡免疫技术是以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术，它是将酶与抗体（或抗原》结合成酶标记抗体（或抗原），此结合物既保留抗体（或抗原）的免授学活性，又保面酶对度物的催化活性。在酶标抗体《或抗原)与抗原（或抗体》的特异性反应完成后，如入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原（抗体）进行定位、定性或定量的测定分析。它提高了抗原抗体反应的酸感性，在经典的三大标记免疫技术中，它具有敏感、特异、精确，酶标记物的有效期长等优点。近年来，随着免夜学技术的不斯发展，如单克隆抗体、生物素-亲和素傲大系统与化学发光分析技术等的问世，促进免疫学检测方法的转异性，灵傲度提高和白动化程度明显提高：酶免疫技术与各种标记免疫技术酸合发根，在生物学和医学中的应用日趋广泛，二，酶及其底物《一)酶的达释要求一个南蛋白分子每分钟可衡化10心10心个成物分子转变成有色产物。因此，用刚标记执体（或抗原）建立酶免疫测定法，可使免度反应的结果得以放大。保正测定方法的灵敏度，为此用于标记的南应符合下列委求： ①酶活性高，修对低浓度底物产生较高的催化反应率， ②具有可与抗原、抗体共价结合的基团。标记后懈活性保持稳定，而且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。隋霍化底物后产生的信号产物易于判定或测量，且方法简单、敏感和重复性好。 ④衡话性不受样品中其他成分《内性酶、抑制物)的影响：用于均相酶免度测是的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，前活性出现抑制或激话。梅、辅助因子及其底物均对人体无危害，理化惟质稳定，Ⅱ价廉号得。 (二》常用的酶

• 异相酶免疫技术及其常用技术类型 • 酶联免疫吸附试验的基本原理 • 酶联免疫吸附试验的方法类型 • 斑点酶免疫吸附试验原理 • 免疫渗滤试验的原理 • 免疫层析试验原理 • 免疫印迹法原理第一节概述一、原理酶免疫技术是以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。它是将酶与抗体（或抗原）结合成酶标记抗体（或抗原），此结合物既保留抗体（或抗原）的免疫学活性，又保留酶对底物的催化活性。在酶标抗体（或抗原）与抗原（或抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原（抗体）进行定位、定性或定量的测定分析。它提高了抗原抗体反应的敏感性，在经典的三大标记免疫技术中，它具有敏感、特异、精确、酶标记物的有效期长等优点。近年来，随着免疫学技术的不断发展，如单克隆抗体、生物素-亲和素放大系统与化学发光分析技术等的问世，促进免疫学检测方法的特异性、灵敏度提高和自动化程度明显提高。酶免疫技术与各种标记免疫技术融合发展，在生物学和医学中的应用日趋广泛。二、酶及其底物（一）酶的选择要求一个酶蛋白分子每分钟可催化 10 3 ~104 个底物分子转变成有色产物。因此，用酶标记抗体（或抗原）建立酶免疫测定法，可使免疫反应的结果得以放大，保证测定方法的灵敏度，为此用于标记的酶应符合下列要求： ① 酶活性高，能对低浓度底物产生较高的催化反应率。 ②具有可与抗原、抗体共价结合的基团，标记后酶活性保持稳定，而且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。 ③酶催化底物后产生的信号产物易于判定或测量，且方法简单、敏感和重复性好。 ④酶活性不受样品中其他成分（内源性酶、抑制物）的影响；用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性出现抑制或激活。 ⑤酶、辅助因子及其底物均对人体无危害，理化性质稳定，且价廉易得。（二）常用的酶

I.辣根过氧化物酶(orseradish peroxidase,围配)服P因在装菜植物辣根中含量最多而得名。它是由糖蛋白（丰酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成的复合酶，分子量的 40kD,等电点为P5.59.0。主酶为无色蛋白，最大吸收光谱为275，辅基是酶的活性中心，最大吸收光讲为03nn。那即的质量常以纯度(Reinbeit zhal,Z)和活性来表示。H即的纯度以A/Am的比值表示，2值越大，酶的纯度越高。用于酶免疫技术的即。其 Z应>3.0。即的话性则用单位表示，用邻联香陵法测定时，在25℃条件下1■in将1 “?底物转化为产物的酶量为一个单位，酶的纯度并不代表酶的活性，因此选用酶不仅要透纯度高。而且还要选活性强的酶。即与其他的降相比具有以下优点：①分子量较小，标记物导透入细胞内：②标记方法简单；@解及酶标记物比较稳定，易保存：在服.512.0范围内、，3C15a■条件下稳定，用甲茶与石蜡包埋切片处理，或用纯乙醇及1作甲醛水溶液固定作冰冻切片，其活性均不受影响：④溶解性好，1001缓冲盐溶液中可溶解5g:⑤价格较低且已商品化，导得：@ 底物种类多，可供不同的实验选择，因此，即是目前ISA及ICT中最常用的酶。氧化物、质化物，氯化物及叠氮化物等可物制HRP的话性，故不能用《%类防窝剂。 2.碱性磷酸酶(alkaline phospharase,AP)是一种磷酸酯的水解南。因其分子量较大《8010©)，不易透入细胞内，故很少用于E,但因其植感性高、空白值低，也常用于EIA 3.B半乳精背傅(alact0 sidase,Gal) -C1源于大指埃希商，分子量 54kD,最适作用6-8。因人血中缺乏此降，以其制备的南标记物在测定时不号受到内源性酶的干扰，因此也常用于均相酶免疫测定。 4.其他的酶常用于ECT的还有葡萄糖氧化椭(GCD),以及用于均相酶免疫测定的 6-璃酸葡萄糖脱氢酶，溶商酶、苹果酸脱氢酶等。 (三》常用的成物 1,H股的底物为过氧化物和供氢体（用）。即的真正底物是马，但人们]习惯把供氢体称为底物暖统称供氢体底物。《1)过氧化物：目前常用的是过氧化氧《0，)和过氧化氧展素〔H0)。A应用液很不稳定，须在用前临时配制。在过氧化氢尿素中约含35的0，将其配制成保存液或应用液可较长时期保存。 (2)供氯体：在LI5A中常用的供氯体为邻苯二依(0D)和四甲基联茶肢(B)。0D 是包15A中应用最多的供氢体，其灵敏度高，测定方便。其缺点为配成应用液后不稳定，常

1．辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） HRP 因在蔬菜植物辣根中含量最多而得名。它是由糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成的复合酶，分子量约 40kD，等电点为 pH5.5~9.0。主酶为无色蛋白，最大吸收光谱为 275nm，辅基是酶的活性中心，最大吸收光谱为 403nm。HRP 的质量常以纯度（Reinheit zhal，RZ）和活性来表示。HRP 的纯度以 A403nm/A275nm 的比值表示，RZ 值越大，酶的纯度越高。用于酶免疫技术的 HRP，其 RZ 应＞3.0。HRP 的活性则用单位表示，用邻联茴香胺法测定时，在 25℃条件下 1min 将 1 μg 底物转化为产物的酶量为一个单位。酶的纯度并不代表酶的活性，因此选用酶不仅要选纯度高，而且还要选活性强的酶。 HRP 与其他的酶相比具有以下优点：①分子量较小，标记物易透入细胞内；②标记方法简单；③酶及酶标记物比较稳定，易保存；在 pH3.5~12.0 范围内、63℃15min 条件下稳定，用甲苯与石蜡包埋切片处理，或用纯乙醇及 10%甲醛水溶液固定作冰冻切片，其活性均不受影响；④溶解性好，100ml 缓冲盐溶液中可溶解 5gHRP；⑤价格较低且已商品化，易得；⑥ 底物种类多，可供不同的实验选择。因此，HRP 是目前 ELISA 及 EIHCT 中最常用的酶。氧化物、硫化物、氟化物及叠氮化物等可抑制 HRP 的活性，故不能用 NaN3 类防腐剂。 2．碱性磷酸酶（alkaline phospharase，AP）是一种磷酸酯的水解酶。因其分子量较大（80~100kD），不易透入细胞内，故很少用于 EIH，但因其敏感性高、空白值低，也常用于 EIA。 3.β半乳糖苷酶( -galactosidase， -Gal ) -Gal 源于大肠埃希菌，分子量 540kD，最适作用 pH6-8。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标记物在测定时不易受到内源性酶的干扰，因此也常用于均相酶免疫测定。 4．其他的酶常用于 EIHCT 的还有葡萄糖氧化酶（GOD），以及用于均相酶免疫测定的 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。（三）常用的底物 1．HRP 的底物为过氧化物和供氢体（DH2）。HRP 的真正底物是 H2O2，但人们习惯把供氢体称为底物或统称供氢体底物。（1）过氧化物：目前常用的是过氧化氢（H2O2）和过氧化氢尿素（CH6N2O3）。H2O2 应用液很不稳定，须在用前临时配制。在过氧化氢尿素中约含 35%的 H2O2，将其配制成保存液或应用液可较长时期保存。（2）供氢体：在 ELISA 中常用的供氢体为邻苯二胺（OPD）和四甲基联苯胺（TMB）。OPD 是 ELISA 中应用最多的供氢体，其灵敏度高，测定方便。其缺点为配成应用液后不稳定，常

衡标记的抗体或抗原也称为酶的结合物(c0n恒gatc),是酶免夜技术的关键试剂，其质量优劣直接影响情免疫技术方法的应用效果。酶标记抗体《抗螺)的万法有多种，常梅不同而采用不月的标记方法。常采用的标记方法一般应符合，①技术方法简单产率高：②不影响酶和抗体（抗原》的生物活性：③酶标记物稳定，本身不发生聚合：④较少形成酶与酶，抗体与抗体或抗解与抗原的聚合物：高质量的酶标抗体（抗原）又同酶，抗体（抗等原材料的特性及制备方法密切相关，用于制备酶结合物的抗体不仅香特异性好、效价高、亲和力强以及比活性较高。而且还要能批量生产和易于分离饨化。目前常根据具体方法要求选用单克隆抗体、多克隆抗体经纯化的 Ig组份、Ig的Fb'和F(h):片段等。抗原则要求纯度高，抗原性完整（华抗原需先与大分子载体蛋自交联)：《一》虎二醛交联标记法此法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体（抗原）结合，最常用的交联剂是戊二醛。它具有两个话性醛基，可分别与酶分子和抗体（抗原）分子上的氢基结合形成Schiff”8碱。将两个分子以五碳桥连接起来。虎二醛法又根据试剂如入的方法分为一步法和二步法。 1,一步法将抗体（抗原）、酶和戊二醛同时混合。此法操作简便，广泛用于爵、P 与抗体（抗原）的交联。但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障得。酶和抗体容易失活，且酶标记物的聚合较多，易发生自身交联，酶和抗体交联时分子阿的比例不严格，结合物分子量大小不一，多数较大，因此穿透力较小。 2,二步法先将过量的成二醛与酶反应，让酶分子上的氮基仅与成二竖分子上的征基结合，不发生酶与刚的结合，除去未与酶结合的多余度二醛后，再加入抗体（抗原），形成酶戊二醛一抗体（抗原》结合物。其促点是酶标记物均一，无白身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，国其产率更低。《二)改良过碘酸销标记法该法仅用于即的标记。即是一种糖蛋白，含18的糖，过确酸的可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基。此醛基很活霞，再与抗体蛋自的醉离氨基结合，形成即Q田IG。为防止酶蛋白氨基与径基反应发生自身偶联，常在标记简先用二时基氟莱 (FB)封闭屏蛋白上的a和。-氢基。酶与抗体的结合反应后，再加入圆氢化钠(NaHB) 还原后，即生成稳定的酶标记物。此法酶标记物产率较高，为常用的南标记杭体的方法。但纯化后仍有少量游离I心，部分结合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低

酶标记的抗体或抗原也称为酶的结合物(conjugate)，是酶免疫技术的关键试剂，其质量优劣直接影响酶免疫技术方法的应用效果。酶标记抗体（抗原）的方法有多种，常因酶不同而采用不同的标记方法。常采用的标记方法一般应符合：①技术方法简单产率高；②不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；③酶标记物稳定，本身不发生聚合；④较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的聚合物。高质量的酶标抗体(抗原)又同酶、抗体(抗原)等原材料的特性及制备方法密切相关。用于制备酶结合物的抗体不仅需特异性好、效价高、亲和力强以及比活性较高，而且还要能批量生产和易于分离纯化。目前常根据具体方法要求选用单克隆抗体、多克隆抗体经纯化的 Ig 组份、Ig 的 Fab'和 F(ab')2 片段等。抗原则要求纯度高，抗原性完整(半抗原需先与大分子载体蛋白交联)；（一）戊二醛交联标记法此法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体（抗原）结合。最常用的交联剂是戊二醛。它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体（抗原）分子上的氨基结合形成 Schiff’s 碱，将两个分子以五碳桥连接起来。戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法。 1．一步法将抗体（抗原）、酶和戊二醛同时混合。此法操作简便，广泛用于 HRP、AP 与抗体（抗原）的交联。但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障碍，酶和抗体容易失活，且酶标记物的聚合较多，易发生自身交联，酶和抗体交联时分子间的比例不严格，结合物分子量大小不一，多数较大，因此穿透力较小。 2．二步法先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合，除去未与酶结合的多余戊二醛后，再加入抗体（抗原），形成酶-戊二醛-抗体（抗原）结合物。其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。（二）改良过碘酸钠标记法该法仅用于 HRP 的标记。HRP 是一种糖蛋白，含 18%的糖，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基。此醛基很活泼，再与抗体蛋白的游离氨基结合，形成 HRP-CH2-NH-IgG。为防止酶蛋白氨基与醛基反应发生自身偶联，常在标记前先用二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白上的α和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠（NaHB4）还原后，即生成稳定的酶标记物。此法酶标记物产率较高，为常用的酶标记抗体的方法。但纯化后仍有少量游离 IgG，部分结合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低

如以酶作为抗原与式相应抗体形成的免疫复合物代替酶标记物，就可提高酶免疫方法的灵敏度，减少化学属暖反应对酶和抗体活性的影响。因酶和抗酶抗体不用任刺化学交联剂处理减可特异性结合，其活性不受影响.因此服P-抗取(P即)、AP-抗P(APAP)已广泛用于酶免疫技术中。近来又有人将双特异性抗体或条交抗体用于南免发技术中，使酶免疫方法更加简便、特异性与灵敏性大大提高。标记抗体鉴定，通常采用棋盘滴定法进行锦选。见效十九章。四、酶标记物的纯化与鉴定《一》酶标记物的纯化标记完成后应除去反应溶液中的游离酶，游离抗体（抗原）入、酶聚合物以及抗体（抗原）聚合物。避免游离南增如非特异显色，以及游离抗体（抗原）起竞争作用而降低特异性染色蛋度，常用的纯化方法有葡案糖凝胶C一200/心一150过柱层析纯化和50%饱和硫酸铵沉淀提纯第。《二)酶标记物的鉴定每裁制备的南标记物都要进行质量和标记率的鉴定，质量签定包括静话性和抗体（抗原）的免疫活性鉴定， 1。质量鉴定常用免夜电冰或双扩散法，出现沉淀线表示梅标记物中的抗体《抗源》具有免孩活性。沉淀线经生理盐水反复漂洗后，满如酶的底物溶液，若在沉淀线上能显色，表示酶标记物中酶的活性仍保留。也可直接用LISA方法测定， 2.酶标记率的测定常用分光光度法分别测定酶标记物中酶和抗体（抗原）蛋白的含量，再按公式计算其标记率。如成二醛法制备的即标记【G,其酶标记率的计算方法如下： (1)南含量：南结合量(g/l)=A-×0.4,即倒在403m被长的A值为1时，酶的含量为Q4/l。 (2)1G含量，【G含量(/al》=(Aa-X0.42)×094×0.62:即酶蛋白(03) 结合2二醛后A值为0,2：抗体蛋自与醛化南结合后k,的增加6，故乘以0.94：兔1gG 的A.L.0时，为0.62.过确酸销标记法的1gG含量(g/al)=(A-Am=×03)×0.62, (3)克分子比成摩尔比E/P刊：/IgG=HRP(a/l)/即分子量÷1G(/al)/ 1G分子量

如以酶作为抗原与其相应抗体形成的免疫复合物代替酶标记物，就可提高酶免疫方法的灵敏度，减少化学偶联反应对酶和抗体活性的影响。因酶和抗酶抗体不用任何化学交联剂处理就可特异性结合，其活性不受影响。因此 HRP-抗 HRP（PAP）、AP-抗 AP（APAAP）已广泛用于酶免疫技术中。近来又有人将双特异性抗体或杂交抗体用于酶免疫技术中，使酶免疫方法更加简便、特异性与灵敏性大大提高。标记抗体鉴定，通常采用棋盘滴定法进行筛选，见第十九章。四、酶标记物的纯化与鉴定（一）酶标记物的纯化标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体（抗原）、酶聚合物以及抗体（抗原）聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体（抗原）起竞争作用而降低特异性染色强度。常用的纯化方法有葡聚糖凝胶 G-200/G-150 过柱层析纯化和 50%饱和硫酸铵沉淀提纯等。（二）酶标记物的鉴定每批制备的酶标记物都要进行质量和标记率的鉴定，质量鉴定包括酶活性和抗体（抗原）的免疫活性鉴定。 1．质量鉴定常用免疫电泳或双扩散法，出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有免疫活性。沉淀线经生理盐水反复漂洗后，滴加酶的底物溶液，若在沉淀线上能显色，表示酶标记物中酶的活性仍保留。也可直接用 ELISA 方法测定。 2．酶标记率的测定常用分光光度法分别测定酶标记物中酶和抗体（抗原）蛋白的含量，再按公式计算其标记率。如戊二醛法制备的 HRP 标记 IgG，其酶标记率的计算方法如下：（1）酶含量：酶结合量（mg/ml）= A403nm×0.4，即酶在 403nm 波长的 A 值为 1 时，酶的含量为 0.4 mg/ml。（2）IgG 含量：IgG 含量（mg/ml）=（A280nm-A403nm×0.42）×0.94×0.62：即酶蛋白（0.3）结合戊二醛后 A 值为 0.42；抗体蛋白与醛化酶结合后 A280nm 约增加 6%，故乘以 0.94；兔 IgG 的 A280nm=1.0 时，为 0.62。过碘酸钠标记法的 IgG 含量（mg/ml）=（A280nm-A403nm×0.3）×0.62。（3）克分子比或摩尔比(E/P)：HRP/IgG = HRP (mg/ml)/ HRP 分子量÷IgG(mg/ml)/ IgG 分子量

=H(/l)/40D÷1gGae/l)/16o知=即(g/al)/1gG(mg/lD×4(E/P一般为12。 (4)酶标记率：酶的标记率三结合物中刷量/标记时的酶量×100%《或酶的标记率三 Aaok/Aysons.) 一最酶量为1g/l,P/IG在1.52.0之间、酶的标记率大于Q3时，南联免疫吸附试验(en2 e linked immmnosorbent assay,LISA)的结果最好。五、固相酶免疫测定仪在且I5A测定过程中，需经过固相载体的洗涤和分离，分析仪的设计和制造较为闲难，因此LSA自动分析仪的月世较退，随着电子技术、计算机技术和免疫学技术的不断进步，LISA也有了长足的发展。由于测定所用的周相载体的不同，各种LISA分析仪在设计和结构上有很大差异，分述如下。 1微孔板固相酶免疫测定仪器国际上微孔板式LISA使用的载体为9第孔板，采用直接对板孔测定吸光度(A》的比色计，称为包15A测读仪（且IS制reader)。这种对微孔板包15A试剂通用的仪器20世纪80 年代初期即有商品问世，经过不断改进，己发展为自动化、高效率，高精密度的测定仪，LISA 中的洗涤步骤繁頊面不易标准化。代替手工操作的洗版机亦已在实验室中普寿采用。洗版机要求洗涤后因相表面非特异性物质洗涤干净。吸液后每孔中残留的液量极小。较精密的洗版机有可调节的定时、洗涤液定量及叛荡微孔板的功能。半白动微孔板式L54分析仪由加液器、温有器、洗板机和测读仪组成。测定中一个步像完成后由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中。目前实验室中己银少全部应用手工操作（洗板和用目视比色》的方法，测试标本较少的，般均用且ISA测读仪定量测定结果，并川洗板机代替手工洗涤，20世纪90年代末全自动微孔板式包]SA分析仪问世，在大批量标本的检测中，不但提高了工作效率，面且测定的精密度亦得到改善。版式包ISA仪器均为开政式的，即适用于所有微板式包1SA试剂。包1SA检测果的精密度主要取决于试剂的质量。全自动LI5A仪器本身的精密度一般在3%左右。应用促质试剂测定结果的精密度。定量测定可达到以下；常用的定性测定为感染性疾树抗原、抗体的检测。精密度在1%左右

= HRP (mg/ml)/ 40KD÷IgG(mg/ml)/ 160KD = HRP (mg/ml)/IgG(mg/ml)×4 (E/P)一般为 1~2。（4）酶标记率：酶的标记率 = 结合物中酶量/标记时的酶量×100% （或酶的标记率 = A403nm/ A280nm：）：一般酶量为 1 mg/ml、HRP/IgG 在 1.5~2.0 之间、酶的标记率大于 0.3 时，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的结果最好。五、固相酶免疫测定仪在 ELISA 测定过程中，需经过固相载体的洗涤和分离，分析仪的设计和制造较为困难，因此 ELISA 自动分析仪的问世较迟。随着电子技术、计算机技术和免疫学技术的不断进步，ELISA 也有了长足的发展。由于测定所用的固相载体的不同，各种 ELISA 分析仪在设计和结构上有很大差异，分述如下。 1.微孔板固相酶免疫测定仪器国际上微孔板式 ELISA 使用的载体为 96 孔板，采用直接对板孔测定吸光度（A）的比色计，称为 ELISA 测读仪（ELISA reader）。这种对微孔板 ELISA 试剂通用的仪器 20 世纪 80 年代初期即有商品问世，经过不断改进，已发展为自动化、高效率、高精密度的测定仪。ELISA 中的洗涤步骤繁琐而不易标准化。代替手工操作的洗板机亦已在实验室中普遍采用。洗板机要求洗涤后固相表面非特异性物质洗涤干净，吸液后每孔中残留的液量极小。较精密的洗板机有可调节的定时、洗涤液定量及振荡微孔板的功能。半自动微孔板式 ELISA 分析仪由加液器、温育器、洗板机和测读仪组成。测定中一个步骤完成后由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中。目前实验室中已很少全部应用手工操作（洗板和用目视比色）的方法。测试标本较少的，一般均用 ELISA 测读仪定量测定结果，并用洗板机代替手工洗涤。20 世纪 90 年代末全自动微孔板式 ELISA 分析仪问世，在大批量标本的检测中，不但提高了工作效率，而且测定的精密度亦得到改善。板式 ELISA 仪器均为开放式的，即适用于所有微板式 ELISA 试剂。ELISA 检测结果的精密度主要取决于试剂的质量。全自动 ELISA 仪器本身的精密度一般在 3%左右。应用优质试剂测定结果的精密度，定量测定可达到 7%以下；常用的定性测定为感染性疾病抗原、抗体的检测，精密度在 10%左右

2管式国相酶免疫测定仪器应用管式战相载体的且ISA分析仪器不多. (1)190年德国宝灵曼公可(Boehringer Mannhe1n)推出了全自动管式LISA分析系饶，S-300仪器和配套试剂Exy■一T©st,试剂包括用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物煮结合的抗原或抗体，辣根过氧化物懈标记的抗体和显色底物都S。测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只需一点定标。测定的精密度V在裤左右。测定项目齐全，包括激素、肿箱标志、心肌标志和感染性疾病的抗原、抗体等。 (2)法国Bio-Mereux公司生产的idas是一种特殊形状的管式全自动LISA的分析仪，配套使用一个特别的“试剂”(reagent str1p): 3小珠因相酶免授测定仪器珠式因相的特点是均一性优于板孔：以在容器中成批包核：洗涤时可在洗液中滚动，效果更好。小珠表面经磨砂处理后吸附面积增大，早年美国hbott公司生产的珠式半白动LISA仪器称为Qantun,国内主要用于肝炎标志物的检测.现有E自动分析系统和Roche公司指出的珠式全自动LIS剧分析仪Cobas Core I,Cobas Core II,深受检验实验室欢迎， 4.微粒因相酶免疫测定仪器用微粒作为固相的优点己如前所述，但其与液相的分离较为困难，一般需经过复杂的离心步骤。美国仙bott公司的1Mx白动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微校（粒径Q7μn)作为固相。特异抗体减抗源包被在微粒上。第一次抗原抗体反应后，将反位液通过特制的玻璃纤维粮。聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维颗上，液体则通过职滤出。以后的反应在膜上违行，用过滋方式洗涤。标记酶为碱性磷酸醉。底物为4甲基伞阴磷酸酶，反应后进行荧光测定。 Ix推出后被广泛采用。其后bott公可将该公司生产的作药物测定的TDx突光偏振分析仪与x组成一体多项目全自动免疫分析仪称为虹，也在检验实验室广泛应用， 5磁微粒图相隔免疫测定仪器磁微粒可用磁铁吸引与液相分离，是免疫测定中较为理想的固相载体，现已广泛应用于各种州相免疫测定中。较早应用磁微较作为酶免疫测定州相的是璃士Sr0n©公司，出品的 SerO2e分析系统由分光光度测读仪，磁铁板和试剂3部分组成。试剂包括抗FITC(荧光素)抗体，特异抗体或抗原包按的磁微粒（粒径1μ■》FITC,结合的特异抗体或抗原。碱性南酸酶标记的特异抗体或抗原及底物前肽(phenolphthalein)骑酸葡。在Serozyne中应用的抗FITC-FITC是与亲和素-生物素原理相同的间楼包核系饶，反应榄式与电化学发允免

2.管式固相酶免疫测定仪器应用管式固相载体的 ELISA 分析仪器不多。（1）1990 年德国宝灵曼公司（Boehringer Mannheim）推出了全自动管式 ELISA 分析系统，ES-300 仪器和配套试剂 Enzymun-Test。试剂包括用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物 ABTS。测定中标准曲线可使用 2 星期，每次测定只需一点定标。测定的精密度 CV 在 3%左右。测定项目齐全，包括激素、肿瘤标志、心肌标志和感染性疾病的抗原、抗体等。（2）法国Bio-Mereux公司生产的Vidas是一种特殊形状的管式全自动ELISA的分析仪，配套使用一个特别的“试剂条”（reagent strip）。 3.小珠固相酶免疫测定仪器珠式固相的特点是均一性优于板孔；以在容器中成批包被；洗涤时可在洗液中滚动，效果更好。小珠表面经磨砂处理后吸附面积增大。早年美国 Abbott 公司生产的珠式半自动 ELISA 仪器称为 Quantum，国内主要用于肝炎标志物的检测。现有 IMX 自动分析系统和 Roche 公司推出的珠式全自动 ELISA 分析仪 Cobas Core I、Cobas Core II，深受检验实验室欢迎。 4.微粒固相酶免疫测定仪器用微粒作为固相的优点已如前所述，但其与液相的分离较为困难，一般需经过复杂的离心步骤。美国 Abbott 公司的 IMx 自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（粒径 0.47μm）作为固相，特异抗体或抗原包被在微粒上。第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体则通过膜滤出。以后的反应在膜上进行，用过滤方式洗涤。标记酶为碱性磷酸酶，底物为 4-甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定。 IMx 推出后被广泛采用。其后 Abbott 公司将该公司生产的作药物测定的 TDx 荧光偏振分析仪与 IMx 组成一体多项目全自动免疫分析仪称为 Axsym，也在检验实验室广泛应用。 5.磁微粒固相酶免疫测定仪器磁微粒可用磁铁吸引与液相分离，是免疫测定中较为理想的固相载体，现已广泛应用于各种固相免疫测定中。较早应用磁微粒作为酶免疫测定固相的是瑞士 Serono 公司，出品的 Serozyme 分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和试剂 3 部分组成。试剂包括抗 FITC（荧光素）抗体，特异抗体或抗原包被的磁微粒（粒径 1μm）FITC，结合的特异抗体或抗原，碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原及底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯。在 Serozyme 中应用的抗 FITC-FITC 是与亲和素-生物素原理相同的间接包被系统，反应模式与电化学发光免

疫测定亦相似。反应在试管中进行，基本上用手工操作。反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒技随铁吸引至管底，完成因相与液相的分离。酶作用后反应液景粉红色，在分光光度计中进行测定。大、酶免疫技术的类型酶免疫技术是利用酶的高效霍化和做大作用与特异性抗星-抗体反应相结合而建立的一种标记免疫技术。由于是用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。因此酶免疫技术一般由二部组成：首先是抗原、抗体之间的一次或数次免疫学反应（其中包含有酶标抗原或抗体的参与)形成复合物：然后加入酶作用底物，德标抗星或抗体中的酶即催化其发生呈色反应，而产物的色泽程度与抗原抗体复合物中酶标记物的酶活性相关，因此可以通过测定酶活性来确定特检抗原或抗体的存在或含量。酶免疫技术按实际用途分为南免疫测定 (enzymeimumoassay,EI)酶免夜组枫化学(Enzyne imunohistochenistry technique, EIHCT)两大类。《一)酶免疫测定 E]A是用酶标记抗原或抗体做标记物，用于检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。EI反应系统中，酶标抗体（抗原）经反应后，可与相应的抗原抗体)形成免疫复合物，通过测量复合物中标记酶催化底物水解呈色的深浅，可以推算待测抗草或抗体含量。根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标物分离，E队一般可分为均相 (homogenous)和异相het0 rogenous)两大英。以标记抗体检测样品中抗原为例。EIA反应原理简示如下（标记抗体过量）： Ag+Ab==AA+Ab* 上式中Ag为待检测抗原，Ag贴为被结合酶标抗体，仙为游离酶标杭体。异相E1A为抗原抗体反应后，需先将A站'与b分离，然后再测定AgA山或站催化底物显色的活性，最后推算样品中A越的含量。它又可分为液相异相IA和因相EIA。戴者反应原理同放射免授分析，试剂抗原（抗体）和待测抗体（抗原）均为液体，免疫反应在液体中透行，最后需用分离剂将游离与结合标记物分离后进行测定。固相EI则先需制备一种国相的试剂抗原（抗体)，再与样品特测抗体（抗原）以及酶标抗原（抗体）反应，经洗涤除去末结合的游离标记物后，即可对结合于因相截体的抗原抗体复合物进行测定

疫测定亦相似。反应在试管中进行，基本上用手工操作。反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反应液呈粉红色，在分光光度计中进行测定。六、酶免疫技术的类型酶免疫技术是利用酶的高效催化和放大作用与特异性抗原-抗体反应相结合而建立的一种标记免疫技术。由于是用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，因此酶免疫技术一般由二部组成：首先是抗原、抗体之间的一次或数次免疫学反应(其中包含有酶标抗原或抗体的参与)形成复合物；然后加入酶作用底物，酶标抗原或抗体中的酶即催化其发生呈色反应，而产物的色泽程度与抗原抗体复合物中酶标记物的酶活性相关，因此可以通过测定酶活性来确定待检抗原或抗体的存在或含量。酶免疫技术按实际用途分为酶免疫测定 (enzymeimmunoassay，EIA)和酶免疫组织化学（Enzyme immunohistochemistry technique， EIHCT）两大类。（一）酶免疫测定 EIA 是用酶标记抗原或抗体做标记物，用于检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。 EIA 反应系统中，酶标抗体(抗原)经反应后，可与相应的抗原(抗体)形成免疫复合物，通过测量复合物中标记酶催化底物水解呈色的深浅，可以推算待测抗原或抗体含量。根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标物分离，EIA 一般可分为均相 (homogenous)和异相(heterogenous)两大类。以标记抗体检测样品中抗原为例，EIA 反应原理简示如下(标记抗体过量)： Ag+Ab-E ===AgAb-E +Ab-E 上式中 Ag 为待检测抗原，AgAb-E 为被结合酶标抗体，Ab-E 为游离酶标抗体。异相 EIA 为抗原抗体反应后，需先将 AgAb-E与 Ab-E 分离，然后再测定 AgAb-E 或 Ab-E 催化底物显色的活性，最后推算样品中 Ag 的含量。它又可分为液相异相 EIA 和固相 EIA。前者反应原理同放射免疫分析，试剂抗原(抗体)和待测抗体(抗原)均为液体，免疫反应在液体中进行，最后需用分离剂将游离与结合标记物分离后进行测定。固相 EIA 则先需制备一种固相的试剂抗原(抗体)，再与样品待测抗体(抗原)以及酶标抗原(抗体)反应，经洗涤除去未结合的游离标记物后，即可对结合于固相载体的抗原抗体复合物进行测定

温州医学院 文本 酶免疫技术_临床免疫学检验第二十章

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