第二十四章细胞粘附分子检测 Chapter 24 Detection of cellular Adhesion Molecule 第一节细型表面粘附分子的测定(detections of Adhesion Molecule on cellular surface） 一，酶免夜饵胞组织化孕法 二，荧光免疫胞组织化学法 三、酶免夜测定法 四、时间分辨茨光免疫测定法 五，流式细围术法 第二节可溶性粘用分子的测定(detections of soluble Adhesion Molecule》 一、酶联免疫吸附法 二，其它免疫测定法 第三节细胞粘附分子基因及其表达的检测(detections of gene and its expression for adhesioa molecule 一，细胞粘阳分子基因的多老性测定 二，细雕粘用分子基因表达的测定 第四节细胞粘附分子测定的临宋应用(Detection of cellular Adhesion Molecule for clinfcal applications 一、疾病发生发展机制的探讨 二，疾病的临床诊断及预后指标 学习要点： ·细胞表雨精附分子的测定方法及原理 ·可溶性粘用分子的测定方法及原理 ·细胞黏附分子基因及其表达测定方法 粘附分子(adhesion molecule,AW)是介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质何粘用 作用的糖蛋白，常以细胞膜表而表达和可溶性两种形式存在。其种类法繁多，包括钙离子儒 赖性家族（简称钙粘素，cadherin》,免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily
第二十四章 细胞粘附分子检测 Chapter 24 Detection of cellular Adhesion Molecule 第一节 细胞表面粘附分子的测定( detections of Adhesion Molecule on cellular surface ) 一、酶免疫细胞组织化学法 二、荧光免疫细胞组织化学法 三、酶免疫测定法 四、时间分辨荧光免疫测定法 五、流式细胞术法 第二节 可溶性粘附分子的测定 ( detections of soluble Adhesion Molecule ) 一、酶联免疫吸附法 二、其它免疫测定法 第三节 细胞粘附分子基因及其表达的检测 ( detections of gene and its expression for adhesion molecule ) 一、细胞粘附分子基因的多态性测定 二、细胞粘附分子基因表达的测定 第四节 细胞粘附分子测定的临床应用（Detection of cellular Adhesion Molecule for clinical applications ） 一、疾病发生发展机制的探讨 二、疾病的临床诊断及预后指标 学习要点： ·细胞表面粘附分子的测定方法及原理 ·可溶性粘附分子的测定方法及原理 ·细胞粘附分子基因及其表达测定方法 粘附分子(adhesion molecule， AM )是介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间粘附 作用的糖蛋白，常以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。其种类法繁多，包括钙离子依 赖性家族 ( 简称钙粘素，cadherin)、免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily
Ig5F)、整合素家疾(integrin fanily)、选择素家族(selectin fanily)、粘蛋自样家族 (cinlike far■ily)和尚未白类的C36、CD4H和CD45等。粘雨分子在胚胎发有和分化，正 常组凯结构的雀持、炎症与免疫应答、伤口修复、凝血及肿宿浸润和转移等多种病理生理过 程中起着着重要作用 正常情况下，血幅环中可溶性桔附分子的含量很低。但某些病理（如炎症）情况下，由 于机体免疫应答产生了多件细胞因子，加上内毒素、凝血解等的参与，可促使细胞膜表面表 达的粘附分子数量增加，其中一部分经酶解脱落释放入血液或局忽组织液中，使血液或局部 分洛液中可溶性精附分子浓度增高。另外，细围内粘附分子A有不同的臂接方式，：译 后的产物各异，其中一部分是无跨膜区和胞质区的小分子量粘附分子，这一类型的粘用分子 可直接进入血液或其他体液而成为可溶性黏附分子。粘附分子的主要功能是调节细胞与饵 胞、细胞与间质之间的相互作用。在病理情况下，由于粘附分子在细胞表面成血液循环中的 数量和（或）质量有所改变，进而影响机体原有细胞与细胞、细胞与细胞间质之间的平衡。 因此，细园内粗（或》细园外粘附分子的测定，对于某些疾病的发生和发展机制的探讨、辅 助诊新、治疗监测及预后方面有重要的应用价值。 根暴细胞粘用分子存在形式的不同，可选择不同的的测定方法。细围粮表面粘附分子的 测定可采用酶免疫组织化学染色法、荧光免疫法、流式细胞仪测定法、时间分辨荧光免疫测 定法和酶免疫测定法等：体液中可溶性粘附分子的测定则主要录用酶联免疫吸用测定 (ISA)法：细胞内黏附分子的基因及药因表达(A)测定可采用原位CR,单位T-CR, CR和T-PCR等方法进行检测， 用于粘附分子测定的标本可为活检组织切片，细胞及组织细图提取物，直液或其也体液 够。 第一节细園表面粘附分子的测定 一、酶免疫细胞组凯化学法 酶免疫细胞组织化学方法是最常用的组织细照表面附分子的测定方法，其基本测定原 理是，将衡标记的抗特定粘附分子抗体与预处理的组织韧片标本共温浴一老时间（如组织细 胞表面存在相应的粘附分子，则刚标抗体即可与其结合)：然后加入酶成物显色，显微镜下 观察结果。本法也可进行改良，即在测定中引人二抗和生物素一亲和素系统，以提高测定的 灵敏度。基本的测定操作步骤为。首先将甲征胃定的石蜡但埋组织标本切片，用二甲紫去蜡 解乙醇眼水后，再用03汽溶于甲醇的过氧化氯封团内源性的过氧化物酶：西洗涤后，用 小牛血清封闭非特异结合位点：然后加入特异的抗粘用分子抗体：反应后洗涤，再加入生物
IgSF)、整合素家族 ( integrin family )、选择素家族(selectin family)、粘蛋白样家族 (mucinlike family)和尚未归类的 CD36、CD44 和 CD45 等。粘附分子在胚胎发育和分化、正 常组织结构的维持、炎症与免疫应答、伤口修复、凝血及肿瘤浸润和转移等多种病理生理过 程中起着着重要作用。 正常情况下，血循环中可溶性粘附分子的含量很低，但某些病理（如炎症）情况下，由 于机体免疫应答产生了多种细胞因子，加上内毒素、凝血酶等的参与，可促使细胞膜表面表 达的粘附分子数量增加，其中一部分经酶解脱落释放入血液或局部组织液中，使血液或局部 分泌液中可溶性粘附分子浓度增高。另外，细胞内粘附分子 mRNA 有不同的剪接方式，翻译 后的产物各异，其中一部分是无跨膜区和胞质区的小分子量粘附分子，这一类型的粘附分子 可直接进入血液或其他体液而成为可溶性粘附分子。粘附分子的主要功能是调节细胞与细 胞、细胞与间质之间的相互作用。在病理情况下，由于粘附分子在细胞表面或血液循环中的 数量和 （或） 质量有所改变，进而影响机体原有细胞与细胞、细胞与细胞间质之间的平衡。 因此，细胞内和( 或 )细胞外粘附分子的测定，对于某些疾病的发生和发展机制的探讨、辅 助诊断、治疗监测及预后方面有重要的应用价值。 根据细胞粘附分子存在形式的不同，可选择不同的的测定方法。细胞膜表面粘附分子的 测定可采用酶免疫组织化学染色法、荧光免疫法、流式细胞仪测定法、时间分辨荧光免疫测 定法和酶免疫测定法等；体液中可溶性粘附分子的测定则主要采用酶联免疫吸附测定 （ELISA）法；细胞内粘附分子的基因及基因表达(mRNA)测定可采用原位 PCR、原位 RT-PCR、 PCR 和 RT-PCR 等方法进行检测。 用于粘附分子测定的标本可为活检组织切片、细胞及组织细胞提取物、血液或其他体液 等。 第一节 细胞表面粘附分子的测定 一、酶免疫细胞组织化学法 酶免疫细胞组织化学方法是最常用的组织细胞表面粘附分子的测定方法，其基本测定原 理是，将酶标记的抗特定粘附分子抗体与预处理的组织切片标本共温浴一定时间（如组织细 胞表面存在相应的粘附分子，则酶标抗体即可与其结合）；然后加入酶底物显色，显微镜下 观察结果。本法也可进行改良，即在测定中引人二抗和生物素-亲和素系统，以提高测定的 灵敏度，基本的测定操作步骤为，首先将甲醛固定的石蜡包埋组织标本切片，用二甲苯去蜡、 99%乙醇脱水后，再用 0.3%溶于甲醇的过氧化氢封闭内源性的过氧化物酶；PBS 洗涤后，用 小牛血清封闭非特异结合位点；然后加入特异的抗粘附分子抗体；反应后洗涤，再加入生物
素标记的二抗，温育反应后洗涤：加入位霉亲和素-辣根过氧化物衡(HP)结合物反应： 最后加入即底物是色，镜下观察 二，萸光免疫细胞组织化学方法 荧光免疫细围组织化学技术月上述酶免疫组织化学方法一样。也可以用于特定组织细幽 表面粘附分子的测定，二者测定的基本原理和基本操作步骤也相差不多，其根本区别是标记 物的不同，本法标记物采用荧光素。 三、酶免疫测定方法 测定细胞表面粘附因子的酶免疫方法可分为酶免疫显色测定法和酶免疫化学发光测定 法两类。 (一）酶免疫显色测定法 本法是最为常用的细髓表面粘附分子测定方法。其基本星理是，吸用于固相载体上的肥 细围，其表面的粘附分子可与加入的酶标转异抗体结合，再加入酶的显色成物进行显色反应， 显色深浅与细胞表面的特定粘用分子的含量成正比。在测定中可采用生物素标记二抗-衡标 亲和素系统提高测定的灵敏度。测定模式和基本测定步骤与普通LI5弘方法相月，故又称为 细围-L15A: (二)酶免疫化学发光测定法 本法与南免疫显色测定方法的原理、测定模式和测定步漫基本相月，不同的是，在最后 一步显色反应时，如入的不是南的显色底物面是南的发光或蒙光底物。如标记南为服即，则 可使用鲁米诺(1u■o)作为其发光底物1如标记酶为碱性磷酸酶P),则可使用四甲基伞 影制质酸盐、APPD(dioxtane%药酸衢)等蒙光和发光底物。然后冉用相应的羹光检测仅或 发光检测仪进行检测。该方法具有灵敏度高的特点，优于暴色方法· 酶免疫测定法用于细胞粘阳分子测定简单方便、灵敏度高。其缺点是：①存在内源性酶 的干扰。当以版即或P作为标记刷时，细胞内存在的内源性HP和AP会造成较强的非特异 显色。实的常以细胞内不存在的一半乳糖苷南、葡司糖氧化酶或服酶等替代服配或P作为 标记解，②在将胞国定于因相载体表面时，所用国定剂（如戊二征）会对细胞表面抗原物 质迹成一定的酸坏，使非特异显色增加
素标记的二抗，温育反应后洗涤；加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶 ( HRP ) 结合物反应； 最后加入 HRP 底物显色，镜下观察。 二、荧光免疫细胞组织化学方法 荧光免疫细胞组织化学技术同上述酶免疫组织化学方法一样，也可以用于特定组织细胞 表面粘附分子的测定，二者测定的基本原理和基本操作步骤也相差不多，其根本区别是标记 物的不同，本法标记物采用荧光素。 三、酶免疫测定方法 测定细胞表面粘附因子的酶免疫方法可分为酶免疫显色测定法和酶免疫化学发光测定 法两类。 (一) 酶免疫显色测定法 本法是最为常用的细胞表面粘附分子测定方法，其基本原理是，吸附于固相载体上的靶 细胞，其表面的粘附分子可与加入的酶标特异抗体结合，再加入酶的显色底物进行显色反应， 显色深浅与细胞表面的特定粘附分子的含量成正比。在测定中可采用生物素标记二抗-酶标 亲和素系统提高测定的灵敏度。测定模式和基本测定步骤与普通 ELISA 方法相同，故又称为 细胞-ELISA。 （二）酶免疫化学发光测定法 本法与酶免疫显色测定方法的原理、测定模式和测定步骤基本相同，不同的是，在最后 一步显色反应时，加入的不是酶的显色底物而是酶的发光或荧光底物，如标记酶为 HRP，则 可使用鲁米诺(luminol)作为其发光底物；如标记酶为碱性磷酸酶(AP)，则可使用四甲基伞 形酮磷酸盐、AMPPD(dioxtanes 磷酸酯)等荧光和发光底物，然后再用相应的荧光检测仪或 发光检测仪进行检测。该方法具有灵敏度高的特点，优于显色方法。 酶免疫测定法用于细胞粘附分子测定简单方便、灵敏度高。其缺点是：①存在内源性酶 的干扰。当以 HRP 或 AP 作为标记酶时，细胞内存在的内源性 HRP 和 AP 会造成较强的非特异 显色。实验常以细胞内不存在的 -半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或脲酶等替代 HRP 或 AP 作为 标记酶。②在将细胞固定于固相载体表面时，所用固定剂（如戊二醛）会对细胞表面抗原物 质造成一定的破坏，使非特异显色增加
四、时阿分辨莫光免疫测定方法 本法可用于内皮细图、淋巴细胞等饵胞表面的粘附分子的测定。其基本原理是。飘系元 素销但)、敏(6)和影(S等的整合物作为标记物标记特异的抗枯附分子抗体，当其与固 相化的（己经TF-或几-1刺藏的内皮细脑表面的）相应粘附分子结合后，可在餐外光 藏发下发出黄光，荧光强弱与细散表面君附分子的含量成正比。 由于水等对荧光有淬灭作用，因此在测定时，需加入一种含有TritonX-l00和2-茶酰 三氟丙阴2灯)的增强溶液，使荧光增强，增加检测灵敏度。测定的基本步费与通常的 ELISA方法相同。 本法的特点是：①不受特异烫光的干扰.侧系元素E阳，b和Sm等的酸合物经繁外光 激发后产生的荧光，其衰变期较干扰物质荧光长，相差56个数量领，因此当率衰期短的本 定荧光衰变后，时同分辨荧光仪测定的荧光信号即全部为上述标记整合物的荧光，从而避免 了常线荧光免麦测定中的特异荧光干扰。②对同一样本可同时进行多种粘附分子的测定。 和，Tb和面等的整合物经嫩发后各自的荧光波长有较大差异，时间分辨荧光仪可将其区别 开来，因此，用上述不同的整合物标记不同的粘附分子特异抗体，则可同时完成多种粘附分 子的测定，③避免了放射性污染， 五、流式组幽仪测定方法 流式细数仪测定淋巴细散表面粘雨分子的基本原理和基本操作步叠与通常的淋巴细围 膜表面抗原分子的流式细胞收测定方法相同但内皮细胞表面粘附分子的流式细胞仪测定则 有内皮细胞标木的处理问题。如人胞盘静林内皮细园单层用F处理后，川甲径园定， 然后在用胰蛋白酶消化前或消化后，再进行间接荧光染色及流式细胞仪测定（流式细胞术内 容参见第二十一章). 第二节可溶性粘阳分子的测定 多数粘附分子都有其对应的可溶性粘附分子存在，目前研究较多的可溶性粘附分子有 E-选释素、P-选择素、L-选择素、CA-1、1CAM1、CDH和CAM分子等。 可溶性黏附因子的测定标本为血清或其他体液。目前，最常用的测定方法是酶联免夜吸 附法(LISA),有些粘用因子的LISA测定己有商品试剂盒供应：
四、时间分辨荧光免疫测定方法 本法可用于内皮细胞、淋巴细胞等细胞表面的粘附分子的测定。其基本原理是，镧系元 素铕(Eu)、铽（Tb）和钐(Sm)等的螯合物作为标记物标记特异的抗粘附分子抗体，当其与固 相化的（已经 TNF- 或 IL-l 剌激的内皮细胞表面的）相应粘附分子结合后， 可在紫外光 激发下发出荧光，荧光强弱与细胞表面粘附分子的含量成正比。 由于水等对荧光有淬灭作用，因此在测定时，需加入一种含有 TritonX-100 和 2-萘酰 三氟丙酮 (2-NTA)的增强溶液，使荧光增强，增加检测灵敏度。测定的基本步骤与通常的 ELISA 方法相同。 本法的特点是：①不受非特异荧光的干扰。镧系元素 Eu、Tb 和 Sm 等的螯合物经紫外光 激发后产生的荧光，其衰变期较干扰物质荧光长，相差 5-6 个数量级，因此当半衰期短的本 底荧光衰变后，时间分辨荧光仪测定的荧光信号即全部为上述标记螯合物的荧光，从而避免 了常规荧光免疫测定中的非特异荧光干扰。②对同一样本可同时进行多种粘附分子的测定。 Eu、Tb 和 Sm 等的整合物经激发后各自的荧光波长有较大差异，时间分辨荧光仪可将其区别 开来，因此，用上述不同的螯合物标记不同的粘附分子特异抗体，则可同时完成多种粘附分 子的测定。③避免了放射性污染。 五、流式细胞仪测定方法 流式细胞仪测定淋巴细胞表面粘附分子的基本原理和基本操作步骤与通常的淋巴细胞 膜表面抗原分子的流式细胞仪测定方法相同。但内皮细胞表面粘附分子的流式细胞仪测定则 有内皮细胞标本的处理问题。如人胎盘静脉内皮细胞单层用 TNF- 处理后，用甲醛固定， 然后在用胰蛋白酶消化前或消化后，再进行间接荧光染色及流式细胞仪测定（流式细胞术内 容参见第二十一章）。 第二节 可溶性粘附分子的测定 多数粘附分子都有其对应的可溶性粘附分子存在，目前研究较多的可溶性粘附分子有 E-选择素、P-选择素、L-选择素、VCAM-1、ICAM-1、CD44 和 NCAM 分子等。 可溶性粘附因子的测定标本为血清或其他体液。目前，最常用的测定方法是酶联免疫吸 附法（ELISA），有些粘附因子的 ELISA 测定已有商品试剂盒供应
南联免疫吸附法 用于血清等体液中可溶性粘附因子的LI5A方法的基本原理和基本操作步檬与其他蛋 白类抗原的且I5A测定方法类似。一般采用双抗体夹心包I5队模式。首先用抗特定粘附分子 的抗体（常用多抗）包被聚菜乙烯微孔板表面。洗涤后用牛血请白蛋白封闭因相表面，然后加 入一定量的相应特测标本，盟育后洗板，再加入酶标的特异性抗粘用分子抗体（多用单抗或 混合单抗)，温育后洗涤，加入酶底物显色测定，显色的深浅与标本中特定粘附分子的含量 成正比。同时，试险设立系列稀释的粘附因子标准品对照，绘制标准由线，将待测标本的测 定吸光度值与标准由线比较，即可得到标本中传测粘附分子的含量。几种可溶性粘附分子在 正常人和某些疾病状态下血蒙中浓度的变化见表241， 值得注意的是，采用LIS制法检测得到的浓度值未必能够反味可溶性粘附分子的实际水 平。因为可溶性粘附分子除以游离状态存在以外，还可与细胞表面或游离的配体结合，用常 规的且ISA法难以检测结合状态的可溶性粘附分子。因此，对所有的可溶性黏附分子水平应 从粘附分子产生和清除两方面进行动态分析，产生的增加和清除的减少都可造成可溶性粘附 分子血中水平的升高。 二、其他免夜测定方法 由于免疫测定方法对蛋白和多肽类抗原测定的通用性，从理论上说，任一种免疫测定方 法均可用于可溶性粘附分子的测定，如收射免疫试验(I》、化学发光免疫测定方法、时间 分辨突光免疫测定方法等，但在实际测定应用中，对于某一种精附分子，具体应用哪一种方 法，可根据检测标本种类，检测目的及可得到的检测手段而采用具体的测定方法和枝式。要 注意的是，A由于其实验度弃物对环境的污染、试剂半衰期短以及测定操作繁项等缺点， 在常援应用测定中，现己基本上由其他非放射性核素标记免疫测定方法所取代。 第三节细散粘附分子基因及基因表达的测定 细胞粘用分子基因的多态性测定 为闹明某些涉及内皮功能纸下疾病的遗传学特性，可测定特定细胞粘附分子的基因多志 性。细胞粘附分子基因多态性的检测方法主要有代果-单链构型多态性代C-SSCP）、R-限
一、 酶联免疫吸附法 用于血清等体液中可溶性粘附因子的 ELISA 方法的基本原理和基本操作步骤与其他蛋 白类抗原的 ELISA 测定方法类似。一般采用双抗体夹心 ELISA 模式。首先用抗特定粘附分子 的抗体(常用多抗)包被聚苯乙烯微孔板表面，洗涤后用牛血清白蛋白封闭固相表面，然后加 入一定量的相应待测标本，温育后洗板，再加入酶标的特异性抗粘附分子抗体(多用单抗或 混合单抗)，温育后洗涤，加入酶底物显色测定，显色的深浅与标本中特定粘附分子的含量 成正比。同时，试验设立系列稀释的粘附因子标准品对照，绘制标准曲线，将待测标本的测 定吸光度值与标准曲线比较，即可得到标本中待测粘附分子的含量。几种可溶性粘附分子在 正常人和某些疾病状态下血浆中浓度的变化见表 24-1。 值得注意的是，采用 ELISA 法检测得到的浓度值未必能够反映可溶性粘附分子的实际水 平。因为可溶性粘附分子除以游离状态存在以外，还可与细胞表面或游离的配体结合，用常 规的 ELISA 法难以检测结合状态的可溶性粘附分子。因此，对所有的可溶性粘附分子水平应 从粘附分子产生和清除两方面进行动态分析，产生的增加和清除的减少都可造成可溶性粘附 分子血中水平的升高。 二、其他免疫测定方法 由于免疫测定方法对蛋白和多肽类抗原测定的通用性，从理论上说，任一种免疫测定方 法均可用于可溶性粘附分子的测定，如放射免疫试验(RIA)、化学发光免疫测定方法、时间 分辨荧光免疫测定方法等，但在实际测定应用中，对于某一种粘附分子，具体应用哪一种方 法，可根据检测标本种类、检测目的及可得到的检测手段而采用具体的测定方法和模式。要 注意的是，RIA 由于其实验废弃物对环境的污染、试剂半衰期短以及测定操作繁琐等缺点， 在常规应用测定中，现已基本上由其他非放射性核素标记免疫测定方法所取代。 第三节 细胞粘附分子基因及基因表达的测定 一、 细胞粘附分子基因的多态性测定 为阐明某些涉及内皮功能低下疾病的遗传学特性，可测定特定细胞粘附分子的基因多态 性。细胞粘附分子基因多态性的检测方法主要有 PCR-单链构型多态性(PCR-SSCP)、PCR-限
制性片段长度多态性(PCR-FLP),CR-序列特异性靠核昏酿(PR-SS0),实时卖光FCR和 PCR-直接测序法等，PCR-直接测序法通常作为验证方法。 表21可溶性粘用分子水平及其与疾病的关系 粘附分子 细胞来源 正常人水平 下列疾转状态升高 E-选择素 白细胞 927g/a 败血症、阳V感染、白血病、糖尿病、类风湿关 节炎等 P-选择素 血小板、内皮细 98262 肝病、老疾、心脏病、血红蛋白尿、血栓性血小 胞 /nl 板较少性紫赣等 L-选释素 内皮细围、上皮 1.61.9g/ 败血症、糖尿病、是疾，系统性红斑跟格、华嘱、 细胞，巨檬细胞、 nl 血透、高血压、肿植、类风湿关节炎等 树突状细胞 VCAV-1 白细胞、内皮细 2301400 肾癌、密践癌、肾功能不全、血管炎、类风湿关 胞，上皮细胞、 g/nl 节炎，败血症，骨移植后、疟疾、血通、高血压、 肝细胞、。平滑肌 糖尿病、系统性红斑慕疮等 细胞 ICAV-1 102450 肾功能不全，类风程关节炎、败血建，肾移植后、 R/nl 烂疾、血透、高血压、糖尿病、系统性红斑鞭疮， 肿稻转移、滑场性结肠炎、肺纤维化、心脏移植 排斥、黑色者瘤、多发性硬化刺等 44 胃密、结形癌 ICAM-3 系统性红斑跟格、类风湿美节炎 (一)CR-SS0P方法 单皓构型多态性-聚合酶链式反应（代CR and single-strand conformation polymorphist属 PCR-SSCP)的基本原理是在完成目的W的PCR扩增后，进行单链NA多态性分析的一种方 法。其原理是，在不含变性剂的中性案丙烯酰陵凝胶电冰时，电冰迁移率障与分子长度 相关外。更主要的是由WA单链的空间构象所决定。在非变性条件下，似：单链本身可折叠 形成具有一定空间结构的构象，形成这件构象的基础是盛单链中碱基序列。长度相同但组 成碱基的顺序不同（甚至单个碱基的不同），就会导致其构象上的差异，从而造成其在素丙 烯酰夜凝取电泳中近移率的不同。根据不同的近移率可得知点突变的存在，扩增产物可选一 步进行路A测序验证。 本方法优点：操作简便，快速、灵敏，适用于大样本及来知基因的多态性检测。缺点是： ①测定点突变时，不能排除假阳性，其特异性必须由%A测序来证实：②CR-SSCP的测定 操作难以标准化。P家-5SCP测定的影响因素较多，难以模式化，实验室必须模素白己的最 适实验条件。且对实验操作者的经验要求较高，不易掌握，难以推广
制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-序列特异性寡核苷酸（PCR-SSO）、实时荧光 PCR 和 PCR-直接测序法等。 PCR-直接测序法通常作为验证方法。 表 24-1 可溶性粘附分子水平及其与疾病的关系 （一）PCR-SSCP 方法 单链构型多态性-聚合酶链式反应（PCR and single-strand conformation polymorphism, PCR-SSCP）的基本原理是在完成目的 DNA 的 PCR 扩增后，进行单链 DNA 多态性分析的一种方 法。其原理是，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，电泳迁移率除与 DNA 分子长度 相关外，更主要的是由 DNA 单链的空间构象所决定。在非变性条件下，DNA 单链本身可折叠 形成具有一定空间结构的构象，形成这种构象的基础是 DNA 单链中碱基序列。长度相同但组 成碱基的顺序不同（甚至单个碱基的不同），就会导致其构象上的差异，从而造成其在聚丙 烯酰胺凝胶电泳中迁移率的不同。根据不同的迁移率可得知点突变的存在。扩增产物可进一 步进行 DNA 测序验证。 本方法优点：操作简便、快速、灵敏，适用于大样本及未知基因的多态性检测。缺点是： ①测定点突变时，不能排除假阳性，其特异性必须由 DNA 测序来证实；②PCR-SSCP 的测定 操作难以标准化。PCR-SSCP 测定的影响因素较多，难以模式化，实验室必须摸索自己的最 适实验条件。且对实验操作者的经验要求较高，不易掌握，难以推广。 粘附分子 细胞来源 正常人水平 下列疾病状态升高 E-选择素 白细胞 9~27 g/m l 败血症、HIV 感染、白血病、糖尿病、类风湿关 节炎等 P-选择素 血小板、内皮细 胞 98~262 g /ml 肝病、疟疾、心脏病、血红蛋白尿、血栓性血小 板较少性紫癜等 L-选择素 内皮细胞、上皮 细胞、巨噬细胞、 树突状细胞 1.6~1.9 g/ ml 败血症、糖尿病、疟疾、系统性红斑狼疮、哮喘、 血透、高血压、肿瘤、类风湿关节炎等 VCAM-1 白细胞、内皮细 胞、上皮细胞、 肝细胞、平滑肌 细胞 230~1400 g/ml 肾癌、膀胱癌、肾功能不全、血管炎、类风湿关 节炎、败血症、肾移植后、疟疾、血透、高血压、 糖尿病、系统性红斑狼疮等 ICAM-1 102~450 g/ml 肾功能不全、类风湿关节炎、败血症、肾移植后、 疟疾、血透、高血压、糖尿病、系统性红斑狼疮、 肿瘤转移、溃疡性结肠炎、肺纤维化、心脏移植 排斥、黑色素瘤、多发性硬化病等 CD44 胃癌、结肠癌 ICAM-3 系统性红斑狼疮、类风湿关节炎
(二)PCR-RFP方法 本法是最为常用的基因多态性测定方法，其基本理是，特定的限性内切酶在N 中有特定的识别位点，因此特定队被限制性内切所水解后的片段长度变化可反映NA中特 定区域的结构改变，如点突变、缺失、插入和重排等。 其基本测定操作步骤为：①特定的CR扩增产物用一特异的限制性内切酶消化：②将南 切消化后的NA片段进行球而糖或聚再烯酰孩疑歌电达：3将其经Southern传移至硝艘纤 维素膜上：④与放射性核素或非放射性核素标记的嘉核售酸探针象交：⑤如标记物为放射性 核素，则进行放射自显影测定：如为生物素或地高辛标记，则如入亲和素解或抗地高辛 酶站合物反应后，再加入酶底物显色测定，由于Southern转移后再进行模上斑点杂交检测 通常较为繁项。放在实际应用中，常常只进行到上述中的第二步，省略Suh©m杂交检测， 但应注意测定的特异性是否可靠 (三)CR-SS0 序列特异性寡核昔酸-聚合酶链式反应(FC累-sequence speeific oligoeucleotide, C黑5S)实验室常用的检测粘附分子基因的方法之一，其主要技术包括：提取目的基因NA, 以位点间或组间特异性引物进行体外扩增，再将扩增产物转移至硝酸纤排素膜或尼龙膜上， 然后以放则性核素(P)或非放射性物质（群、地高辛等》标记的人工合成序列特异性幕核 皆酸(S0》探针进行杂交，从而分辨出几乎所有等位基因的特异性。该法敏感度较高。可 以区分亚型之间的1广2个碱基对差异：便于对小样品的快速检测，与家-FP方法比较具 有简便、特异性强的特点。 (四)实时炭光CR方法 常用的实到荧光PCR方法有Tan探针法，分子信标探针法和荧光标记双探针法等。 这些方法可用于基因多态性的测定，花核酸点突变、缺失、插入和重排等的测定。Tan 探针法和分子信标探针法在前面的有关章节已有介绍，.本处只对黄亮标记双深针方法作一简 要介绍。 续光标记双探针法同样采用荧光共振能量转移的原理，即两条可与彩核酸模板在密切邻 近位置以头对尾形式杂交的寡核苷酸探针，其一条的3末端标记荧光素，另一条的5矿末端 标记另一种荧光染料LCRd64O),前者在激发光的作用下，放出绿色荧允，当上述两种英 光染料因为两条探针与配核酸杂交面密切意近时，即发生荧光能量共振转移，使另一条探针 的末璃荧光染料敲散发周放出红色荧充。这种荧光修量转移只有当两种荧光染料密切忽
(二) PCR-RFLP 方法 本法是最为常用的基因多态性测定方法，其基本原理是，特定的限制性内切酶在 DNA 中有特定的识别位点，因此特定 DNA 被限制性内切酶水解后的片段长度变化可反映 DNA 中特 定区域的结构改变，如点突变、缺失、插入和重排等。 其基本测定操作步骤为：①特定的 PCR 扩增产物用一特异的限制性内切酶消化；②将酶 切消化后的 DNA 片段进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳；③将其经 Southern 转移至硝酸纤 维素膜上；④与放射性核素或非放射性核素标记的寡核苷酸探针杂交；⑤如标记物为放射性 核素，则进行放射自显影测定；如为生物素或地高辛标记，则加入亲和素-酶或抗地高辛- 酶结合物反应后，再加入酶底物显色测定。由于 Southern 转移后再进行膜上斑点杂交检测 通常较为繁琐，故在实际应用中，常常只进行到上述中的第二步，省略 Southern 杂交检测， 但应注意测定的特异性是否可靠。 （三）PCR-SSO 序列特异性寡核苷酸-聚合酶链式反应（PCR-sequence specific oligonucleotide, PCR-SSO）实验室常用的检测粘附分子基因的方法之一。其主要技术包括：提取目的基因 DNA， 以位点间或组间特异性引物进行体外扩增，再将扩增产物转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上， 然后以放射性核素（32P）或非放射性物质（酶、地高辛等）标记的人工合成序列特异性寡核 苷酸（SSO）探针进行杂交，从而分辨出几乎所有等位基因的特异性。该法敏感度较高，可 以区分亚型之间的 1~2 个碱基对差异；便于对小样品的快速检测，与 PCR-RFLP 方法比较具 有简便、特异性强的特点。 （四）实时荧光 PCR 方法 常用的实时荧光 PCR 方法有 TaqMan 探针法、分子信标探针法和荧光标记双探针法等。 这些方法可用于基因多态性的测定，靶核酸点突变、缺失、插入和重排等的测定。TaqMan 探针法和分子信标探针法在前面的有关章节已有介绍，本处只对荧光标记双探针方法作一简 要介绍。 荧光标记双探针法同样采用荧光共振能量转移的原理，即两条可与靶核酸模板在密切邻 近位置以头对尾形式杂交的寡核苷酸探针，其一条的 3'末端标记荧光素，另一条的 5'末端 标记另一种荧光染料(LC Red 640)，前者在激发光的作用下，放出绿色荧光，当上述两种荧 光染料因为两条探针与靶核酸杂交而密切靠近时，即发生荧光能量共振转移，使另一条探针 的 5'末端荧光染料被激发而放出红色荧光。这种荧光能量转移只有当两种荧光染料密切邻
近(15楼苷酸之间》时才发生。在整个R扩增过程中，所爱出的红色究光的强度与扩增模 板产物的量成比例相美。爱光出现的阶段为扩增中的退火期。 实时荧光R方法的优点较为突出，主要是：①扩增和产物测定同时完成：②扩增反应 管在测定的始终总是处于用管状态，因此出现扩增产物污荣的可能性小：③简便快速：④可 同时测定大量样本，缺点是：①对每种突变，需制备得到相应的荧光标记特异探针：四需要 特殊的基因扩增实时荧光测定设各。 二，细散粘附分子基因表达的测定 细胞粘附分子mRNA的测定，可使用Northern-blot和（或）T-PO方法进行，基本测定 原理和方法与细围因子的XA的测定相同。可采用内标竟争T-代R荧光实时定量T-CR 等各种具体测定方法。测定标本可为话检或手术取得的组织细胞标本，也诱导培养的人胎盘 静脉内皮细胞、外周血淋巴细胞和粒细胞等。的测定最关键的是在标本的收集、处理 和核酸提取纯化时，要注意防止A的降解。 第四节细胞枯附分子测定的应用 细胞粘附分子的测定根据其应用日的可分为摆讨疾病发生发展机制和疾病的临床诊断 及预后两个方面。 一，疾病发生发展机制的探讨 (一）类症 夷起过程的重要特征之一就是白细数粘附，在血管度上的附壁滚动，穿越血管内皮细散， 激活和向炎症部位浅出。该过程的重要分子基础是自细胞及血管内皮细胞间粘附分子的相互 作用，不月白细胞的渗出过程或渗出的不同阶段所诊及的粘附分子不尽相同，不同的炎整具 有不同类型的炎性细胞浸润。例如，在炎症发生初期。中性粒细鞋表面①15s可与血管内皮 细围表面E一选择素结合面粘用于血管量：随后，在血管内皮细胞表达的质结合型山-8诱导 下，已粘附的中性粒细胞LFA-】和场C一】等整合素分子表达上调，同内皮细胞表而由促炎因 子诱生的ICAM1相互结合，对中性粒细围与内皮细胞紧密粘附和穿越血管摩到炎醒部位发 挥关健作用。急性烫建主要以中性粒细照的渗出和浸润为主，而慢性炎建则通常以淋巴细胞
近(1~5 核苷酸之间)时才发生。在整个 PCR 扩增过程中，所发出的红色荧光的强度与扩增模 板产物的量成比例相关。荧光出现的阶段为扩增中的退火期。 实时荧光 PCR 方法的优点较为突出，主要是：①扩增和产物测定同时完成；②扩增反应 管在测定的始终总是处于闭管状态，因此出现扩增产物污染的可能性小；③简便快速；④可 同时测定大量样本。缺点是：①对每种突变，需制备得到相应的荧光标记特异探针；②需要 特殊的基因扩增实时荧光测定设备。 二、细胞粘附分子基因表达的测定 细胞粘附分子 mRNA 的测定，可使用 Northern-blot 和(或)RT-PCR 方法进行。基本测定 原理和方法与细胞因子的 mRNA 的测定相同。可采用内标竞争 RT-PCR、荧光实时定量 RT-PCR 等各种具体测定方法。测定标本可为活检或手术取得的组织细胞标本、也诱导培养的人胎盘 静脉内皮细胞、外周血淋巴细胞和粒细胞等。 RNA 的测定最关键的是在标本的收集、处理 和核酸提取纯化时，要注意防止 RNA 的降解。 第四节 细胞粘附分子测定的应用 细胞粘附分子的测定根据其应用目的可分为探讨疾病发生发展机制和疾病的临床诊断 及预后两个方面。 一、疾病发生发展机制的探讨 (一) 炎症 炎症过程的重要特征之一就是白细胞粘附、在血管壁上的附壁滚动、穿越血管内皮细胞、 激活和向炎症部位渗出。该过程的重要分子基础是白细胞及血管内皮细胞间粘附分子的相互 作用，不同白细胞的渗出过程或渗出的不同阶段所涉及的粘附分子不尽相同，不同的炎症具 有不同类型的炎性细胞浸润。例如，在炎症发生初期，中性粒细胞表面 CD15s 可与血管内皮 细胞表面 E-选择素结合而粘附于血管壁；随后，在血管内皮细胞表达的膜结合型 IL-8 诱导 下，已粘附的中性粒细胞 LFA-1 和 Mac-1 等整合素分子表达上调，同内皮细胞表面由促炎因 子诱生的 ICAM-1 相互结合，对中性粒细胞与内皮细胞紧密粘附和穿越血管壁到炎症部位发 挥关键作用。急性炎症主要以中性粒细胞的渗出和浸润为主，而慢性炎症则通常以淋巴细胞
浸润为主。其机理尽管简未亮全清楚，但粘附分子在不同类细鞋内表达的差异以及阳散因 子对其表达的调节作用可修是一个重要原因。 途择素家族尤其是L选择素与其配体的作用介导中性粒细胞在血管度上的滚动。当内皮 细型在闭因子，内毒素成组胺、凝直酶、领激肽，白三烯C4及自由基的作用下，-选择 素就会转移至内皮细胞的管腔面，存在于血小板内的遗择素很快就会移至细胞表面。促 使配体细阿粘附因子-11CA1)在细型内的高水平表达，同时，由于血小板激活因子PAF) 在细胞内细胞的表达，刺潘中性粒细胞上调表达CD11/C18(2-整合素)，并进而使中性粒 细胞经由①18与其ICw的相互作用黏附于内皮饵胞上，同样，在淋巴细园与内皮细胞的粘 附中，G11/C①18-ICAW-1的相互作用也是一个重要的因素。白细围在血管内皮细围单层两 侧的移行与属于免疫球蛋自超家族的血小版内皮细胞粘附因子-1ECM1)在内皮细胞的表 达密切相关。一般情况下，中性粒细胞的移行必领有内皮细胞的撒活，但在特定的情况下， 如一些化学诱导剂/激活剂可直接使中性粒细图表达CD11/C18,从而使白细鞋在不依赖选 择素的情况下，经由内皮细胞上的1CM1而粘附于未技激活的内皮细胞上，于是，当中性 粒细胞在内皮细胞单层两侧存在趋化性梯度时，即可在内皮细胞没有被激活的情况下发生移 行。若白细幽①11/D18分子表达缺路，则中性粒细胞虽可在透择素与其配体的作用下沿血 管量正常滚动，无法粘用于血管内皮细散单层，不能向炎症部位渗透，进而引起致金性感 染。再如体内表达S-Lws等寡糖的缺陷，使得选择素的配体缺失，进而也可使中性粒细散 滚动及向炎症部位的渗透发生障得。 探时细胞粘用分子与炎症的关系。对于特定疾病的临床治疗有重要应用偷值。如针对粘 附分子及其配体与中性粒细胞、淋巴细胞等的附壁滚动、粘用和移行的关系，设计制备相应 的桔附因子抗体，物制内皮细胞相应粘用分子表达的寡核营酸链或类以粘附因子配体的物 质，从而阳断白细胞与内皮细胞因粘附因子与其配体的相互作用所数的桔附和移行，达到相 应炎症性疾病治疗的目的。 二)肿痛转移 内皮细胞一肿输细胞的凯别在肿瘤转移至特定部位的过程中起着决定性的作用，肿瘤转 移过程的分子机制在许多方面与自细型转移至炎醒部位的方式相似，粘附分子在肿瘤发展和 转移，以及调节效应细胞对种瘤的柔伤中具有重要作用。目前已知，。脚箱浸润和转移与其粘 附分子表达的改变有关。肿瘤细胞某些粘附分子表达减少可使细胞阿粘着减弱，肿密细胞得 以从单发肿痛分离，这是肿痛细胞浸洞和转移的薄一步，例如，人乳腺癌，结肠癌等多种肿 耀细散E-Cadherin表达明显减少成缺失，这种改变与肿植细围的恶性程度显著相关。另外
浸润为主。其机理尽管尚未完全清楚，但粘附分子在不同类型细胞内表达的差异以及细胞因 子对其表达的调节作用可能是一个重要原因。 选择素家族尤其是 L 选择素与其配体的作用介导中性粒细胞在血管壁上的滚动。当内皮 细胞在细胞因子、内毒素或组胺、凝血酶、缓激肽、白三烯 C4 及自由基的作用下，E-选择 素就会转移至内皮细胞的管腔面，存在于血小板内的 p-选择素很快就会移至细胞表面，促 使配体细胞间粘附因子-1(ICAM-1)在细胞内的高水平表达。同时，由于血小板激活因子(PAF) 在细胞内细胞的表达，刺激中性粒细胞上调表达 CD11/CD18( 2-整合素)，并进而使中性粒 细胞经由 CD18 与其 ICAM 的相互作用粘附于内皮细胞上。同样，在淋巴细胞与内皮细胞的粘 附中，CD11/CD18-ICAM-1 的相互作用也是一个重要的因素。白细胞在血管内皮细胞单层两 侧的移行与属于免疫球蛋白超家族的血小板内皮细胞粘附因子-1(PECAM-1)在内皮细胞的表 达密切相关。一般情况下，中性粒细胞的移行必须有内皮细胞的激活，但在特定的情况下， 如一些化学诱导剂/激活剂可直接使中性粒细胞表达 CD11/CD18，从而使白细胞在不依赖选 择素的情况下，经由内皮细胞上的 ICAM-1 而粘附于未被激活的内皮细胞上，于是，当中性 粒细胞在内皮细胞单层两侧存在趋化性梯度时，即可在内皮细胞没有被激活的情况下发生移 行。若白细胞 CD11/CD18 分子表达缺陷，则中性粒细胞虽可在选择素与其配体的作用下沿血 管壁正常滚动，但无法粘附于血管内皮细胞单层，不能向炎症部位渗透，进而引起致命性感 染。再如体内表达 S-Lewis 等寡糖的缺陷，使得选择素的配体缺失，进而也可使中性粒细胞 滚动及向炎症部位的渗透发生障碍。 探讨细胞粘附分子与炎症的关系，对于特定疾病的临床治疗有重要应用价值。如针对粘 附分子及其配体与中性粒细胞、淋巴细胞等的附壁滚动、粘附和移行的关系，设计制备相应 的粘附因子抗体、抑制内皮细胞相应粘附分子表达的寡核昔酸链或类似粘附因子配体的物 质，从而阻断白细胞与内皮细胞因粘附因子与其配体的相互作用所致的粘附和移行，达到相 应炎症性疾病治疗的目的。 (二)肿瘤转移 内皮细胞-肿瘤细胞的识别在肿瘤转移至特定部位的过程中起着决定性的作用，肿瘤转 移过程的分子机制在许多方面与自细胞转移至炎症部位的方式相似。粘附分子在肿瘤发展和 转移，以及调节效应细胞对肿瘤的杀伤中具有重要作用。目前已知，肿瘤浸润和转移与其粘 附分子表达的改变有关。肿瘤细胞某些粘附分子表达减少可使细胞间粘着减弱，肿瘤细胞得 以从原发肿瘤分离，这是肿瘤细胞浸润和转移的第一步。例如，人乳腺癌、结肠癌等多种肿 瘤细胞 E-Cadherin 表达明显减少或缺失，这种改变与肿瘤细胞的恶性程度显著相关。另外
除了表达水平改变有关外，粘用分子在肿宿细鞋的定位也有改变。如E-Cadherin分子在正 常上皮组织中主要分布于细胞相忽的侧面，而某些上皮组织起薄的肿宿饵胞E-Cadh©rin则 表达在细鞋项部，这种分布异常使其难以发挥细胞间相互附着作用，这可能也是肿瘤细融易 与原发肿瘤脱离并转移的原因之一，另一方面，肿缩细园表达的某生粘附分子使己进入血流 的肿宿细胞得以粘附血管内皮细胞，迹成血行转移。在肿宿转移过程中，肿榴细胞表面粘附 分子可发生变化。如在肿窗发生早期。整合素表达降低，有利于瘤细脑在局部生长和扩散： 在箱细胞进入血循环后，其整合素表达上调。能促遗榴细散粘附血管内皮细胞，雅而发生转 移。 粘附分子能介导黑细围，CTL,巨噬细胞等效应细胞与肿窄细胞粘用，例如。参与C 杀伤植细围的粘用分子有1CAW-1、FH-1、C2、LFA-3,C8及C1类分子等。某些肿相 细胞粘附分子表达缺失或下调，可逃避效应细胞的杀伤作用。此外，肿箱患者体液中可溶性 ICW-】等粘附分子水平往往升高。可能掉制属饵胞等效应细图的杀伤作用，从而使肿瘤能 得以选避免疫攻击。 调节内皮细胞-种密细胞间相互作用的因素中有整合素和非整合素粘附分子，不月的肿 瘤其粘附的途径往往有所不同。结肠癌细胞的粘附为透择素介导，而黑色素宿和骨肉瘤则以 直管细胞粘附分子-1(CA收-1)作为内皮细敢的配体。恶性肿箱细胞的转移与夷柱时白细围 的浸淘一样，也有一个选择素介导的血管壁上附壁滚动，然后再与血管内皮细型产生粘附的 过程，但黑色素榴和骨肉箱不经过顶先的附壁滚动。而直接通过CM1粘附于内皮细散。 《三》器官移植排斥 在器官移植中，整合素、选择素、粘蛋白样家族和[厨成员参与移植排斥反应的发生。 这些粘附分子的主要作用是介导白细围向移植部位浸润，提供T细融藏话的诗同料激信号， 诱导效应T细胞形成以及介导效应细将杀伤移植物配细胞等，联合应用抗LFA-1CD11a/CD18) 单抗和免疫神制剂，可廷长骨鞋移植惠者存活期：抗IC-!单抗与环池幕素A(Cs)联合使 用，可延长同种异体肾移植物的存活期。此外，检测惠者血中可溶性ICM(sIC世)和可溶 性CAW(sCA-1)水平，可作为移植挂斥反应的监测指标。 《四)自身免疫病 粘附分子参与某生自身免疫病的组织机伤。例如，在类风湿关节炎发树过程中，悲者T 细胞C2、LFA-1、LA等粘用分子表达明显上调，炎症部位的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞 可表达CD44、1.-透择素等自果受体，并产生大量细胞因子作用于内皮细胞，促使其CW1、 G31等表达增高，从而增强白细围与内皮细胞粘附及穿感血管壁，促进淋巴细胞、单核/巨
除了表达水平改变有关外，粘附分子在肿瘤细胞的定位也有改变。如 E-Cadherin 分子在正 常上皮组织中主要分布于细胞相邻的侧面，而某些上皮组织起源的肿瘤细胞 E-Cadherin 则 表达在细胞顶部，这种分布异常使其难以发挥细胞间相互附着作用，这可能也是肿瘤细胞易 与原发肿瘤脱离并转移的原因之一。另一方面，肿瘤细胞表达的某些粘附分子使已进入血流 的肿瘤细胞得以粘附血管内皮细胞，造成血行转移。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞表面粘附 分子可发生变化。如在肿瘤发生早期，整合素表达降低，有利于瘤细胞在局部生长和扩散； 在瘤细胞进入血循环后，其整合素表达上调，能促进瘤细胞粘附血管内皮细胞，继而发生转 移。 粘附分子能介导 NK 细胞、CTL、巨噬细胞等效应细胞与肿瘤细胞粘附。例如，参与 CTL 杀伤瘤细胞的粘附分子有 ICAM-1、LFA-1、CD2、LFA-3、CD8 及 MHC Ⅰ类分子等。某些肿瘤 细胞粘附分子表达缺失或下调，可逃避效应细胞的杀伤作用。此外，肿瘤患者体液中可溶性 ICAM-1 等粘附分子水平往往升高，可能抑制 NK 细胞等效应细胞的杀伤作用，从而使肿瘤能 得以逃避免疫攻击。 调节内皮细胞-肿瘤细胞间相互作用的因素中有整合素和非整合素粘附分子，不同的肿 瘤其粘附的途径往往有所不同，结肠癌细胞的粘附为选择素介导，而黑色素瘤和骨肉瘤则以 血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1) 作为内皮细胞的配体。恶性肿瘤细胞的转移与炎症时白细胞 的浸润一样，也有一个选择素介导的血管壁上附壁滚动，然后再与血管内皮细胞产生粘附的 过程，但黑色素瘤和骨肉瘤不经过预先的附壁滚动，而直接通过 VCAM-1 粘附于内皮细胞。 （三）器官移植排斥 在器官移植中，整合素、选择素、粘蛋白样家族和 IgSF 成员参与移植排斥反应的发生。 这些粘附分子的主要作用是介导白细胞向移植部位浸润，提供 T 细胞激活的协同刺激信号， 诱导效应 T 细胞形成以及介导效应细胞杀伤移植物靶细胞等。联合应用抗 LFA-1(CD11a/CD18) 单抗和免疫抑制剂，可延长骨髓移植患者存活期；抗 ICAM-1 单抗与环孢霉素 A(CsA)联合使 用，可延长同种异体肾移植物的存活期。此外，检测患者血中可溶性 ICAM(sICAM-1)和可溶 性 VCAM(sVCAM-1)水平，可作为移植排斥反应的监测指标。 （四）自身免疫病 粘附分子参与某些自身免疫病的组织损伤。例如，在类风湿关节炎发病过程中，患者 T 细胞 CD2、LFA-1、VLA 等粘附分子表达明显上调，炎症部位的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞 可表达 CD44、L-选择素等归巢受体，并产生大量细胞因子作用于内皮细胞，促使其 ICAM-1、 CD31 等表达增高，从而增强白细胞与内皮细胞粘附及穿越血管壁，促进淋巴细胞、单核/巨