第二十五章细胞因子及其受体检测 主目录： 第二十三章饵胞因子及其受体检测 第一节生物学检测法 第二节免疫学检测法 第三节分子生物学检测法 第四节细胞因子受体检测技术 子目录： 第二十三章细胞因子及其受休检测 第一节生物学检测法 一，细数增殖法 二、靶细胞杀伤或抑制法 三、饵胞病变抑制法 四、趋化活性测定法 五、生物学检测法的评价 第二节免疫学检测 一，双抗体夹心LIS制 二，放射免疫分析 三，酶联免疫疑点实验 四、细胞内细胞因子的检测 五、免疫学检测法的评价 第三节分子生物学拉测 一、细胞因子的N精检测 二，细胞因子kXA表达的测定 三、分子生物学检测法的评价 第四节细胞因子受体检测技术 膜结合受体的测定 二 可溶性受体的测定 1
1 第二十五章 细胞因子及其受体检测 主目录： 第二十三章 细胞因子及其受体检测 第一节 生物学检测法 第二节 免疫学检测法 第三节 分子生物学检测法 第四节 细胞因子受体检测技术 子目录： 第二十三章 细胞因子及其受体检测 第一节 生物学检测法 一、细胞增殖法 二、靶细胞杀伤或抑制法 三、细胞病变抑制法 四、趋化活性测定法 五、生物学检测法的评价 第二节 免疫学检测 一、双抗体夹心 ELISA 二、放射免疫分析 三、酶联免疫斑点实验 四、细胞内细胞因子的检测 五、免疫学检测法的评价 第三节 分子生物学检测 一、细胞因子的 DNA 检测 二、细胞因子 mRNA 表达的测定 三、分子生物学检测法的评价 第四节 细胞因子受体检测技术 一、 膜结合受体的测定 二、 可溶性受体的测定
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正文： 第二十五章细胞因子及其受体检测 细园因子是机体内十分重要得免疫分子，在基础免夜学研究中，为了探时饵胞因子水平 与免疫细胞表型分化、增殖以及功能的相互关系及细胞因子与某些生理病理过程的相互关 系，需要检测细围因子及受体的表达水平。在伤床医学的研究中，当发生某些疾病时，体内 细围因子及受体表达可发生异常，这些异常与机体免疫功能异常或发生病理损伤有美，因此， 检测惠者细胞因子及其受体表达水平有助于对临床某些疾南的诊断、治疗和预后的判断。另 一方面。细因子基因工程产品的月世，促进了重组细围因子的峰床应用。这也要求对惠者 体内相应细数因子水平进行判断。总之，检测细胞因子及其受体具有重要的应用价值。 从检测的水平来说，细胞因子及受体的检测可分为基因水平检测和蛋白水平检测。基因 水平检测色括基因XM的测定和表达水平的测定。蛋白水平测定可分为生物活性测定 和蛋白含量的测定，由于细围因子多以自分泌和旁分泌的方式发挥作用，很少进入到血液循 环。因此对于蛋白水平的检测来说，同部体液中细胞因子的检测较血清或血聚中细胞因子的 测定更具有实际意文。另一方面，由于细胞因子国络的特性，细胞因子之间是相互关联的， 放单鞋检测一种细整因子及其受体并不隆提供更多信息，常雷要多种细围因子的联合检测： NM与及表达水平放在一起易混希 细胞因子具体的测定法有生物学测定法、免疫学测定法和分子生物学测定法。生物学测 定法检测细雕因子的生物话性，其结果以活性单位表示。免疫学测定法检测的是细胞因子蛋 自含量，其结果以g/l或pg/表示。分子生物学测定法用于细胞因子NA和然A表达 水平的测定。 细胞因子受体测定包括膜受体测定和体液中可溶性细胞因子受体的测定，膜受体采用免 夜组化技术测定，可溶性细胞因子受体可采用标记免疫分析技术(EI,RIA等)进行定量 分析. 是否还有免疫荧光？ 第一节生物学检测法 细胞因子生物学检测法是根据某些细胞因子特定的生物学功能设计的，因此该方法是测 定细胞因子生物活性水平的方法。其原理是应用一定的指示系统（如饵胞）与已知活性的细 胞因子标准品成特测标本相互作用。最韩以指示系统的变化（如细胞增殖，死亡成分泌蛋白 4
4 正文： 第二十五章 细胞因子及其受体检测 细胞因子是机体内十分重要得免疫分子。在基础免疫学研究中，为了探讨细胞因子水平 与免疫细胞表型分化、增殖以及功能的相互关系及细胞因子与某些生理病理过程的相互关 系，需要检测细胞因子及受体的表达水平。在临床医学的研究中，当发生某些疾病时，体内 细胞因子及受体表达可发生异常，这些异常与机体免疫功能异常或发生病理损伤有关。因此， 检测患者细胞因子及其受体表达水平有助于对临床某些疾病的诊断、治疗和预后的判断。另 一方面，细胞因子基因工程产品的问世，促进了重组细胞因子的临床应用，这也要求对患者 体内相应细胞因子水平进行判断。总之，检测细胞因子及其受体具有重要的应用价值。 从检测的水平来说，细胞因子及受体的检测可分为基因水平检测和蛋白水平检测。基因 水平检测包括基因 DNA 的测定和 mRNA 表达水平的测定。蛋白水平测定可分为生物活性测定 和蛋白含量的测定。由于细胞因子多以自分泌和旁分泌的方式发挥作用，很少进入到血液循 环。因此对于蛋白水平的检测来说，局部体液中细胞因子的检测较血清或血浆中细胞因子的 测定更具有实际意义。另一方面，由于细胞因子网络的特性，细胞因子之间是相互关联的， 故单独检测一种细胞因子及其受体并不能提供更多信息，常需要多种细胞因子的联合检测。 细胞因子具体的测定法有生物学测定法、免疫学测定法和分子生物学测定法。生物学测 定法检测细胞因子的生物活性，其结果以活性单位表示。免疫学测定法检测的是细胞因子蛋 白含量，其结果以 ng/ml 或 pg/ml 表示。分子生物学测定法用于细胞因子 DNA 和 mRNA 表达 水平的测定。 细胞因子受体测定包括膜受体测定和体液中可溶性细胞因子受体的测定。膜受体采用免 疫组化技术测定，可溶性细胞因子受体可采用标记免疫分析技术（EIA、RIA 等）进行定量 分析。 第一节 生物学检测法 细胞因子生物学检测法是根据某些细胞因子特定的生物学功能设计的，因此该方法是测 定细胞因子生物活性水平的方法。其原理是应用一定的指示系统（如细胞）与已知活性的细 胞因子标准品或待测标本相互作用，最终以指示系统的变化（如细胞增殖、死亡或分泌蛋白 DNA 与 RNA 及表达水平放在一起易混淆 是否还有免疫荧光？
等)来显不细胞因子的功能，将待检标本与标准品进行比较最终得知特检标本的细胞因子水 平。 根据指示系统的表现不同，生物学检测的方法可分为细胞增殖法，配细胞杀伤或抑制法、 细胞病变抑制法、集落形成测定法、趋化作用测定法和诱导产物测定法等。本节将介绍常用 的检测方法。 一、细胞增殖法 细胞增殖法是最常用的细型因子生物学活性测定方法，可用于儿，-2、L,-6等多种白细 胞介素的测定。 月原理 细胞增殖法的基本源理是利用某一细胞因子可促进相应指示细胞分裂，增殖的特性建立 的。将不同浓度的细幽因子（标准品或特测样品》与番示细幽共同料育一定的时间，检测细 胞的增殖情况细胞的增箱情况与细胞因子的话性成正比。待测样品中细胞因子的话性通过 与标准品的活性比较而获得。如L,-2能够促述侧粮细胞的增殖，将特检几，-2或几-2标准 品与胸腺细敷共同料有，最后通过检测细败增殖情况可反肤标本中儿-2的活性单位。 口指示细胞 细胞增殖法所用的饵胞株可直接从组织中分离，也可是体外传代的依赖细胞株，如检测 白细胞介素2时，可以使用外周血分离的淋巴细胞（需经丝裂原活化）、小鼠胸粮细胞、活 化的小鼠聊细胞等，这些从组织中分离的细胞米尊方便，且不需长期在体外传代培养，但由 于它们具有多种细胞因子的受体，能够接受多种细胞因子的刺激，使它们发生增殖（如且-2、 几一4均作用于胸服细图使其增殖)，这种重叠作用导致检测结果的特异性受到影响， 为获得较好的特异性，细型增殖法的指示细胞。常使用依赖饵园株（系）。饵胞因子依 赖细整株是指人们为检测某一种细胞因子而筛选的。该细鞋株的分爱增殖只依规于某一种细 胞因子的存在，并在一定浓度崔围内与细胞增殖程度呈正相美。若培养基中缺乏这种细胞因 子，依赖株则不能存活。检测细围因子时，使用依规细園株可很大程度上提高生物学检测的 特异性。因此人们己经建立了多种细围因子的依赖细鞋株，常用的见表22-1。 表22-！细胞增殖法所用细胞因子依赖株简介 细胞因子类 指示细胞 可干扰因素 型 5
5 等）来显示细胞因子的功能，将待检标本与标准品进行比较最终得知待检标本的细胞因子水 平。 根据指示系统的表现不同，生物学检测的方法可分为细胞增殖法、靶细胞杀伤或抑制法、 细胞病变抑制法、集落形成测定法、趋化作用测定法和诱导产物测定法等。本节将介绍常用 的检测方法。 一、细胞增殖法 细胞增殖法是最常用的细胞因子生物学活性测定方法，可用于 IL-2、IL-6 等多种白细 胞介素的测定。 ㈠ 原理 细胞增殖法的基本原理是利用某一细胞因子可促进相应指示细胞分裂、增殖的特性建立 的。将不同浓度的细胞因子（标准品或待测样品）与指示细胞共同孵育一定的时间，检测细 胞的增殖情况,细胞的增殖情况与细胞因子的活性成正比。待测样品中细胞因子的活性通过 与标准品的活性比较而获得。如 IL-2 能够促进胸腺细胞的增殖，将待检 IL-2 或 IL-2 标准 品与胸腺细胞共同孵育，最后通过检测细胞增殖情况可反映标本中 IL-2 的活性单位。 ㈡ 指示细胞 细胞增殖法所用的细胞株可直接从组织中分离，也可是体外传代的依赖细胞株，如检测 白细胞介素 2 时，可以使用外周血分离的淋巴细胞（需经丝裂原活化）、小鼠胸腺细胞、活 化的小鼠脾细胞等。这些从组织中分离的细胞来源方便，且不需长期在体外传代培养，但由 于它们具有多种细胞因子的受体，能够接受多种细胞因子的刺激，使它们发生增殖（如 IL-2、 IL-4 均作用于胸腺细胞使其增殖），这种重叠作用导致检测结果的特异性受到影响。 为获得较好的特异性，细胞增殖法的指示细胞，常使用依赖细胞株（系）。细胞因子依 赖细胞株是指人们为检测某一种细胞因子而筛选的。该细胞株的分裂增殖只依赖于某一种细 胞因子的存在，并在一定浓度范围内与细胞增殖程度呈正相关。若培养基中缺乏这种细胞因 子，依赖株则不能存活。检测细胞因子时，使用依赖细胞株可很大程度上提高生物学检测的 特异性，因此人们已经建立了多种细胞因子的依赖细胞株，常用的见表 22-1。 表 22-1 细胞增殖法所用细胞因子依赖株简介 细胞因子类 型 指示细胞 可干扰因素
l-1 1QG4,1(小鼠T细幽) L-2,L-4,L-7等 L一4（小限胸腺箱） 小鼠1-4 L-2 CT山（小鼠杀伤性T细胞系） 小鼠L-4,1L-15 1-3 G1(简样白血病细胞) TF-!(红白血病细胞) 人P0,l.-4,L-5,1-6 等 1L-6 明（小鼠杂交袍细胞） 人L-11,L-13等 TTD1(小鼠条交缩细胞》 1l.-11 1-7 IXN/2b l-9 W7e IL-3.GM-CSF 依赖细胞株一般为杂交宿饵胞。体外长期培养过程中，细园对细园因子的依赖程度会发 生改变。基至有些细胞将表失依载性，因此，细因子依规细围株在传代培界过程中，应注 意培养基中细胞因子的浓度（不能过高或过低）。如丧失依规性，应及早进行克隆化，箭选 依赖性能好的克摩进行传代。 白技术要点 利用细数增雅法测定细胞因子的实验过程基本相同，不同的是不同细嫩因子所用的依赖 细围株不阿，细围浓度和细败因子与相应细的料有时间也可能有所差异。基本过程如下： 1。依赖细围株的准答提前10天左右复苏依赖细胞株，用含有一定浓度的相应细胞 因子的培养基进行传代培养至对数生长期。收集对数生长期依籁细胞，离心1500四 10■：弃上清，用不含有相应细鞋因子的完全培养基将细围调整至一定的浓度，置细围培 养箱中期有一段时何（的30分钟），其目的是使结合在胞跟细胞因子受体上的细胞因子解 离。再将细胞离心洗涤一次，并用不含细胞因子的培养基将细胞调整至一定浓度即可。 2,细胞因子作用于依赖细鞋株取96孔细型培养板进行标记。然后加入不同稀释度 的细散因子标准品和特测样本，10/孔。另加入一组空白对照（不含细散因子的培养基）， 再加入一定浓度的依赖细胞悬液10@1/孔，置振荡器上充分混匀，置细胞培养箱中培养一 定的时间，培养时同一般为48小时左右，此时，空白对m烟因不合细图因子，细胞死亡： 标准品孔细数的增殖程度显示良好的梯度关系。 6
6 IL-1 D10.G4.1（小鼠 T 细胞） EL-4（小鼠胸腺瘤） IL-2， IL-4，IL-7 等 小鼠 IL-4 IL-2 CTLL（小鼠杀伤性 T 细胞系） 小鼠 IL-4，IL-15 IL-3 KG1（髓样白血病细胞） TF-1（红白血病细胞） 人 EPO，IL-4，IL-5，IL-6 等 IL-6 B9（小鼠杂交瘤细胞） 7TD1（小鼠杂交瘤细胞） 人 IL-11，IL-13 等 IL-11 IL-7 IXN/2b IL-9 MO7e IL-3，GM-CSF 依赖细胞株一般为杂交瘤细胞。体外长期培养过程中，细胞对细胞因子的依赖程度会发 生改变，甚至有些细胞将丧失依赖性。因此，细胞因子依赖细胞株在传代培养过程中，应注 意培养基中细胞因子的浓度（不能过高或过低）。如丧失依赖性，应及早进行克隆化，筛选 依赖性能好的克隆进行传代。 ㈢ 技术要点 利用细胞增殖法测定细胞因子的实验过程基本相同，不同的是不同细胞因子所用的依赖 细胞株不同，细胞浓度和细胞因子与相应细胞的孵育时间也可能有所差异。基本过程如下： 1． 依赖细胞株的准备 提前 10 天左右复苏依赖细胞株，用含有一定浓度的相应细胞 因子的培养基进行传代培养至对数生长期。收集对数生长期依赖细胞，离心 1500rpm 10min，弃上清，用不含有相应细胞因子的完全培养基将细胞调整至一定的浓度，置细胞培 养箱中孵育一段时间（约 30 分钟），其目的是使结合在细胞膜细胞因子受体上的细胞因子解 离。再将细胞离心洗涤一次，并用不含细胞因子的培养基将细胞调整至一定浓度即可。 2． 细胞因子作用于依赖细胞株 取 96 孔细胞培养板进行标记，然后加入不同稀释度 的细胞因子标准品和待测样本，100µl/孔。另加入一组空白对照（不含细胞因子的培养基）， 再加入一定浓度的依赖细胞悬液 100µl/孔，置振荡器上充分混匀，置细胞培养箱中培养一 定的时间，培养时间一般为 48 小时左右。此时，空白对照组因不含细胞因子，细胞死亡； 标准品孔细胞的增殖程度显示良好的梯度关系
3,测定细围增殖程度细胞的增殖程度可直接进行计数，但此方法繁喷。不利于大量 标本检测，因此常用间接法检测细胞增殖程度。最常用的方法有Ⅱ标记的胸腺嘧晚核背 (HTR)浅入法，TT比色法，这些方法将在下文详细介知。 4,饵胞因子活性单位的计算细胞因子的生物活性单位的确定是指使相应饵胞达到 最大程度增殖的50%时所需细胞因子的含量为一个活性单位。因此计算结果时分别以增殖 程度为纵坐标，细胞因子活性单位（成稀释度）为横坐标绘图，分别钱出标准品和特测样品 达到50%最大增殖程度的稀释度。再通过下面公式计算： 5. 待测样品50%最大程度增殖的稀释度 细園因子话性《/l》= ×标准品的细围因子活性单 位 标准品50%最大程度增殖的稀释度 注：绘图方法 方法】以且-2待测样品和标准品的稀释度为横轴，以检测细胞们R佛入值(CW) 为纵轴作图，求出I1.-2标准品的最高CPW的50%值。通过该点分别作平行于横轴和城轴的 两条平行线。与横轴交点是L-2标准品得到50，最高CW的稀释度，通过该点的横轴平行 线与几，-2待测样品促选检测细胞增殖的曲线相交，通过此交点作银怕平行线，与横轴的交 点为待测儿-2样品的0俏最高的稀释度，然后通过公式计算。 方法2将各样品的CPW与L-2标准品最高QM相比求得百分比，以百分比为航物， 以样品稀释度例数的对数(Lg2)为横轴。在对量坐标纸上作图。分别求标准品和特测样品 50件最高GW的稀释度的倒数，二者的倒数之比乘以L-2标准品的活性单位即得特测样品 1L-2的活性单位. 网细胞增殖程度的检测 1.盯R携入法本法是通过检测的合成来指示细胞增植，在细胞增殖过程中， WA合成增加，此时若在培养液中如H标记的胸腺嘧啶核普(Td成)，"盯d很被利用从而携 入新合成的NA中，新增殖的细胞也必然带有放射性标记，因面，通过检测细胞沉淀中的政 射话性即每分钟脉冲数(C陶ter per阳te,Cpm》可间接测定细融增殖程度。细胞增殖周 期一般为~6小时，因此需在培养结束前~一6小时加入HT服。终止培养后，用细胞收集 舞收集各孔细胞，B-液体闪炼仪测定c 与细题增殖的关系说 7
7 3． 测定细胞增殖程度 细胞的增殖程度可直接进行计数，但此方法繁琐，不利于大量 标本检测，因此常用间接法检测细胞增殖程度。最常用的方法有 3 H 标记的胸腺嘧啶核苷 （3 HTdR）掺入法，MTT 比色法，这些方法将在下文详细介绍。 4． 细胞因子活性单位的计算 细胞因子的生物活性单位的确定是指使相应细胞达到 最大程度增殖的 50％时所需细胞因子的含量为一个活性单位。因此计算结果时分别以增殖 程度为纵坐标，细胞因子活性单位（或稀释度）为横坐标绘图，分别找出标准品和待测样品 达到 50％最大增殖程度的稀释度，再通过下面公式计算： 5． 待测样品 50％最大程度增殖的稀释度 细胞因子活性（U/ml）＝ ×标准品的细胞因子活性单 位 标准品 50％最大程度增殖的稀释度 注：绘图方法 方法 1 以 IL-2 待测样品和标准品的稀释度为横轴，以检测细胞 3 HTdR 掺入值（CPM） 为纵轴作图，求出 IL-2 标准品的最高 CPM 的 50%值。通过该点分别作平行于横轴和纵轴的 两条平行线。与横轴交点是 IL-2 标准品得到 50%最高 CPM 的稀释度，通过该点的横轴平行 线与 IL-2 待测样品促进检测细胞增殖的曲线相交，通过此交点作纵轴平行线，与横轴的交 点为待测 IL-2 样品的 50%最高 CPM 的稀释度，然后通过公式计算。 方法 2 将各样品的 CPM 与 IL-2 标准品最高 CPM 相比求得百分比，以百分比为纵轴， 以样品稀释度倒数的对数（Log2）为横轴。在对数坐标纸上作图，分别求标准品和待测样品 50%最高 CPM 的稀释度的倒数，二者的倒数之比乘以 IL-2 标准品的活性单位即得待测样品 IL-2 的活性单位。 ㈣ 细胞增殖程度的检测 1． 3 HTdR 掺入法 本法是通过检测 DNA 的合成来指示细胞增值，在细胞增殖过程中， DNA 合成增加，此时若在培养液中加 3 H 标记的胸腺嘧啶核苷（3 HTdR），3 HTdR 被利用从而掺 入新合成的 DNA 中，新增殖的细胞也必然带有放射性标记。因而，通过检测细胞沉淀中的放 射活性即每分钟脉冲数（couter per minute，cpm）可间接测定细胞增殖程度。细胞增殖周 期一般为 4～6 小时，因此需在培养结束前 4～6 小时加入 3 HTdR。终止培养后，用细胞收集 器收集各孔细胞，β-液体闪烁仪测定 cpm。 与细胞增殖的关系说 明
2.TT比色法：TT比色法是一种以细胞的代谢物作为细胞增殖指示物的检测方法。 T在活锥胞内被线校体中的玻珀酸酸氯酶氧化，被还原形成紫色结品产物一甲膜(，产物 量与细饱增殖程皮成正比，紫色结品产物可被二甲基亚飘或酸化的异丙醇所溶解面显色。用 酶标仪测定溶液的吸光度值，测定波长为570m,参考被长为630m■。溶液的吸光度植与细 胞增殖程度在一定范围内景线性关系。 厅比色法应注意以下几点：①TT垂于溶解，使用前应进行过滤，去除未溶解的颜校， ②一般于培养结束前4~6小时加入TT,锋浓度Q.5/a1,@用酸化异内醇作为溶剂溶解 T还源产物时，盐酸易使培养基中的蛋白变性，形成连度，影响测定结果。因此加入T 时应去掉培养基中的血清（可采用离心洗涤的方法），用50作为溶剂时，不会发生此种现 象。④T比色法在一定的细胞浓度范围内可反应细胞增殖程度，因此测定前应滴定好细胞 浓度，选择最住细数浓度，并且不同细围所用的浓度可能不同。 二、无细胞杀伤或抑制法 本方法主要用于肿瘤坏死因子的测定。 日原理 种瘤坏死因子(TF-▣和TNF-B)具有杀伤肿瘤细胞的作用，校测TF活性时采用粑 细胞杀物法。无细胞杀伤法与细胞增殖法类似，具是细胞因子作用结果相反。配细胞杀伤法 是透择对F敏感的细胞系(TF傲感株)作为花细胞，使其与不问稀释皮的标准品或特测 样品共同培养一定时间，检测饵胞毒性反应的程度。 白TF敏感株 F可杀伤多种肿瘤细围系，但最常用的配细胞为小鼠咸纤推细融株2四和 64.13,二者均为贴壁细图，其中1929贴壁能力最强，传代时需用陕蛋白酶清化。着 标本中同时含有F-a和TNF-B,二者均逢使指示细围溶解死亡。若要区分TF-@和TNF- 目，香用特异性中和抗体预处理样品再进行测定。 问技术要点 1,孔细的准备实验黄10天左右复苏视细胞，用完全培养基进行传代，培养至对数 生长期。用胰蛋白酶消化收集细胞，经肠ks'液洗涤一次，再用完全培养基将细胞配制成 所需的浓度。用胰蛋白解消化细胞时应注意消化程度，程度过浅，细胞未完全脱离培养瓶 (板)，会损失大量细围程度过深。会对细围造成损伤形响测定结果。 2际作用于粑细散将耗细围与F的标准品或待测样品混合，置细《培养箱中培 养，具体操作同细胞增箱法。呼测定时仍需设置阴性对组组，本组只加入配细胞和培养基。 8
8 2． MTT 比色法：MTT 比色法是一种以细胞的代谢物作为细胞增殖指示物的检测方法。 MTT 在活细胞内被线粒体中的琥珀酸脱氢酶氧化，被还原形成紫色结晶产物－甲臜（，产物 量与细胞增殖程度成正比。紫色结晶产物可被二甲基亚砜或酸化的异丙醇所溶解而显色。用 酶标仪测定溶液的吸光度值，测定波长为 570nm，参考波长为 630nm，溶液的吸光度值与细 胞增殖程度在一定范围内呈线性关系。 MTT 比色法应注意以下几点：①MTT 难于溶解，使用前应进行过滤，去除未溶解的颗粒。 ②一般于培养结束前 4～6 小时加入 MTT，终浓度 0.5mg/ml。③用酸化异丙醇作为溶剂溶解 MTT 还原产物时，盐酸易使培养基中的蛋白变性，形成浊度，影响测定结果。因此加入 MTT 时应去掉培养基中的血清（可采用离心洗涤的方法），用 DMSO 作为溶剂时，不会发生此种现 象。④MTT 比色法在一定的细胞浓度范围内可反应细胞增殖程度，因此测定前应滴定好细胞 浓度，选择最佳细胞浓度，并且不同细胞所用的浓度可能不同。 二、靶细胞杀伤或抑制法 本方法主要用于肿瘤坏死因子的测定。 ㈠ 原理 肿瘤坏死因子（TNF-α和 TNF-β）具有杀伤肿瘤细胞的作用，检测 TNF 活性时采用靶 细胞杀伤法。靶细胞杀伤法与细胞增殖法类似，只是细胞因子作用结果相反。靶细胞杀伤法 是选择对 TNF 敏感的细胞系（TNF 敏感株）作为靶细胞，使其与不同稀释度的标准品或待测 样品共同培养一定时间，检测细胞毒性反应的程度。 ㈡ TNF 敏感株 TNF 可杀伤多种肿瘤细胞系，但最常用的靶细胞为小鼠成纤维细胞株 L929 和 WEHI164.13，二者均为贴壁细胞，其中 L929 贴壁能力最强，传代时需用胰蛋白酶消化。若 标本中同时含有 TNF-α和 TNF-β，二者均能使指示细胞溶解死亡。若要区分 TNF-α和 TNF- β，需用特异性中和抗体预处理样品再进行测定。 ㈢ 技术要点 1. 靶细胞的准备 实验前 10 天左右复苏靶细胞，用完全培养基进行传代、培养至对数 生长期，用胰蛋白酶消化收集细胞，经 Hanks’液洗涤一次，再用完全培养基将细胞配制成 所需的浓度。用胰蛋白酶消化细胞时应注意消化程度，程度过浅，细胞未完全脱离培养瓶 （板），会损失大量细胞；程度过深，会对细胞造成损伤影响测定结果。 2. TNF 作用于靶细胞 将靶细胞与 TNF 的标准品或待测样品混合，置细胞培养箱中培 养，具体操作同细胞增殖法。TNF 测定时仍需设置阴性对照组，本组只加入靶细胞和培养基
怎细败毒反应程度测定细胞毒反应程度既可直接检测细围的死亡情况也可以通过检 测剩会活细胞的数量间接推测细胞死亡的情况，前者可采用“C·释放法，后者包括T携 入法、T比色法、结品新染色法。这里只简单介绍结品紫染色法。 结晶紫染色法的原理是结品紫能使活细胞染色而死细胞不着色，着色的活细髓再经脱色 液将染料脱出。通过测定其光密度（值）米反应细胞存活状态进而阿接推知饵胞毒反应 的程度。具体操作是在培养结束时将培养板离心(1500r得，101)，弃上清，每孔加入Q25% 结品紫100#1，室温染色10ain。再离心、弃上清、用PS洗一次，加入100μ1/孔柠檬酸 钠缓冲液脱色。于570m面下测定其面值。 4.NF活性计算在坐标纸上作图，以细幽死亡百分率为纵坐标，以F标准品浓度 为横坐标，绘制标准曲线。根据导致50%细胞死亡样品对应的稀释度按下式计算F的活 性单位： 导致0%纸整死亡的样品最大稀屏度 TNF活性单位(/a1)= X雅品TNF话性单位(/) 导致50%细胞死亡的TF的标准品最大稀释度 此外F的活性单位也可通过F的相对杀伤话性来表示，即TNF所导致死亡的彩细胞 数量占对照组（未加入F)的百分比， 实验组细胞死亡数量 材组组的00值一实的组的D值 F柔伤活性= ×100% 对属组细胞数量 对無组的0D值 注：按上运公式计算时应注意，不同的细胞毒活性检测法，其D值所代表的含义不同 (是代表死亡细胞还是代表活细胞)，计算公式不同，上而证杀伤活性公式应用于结品繁 染色法。TT比色法、打R找入法 网说明 1.L92四和i164.13两种细胞株检测TF活性时，其傲感度不同.i16L13较 L929敏感。测定时所用的细型数量也不相同。 2.在TF与彩细胞相互作用过程中，未被杀伤的细围可雅线增殖，影响实验结果。因 此，可于实验系统中如入放线菌素D。成线菌素D呵种制的合成、细胞的增殖，从而提 高检测的敏感度，放线菌素D加入量10u1/孔，浓度为0.5~1#g/ml, 三、细胞病变莉制法
9 3. 细胞毒反应程度测定 细胞毒反应程度既可直接检测细胞的死亡情况也可以通过检 测剩余活细胞的数量间接推测细胞死亡的情况，前者可采用 51Cr 释放法，后者包括 3 HTdR 掺 入法、MTT 比色法、结晶紫染色法。这里只简单介绍结晶紫染色法。 结晶紫染色法的原理是结晶紫能使活细胞染色而死细胞不着色，着色的活细胞再经脱色 液将染料脱出，通过测定其光密度（OD 值）来反应细胞存活状态进而间接推知细胞毒反应 的程度。具体操作是在培养结束时将培养板离心（1500rpm，10min），弃上清，每孔加入 0.25％ 结晶紫 100μl，室温染色 10min。再离心、弃上清、用 PBS 洗一次，加入 100μl/孔柠檬酸 钠缓冲液脱色，于 570nm 下测定其 OD 值。 4. TNF 活性计算 在坐标纸上作图，以细胞死亡百分率为纵坐标，以 TNF 标准品浓度 为横坐标，绘制标准曲线。根据导致 50％细胞死亡样品对应的稀释度按下式计算 TNF 的活 性单位： 导致 50％细胞死亡的样品最大稀释度 TNF 活性单位（U/ml）＝ ×标准品 TNF 活性单位（U/ml） 导致 50％细胞死亡的 TNF 的标准品最大稀释度 此外 TNF 的活性单位也可通过 TNF 的相对杀伤活性来表示，即 TNF 所导致死亡的靶细胞 数量占对照组（未加入 TNF）的百分比。 实验组细胞死亡数量 对照组的 OD 值－实验组的 OD 值 TNF 杀伤活性＝ ＝ ×100％ 对照组细胞数量 对照组的 OD 值 注：按上述公式计算时应注意，不同的细胞毒活性检测法，其 OD 值所代表的含义不同 （是代表死亡细胞还是代表活细胞），计算公式不同，上面 TNF 杀伤活性公式应用于结晶紫 染色法，MTT 比色法、3 HTdR 掺入法。 ㈣ 说明 1． L929 和 WeHi164.13 两种细胞株检测 TNF 活性时，其敏感度不同。WeHi164.13 较 L929 敏感。测定时所用的细胞数量也不相同。 2． 在 TNF 与靶细胞相互作用过程中，未被杀伤的细胞可继续增殖，影响实验结果。因 此，可于实验系统中加入放线菌素 D。放线菌素 D 可抑制 DNA 的合成、细胞的增殖，从而提 高检测的敏感度。放线菌素 D 加入量 10μl/孔，浓度为 0.5～1μg/ml。 三、细胞病变抑制法
本方法主要是为检测干扰素而设计的， ()原理 干扰素(FX)可透导细胞产生邦制病毒N和NA合成的酶，保护宿主细围不受病毒 感染从而抑制细图病变。根据1W这一功能，我们将指示细胞。病毒和干扰素标准品或特测 样品置同一反应体系中，培养一段时间后，检测细胞的病变程度，细胞的病变程度与干扰素 的活性成反比关系。 口指示细胞和病毒 用于检测IFX的细胞株有ish(羊膜上皮细胞)，Hp2(喉辘的上皮细胞)、L929(小 鼠成纤雀细胞)，其中1动和和p2细型株常用于人干扰素测定，1929细胞株多用于检测 小鼠干找素。上述细散株均为贴摩细胞，用一般培养基进行培养即可。用于攻击细胞的病毒 有水泡性口炎病毒(VSY)、服籁心肌炎剩毒(EY)以及Sindbis Virus等病毒。常用的是 VSY(vesicular stomtitis virus)。VSY使用前应进行滴定，测定其效价，病毒的效价是 指使猫主细数发生完全病变的最大稀释度。正式试验时选择半数致死量作为SY的工作浓 度。 白技术要点 1. 细園的复苏和5V的准备选驿合适细腹株复苏后传代至树题生长期并收集细 胞，经计数后将细胞调整到一定浓度备用。根据使用前测定VSY的效价，将其稀释到工作浓 度。 2.首先，将细围悬液接种于96孔细粒培养版中，100m/孔，再加入不同稀释度的【 标准品或特测样品。分别设细胞对题(1001细胞和1001培养基)，病毒对黑(1001细胞 和100加】病毒》。将其置于细腹培养箱中培界24一488，离心弃掉暗养液，各孔加入一定 浓度的V5T(细胞对照孔除外)，雅续培养21一8h5, 3,细型病麦程度的观察特病毒对照组细胞全部或5%以上出现明显病变时即可在 创置显微镜下观察结果，也可用结品紫将细胞染色或加入TT显色，测定细胞的死亡程度。 创置显微镜下观察细胞病变分为5个等级，见表2行2. 10
10 本方法主要是为检测干扰素而设计的。 ㈠ 原理 干扰素（IFN）可诱导细胞产生抑制病毒 RNA 和 DNA 合成的酶，保护宿主细胞不受病毒 感染从而抑制细胞病变。根据 IFN 这一功能，我们将指示细胞，病毒和干扰素标准品或待测 样品置同一反应体系中，培养一段时间后，检测细胞的病变程度，细胞的病变程度与干扰素 的活性成反比关系。 ㈡ 指示细胞和病毒 用于检测 IFN 的细胞株有 Wish（羊膜上皮细胞），Hep-2(喉癌的上皮细胞)、L929（小 鼠成纤维细胞）。其中 Wish 和 Hep-2 细胞株常用于人干扰素测定。L929 细胞株多用于检测 小鼠干扰素。上述细胞株均为贴壁细胞，用一般培养基进行培养即可。用于攻击细胞的病毒 有水疱性口炎病毒（VSV）、鼠脑心肌炎病毒（EMCV）以及 Sindbis Virus 等病毒。常用的是 VSV（vesicular stomatitis virus）。VSV 使用前应进行滴定，测定其效价。病毒的效价是 指使宿主细胞发生完全病变的最大稀释度。正式试验时选择半数致死量作为 VSV 的工作浓 度。 ㈢ 技术要点 1． 细胞的复苏和 VSV 的准备 选择合适细胞株复苏后传代至对数生长期并收集细 胞，经计数后将细胞调整到一定浓度备用。根据使用前测定 VSV 的效价，将其稀释到工作浓 度。 2． 首先，将细胞悬液接种于 96 孔细胞培养板中，100µl/孔，再加入不同稀释度的 IFN 标准品或待测样品。分别设细胞对照（100µl 细胞和 100µl 培养基），病毒对照（100µl 细胞 和 100µl 病毒）。将其置于细胞培养箱中培养 24～48hrs，离心弃掉培养液，各孔加入一定 浓度的 VSV（细胞对照孔除外），继续培养 24～48hrs。 3． 细胞病变程度的观察 待病毒对照组细胞全部或 75％以上出现明显病变时即可在 倒置显微镜下观察结果，也可用结晶紫将细胞染色或加入 MTT 显色，测定细胞的死亡程度。 倒置显微镜下观察细胞病变分为 5 个等级，见表 26-2