第二十三靠流式细离术(F1 ow Cytoo%try,简称FCY) Introduction 算一节CM分斯及分遗原理Principle of0 P饮搭工作单理 二， 细取敏射免德号测考 三， 细或光仿兮定 四、P细里分达Cell Sorting的是理 竟二节FM数据的显示与分析Display and Analysis of Duta》 一、 参量 二、 数招显示方式 年三节M免支分析技术(Immnoanalysis technique of P0 免及检测样本的制客 免发分析中常川的卖光婆料与新记染色 三、P免度分析的量控制 第四节FCM在免疫学中的交用(Immunological Applications of F) “、 兼巴细型及其亚产打测定 淋巴细取动能测期定 三 白直内细散免疫分亚 四、 针常面药基因分 五、 AIDS剂程分析 六、 自身免孩性质病相关ⅢA抗原分析 学习要点 垂代M深耳 ·M据示方式 16
101 第二十三章 流式细胞术 ( Flow Cytometry， 简称 FCM ) Introduction 第一节FCM 分析及分选原理(Principle of FCM) 一、 FCM 仪器工作原理 二、 细胞散射光信号测定 三、 细胞荧光信号测定 四、 FCM 细胞分选(Cell Sorting)的原理 第二节FCM 数据的显示与分析(Display and Analysis of Data) 一、 参数 二、 数据显示方式 第三节FCM 免疫分析技术(Immunoanalysis technique of FCM) 一、 免疫检测样本的制备 二、 免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、 FCM 免疫分析的质量控制 第四节FCM 在免疫学中的应用（Immunological Applications of FCM） 一、 淋巴细胞及其亚群的测定 二、 淋巴细胞功能测定 三、 白血病细胞免疫分型 四、 肿瘤耐药基因分析 五、 AIDS 病程分析 六、 自身免疫性疾病相关 HLA 抗原分析 学习要点 ⚫ FCM 原理 ⚫ FCM 数据显示方式
·多数数据分析方法 ·免疫荧光研究中的对照 ·FW直接免疫蒙光标记找术 ·在免疫学中的应月 与传统的将细胜周定在找玻片上的研究方法不同。W要求将细电群品悬浮在液休中，这 些细监是液加入仪器后，高迪流过仪器的粒测区。仪器对样品中每个细进行定量的分析 定，记求每，个细监众多的生物学参数。能在细胞保持完整的情况下进行单细型分子水 的分析研究，并可根据预选的参数条件将其中特猴的细胞亚群分选、纯化出来，供进一步深入 的研究。 第一节FOW分析及分选眼班rinfC0 ·、下仪器工作原理 下能高遮自动分析单个细监的多个生物学特性或多种细脑生化成分的含量（每秒可达刀 干上万个细)，一任一、二分钟内就能完成细慰大群体的定分析。这种自动分析方法 排除了各种主观因素的干扰，其分析结果具有客观、准确和统计学高精度的特点。同时，细更 多参的相关分析可我得更多、更精确的生物学思· 从原理上进是一种在计算机技术支持下的高度自动化的显微荧光肤冲分光光度仪。国 仪器一般可分为二个都分：(1)鈿形流动室及其液流驱动系统：(2)激发光及其光束成形系 统：(3)跑号检与分析、品示、记录系统，见图21-1.这三个部分在仪器中一般按 三个互为垂直的轴线安置，即X轴方向的激发光轴线、Y轴方向的细胞荧光信号检测轴纸和 方向的细抱流轴线.。此三个轴线的交点即为仪器的检测区。样品中的一个细胞按顺子依次 通过检测区。细的受到澈发光的光照，产生细的的散射光信号与荧光信号，这些信号由仪器的 检沸器妆集、分析、处理和记录、这就是流动式的细炮分析技术
102 ⚫ FCM 多参数数据分析方法 ⚫ FCM 直接免疫荧光标记技术 ⚫ FCM 免疫荧光研究中的对照 ⚫ FCM 在免疫学中的应用 与传统的将细胞固定在载玻片上的研究方法不同，FCM 要求将细胞样品悬浮在液体中。这 些细胞悬液加入仪器后，高速流过仪器的检测区。仪器对样品中每一个细胞进行定量的分析测 定，记录每一个细胞众多的生物学参数。FCM 能在细胞保持完整的情况下进行单细胞分子水平 的分析研究，并可根据预选的参数条件将其中特殊的细胞亚群分选、纯化出来，供进一步深入 的研究。 第一节 FCM 分析及分选原理(Principle of FCM) 一、FCM 仪器工作原理 FCM 能高速自动分析单个细胞的多个生物学特性或多种细胞生化成分的含量（每秒可达几 千上万个细胞），一般在一、二分钟内就能完成对细胞大群体的定量分析。这种自动分析方法 排除了各种主观因素的干扰，其分析结果具有客观、准确和统计学高精度的特点。同时，细胞 多参数的相关分析可获得更多、更精确的生物学信息。 FCM 从原理上讲是一种在计算机技术支持下的高度自动化的显微荧光脉冲分光光度仪。FCM 仪器一般可分为三个部分：（1）细胞流动室及其液流驱动系统；（2）激发光及其光束成形系 统；（3）细胞信号检测与分析、显示、记录系统，见图 21-1。这三个部分在仪器中一般都按 三个互为垂直的轴线安置，即 X 轴方向的激发光轴线、Y 轴方向的细胞荧光信号检测轴线和 Z 轴方向的细胞流轴线。此三个轴线的交点即为仪器的检测区。样品中的每一个细胞按顺序依次 通过检测区。细胞受到激发光的光照，产生细胞的散射光信号与荧光信号，这些信号由仪器的 检测器收集、分析、处理和记录。这就是流动式的细胞分析技术
图28-1M仪器原理图 。流动空与液流整动系统 流动室是F的核心部杵。细监样品和包嘉在外的精液在气体正压的塞动下忘流经流 动室。其中的细散一个一个排列咸华行，逐个以相问的遮度、相同的轨迹通过检测区，这是 PW的单细胞流技术。 2.激发光与光束成形系统 心的微发光大多采用氢离子气休澈光器4m诺线，它能激发多种常用的荧光素染料 近年米，半导体激光器技术发爬泥速，已开始用于mV, 为了实现单个纸里的均匀射，仪器中采用两块相互垂直放盟的柱面透被成光来 成形系统，对激光来进行适当的聚焦。形成被面为椭圆形的则光斑，见图23-2。 图2-2光来成形系统示意 此照射光斑印为仪器的检测区。椭圆光斑的长轴垂直于细胞藏轴线与激光束的中心轴，而 其短鞋与细胞流轴线方向一致并重叠。型的几利尺寸约为0×2m,即长轴远大于细跑的 直径，而短轴稍大于细胞的血径。这种椭四形光斑的检测区保证了祥品中细胞是一个一个分别 到光，并且每一受检细抱都受到十分一欢的光澈发。这就是中的单细胞明技术 3.细胞信号检测与分析处理系统 细思受到紫发光的丽射时，产生了细跑的放射光信号和典光信号，这些信号以被检细的为 中心向空间30°立休角发射。细放射光信号是细监对光照反射、拆射、射等综合的结果。 因此。散射光信号的波长与激发光波长致。前向散射光后号的检测器安置在澈发光束的光路
103 图 23-1 FCM 仪器原理图 1．流动室与液流驱动系统 流动室是 FCM 的核心部件。细胞样品和包裹在外的鞘液在气体正压的驱动下一起流经流 动室，其中的细胞一个一个排列成单行，逐个以相同的速度、相同的轨迹通过检测区。这就是 FCM 的单细胞流技术。 2．激发光与光束成形系统 FCM 的激发光大多采用氩离子气体激光器 488nm 谱线，它能激发多种常用的荧光素染料。 近年来，半导体激光器技术发展迅速，已开始用于 FCM。 为了实现单个细胞的均匀照射，仪器中一般都采用两块相互垂直放置的柱面透镜组成光束 成形系统，对激光束进行适当的聚焦，形成截面为椭圆形的照射光斑，见图 23-2。 图 23-2 光束成形系统示意图 此照射光斑即为仪器的检测区。椭圆光斑的长轴垂直于细胞流轴线与激光束的中心轴，而 其短轴与细胞流轴线方向一致并重叠。典型的几何尺寸约为 200×20m ，即长轴远大于细胞的 直径，而短轴稍大于细胞的直径。这种椭圆形光斑的检测区保证了样品中细胞是一个一个分别 受到光照，并且每一受检细胞都受到十分一致的光照激发。这就是 FCM 中的单细胞照明技术。 3．细胞信号检测与分析处理系统 细胞受到激发光的照射时，产生了细胞的散射光信号和荧光信号。这些信号以被检细胞为 中心向空间 360°立体角发射。细胞散射光信号是细胞对光照反射、拆射、衍射等综合的结果。 因此，散射光信号的波长与激发光波长一致。前向散射光信号的检测器安置在激发光束的光路
上，一般使用附强光冲士的光电二极芒。侧向放射光信号的检测器都使用光电倍增管，其信号 与细里的各神荧光信号·起血90~放登的透镜收集后，通过双色分束片和带通论色片等光学元 件的适当组合，送入各自的光电侣培管检器 细围的荧光伯号取读于细监茂光染色方法和所使用的茂光素染料，菜光信号一·戟较意 道常使用低呢音光电增管米粒满。由于光梁料化学的发，目能单光洛0一般全少可 接受三和不同波长的茨光信号，配有两个或两个以上激光器的则可配置里多的荧光检测器。 最新的已可测量同一细但的十多个荧光参数，光电倍增管及其电子线路将每一细胞的光信 号转换为相应的电信号，后者再酒过税数转换器（心）化为数字信号，血计算机采集、分析、 显示与存贮梦，这就是的单细范检测技术， 二、细地散射光信号测定 细型散射光信号在空间不可立体角位置的分出度是不问的。前向小角度内收集的敞射光 信号的猫端与细散的大小和细散的活力密切相关。而细散的向胶射光信兮对细徽膜、散 和枝顾的折射更敏略。其中特别是剧质内的线粒成分，细对徽发光的酸射现象并不依接任 何细胞群品的制各技术，因面，可以根君细抱放射光信号直接对未染色的新细电进行分析和分 L.前向角散射信号(Forward Scatter,简称下sC C与被测细胞的大小有关。较确切地说，是与细胞直经的平方密切科关。并且，可种到 胞释体中活细胞的前向散射光号要强于死细胞。在1实际应用中，F5C常被用于设以排 除样品中各种碎片对被测细胞的干扰。 么.制向角收射光信号(Side Seatter,简称5SC) S5C包含细胞内部结构的形态学信息，特别是细电浆中的颗松性成分，实际工作中，常用 C区分外周血样品中的淋已细监、单核细胞和中性粒细监等：在分析骨储标木时，5SC常能提 不同法血细胞系的信息，另外，当细电生理成型状态的变时，细胞内“颗粒性”发生变 化，其SSC之也会改变，例如，细散尚亡时常见其C变大（问时S因细胞脱水市减小）。 104
104 上，一般使用耐强光冲击的光电二极管。侧向散射光信号的检测器都使用光电倍增管，其信号 与细胞的各种荧光信号一起由 90°放置的透镜收集后，通过双色分束片和带通滤色片等光学元 件的适当组合，送入各自的光电倍增管检测器。 细胞的荧光信号取决于细胞荧光染色方法和所使用的荧光素染料。荧光信号一般较微弱， 通常使用低噪音光电倍增管来检测。由于荧光染料化学的发展，目前单激光器 FCM 一般至少可 接受三种不同波长的荧光信号。配有两个或两个以上激光器的 FCM 则可配置更多的荧光检测器。 最新的 FCM 已可测量同一细胞的十多个荧光参数。光电倍增管及其电子线路将每一细胞的光信 号转换为相应的电信号，后者再通过模数转换器( ADC )量化为数字信号，由计算机采集、分析、 显示与存贮等。这就是 FCM 的单细胞检测技术。 二、细胞散射光信号测定 细胞散射光信号在空间不同立体角位置的分布强度是不同的。前向小角度内收集的散射光 信号的强弱与细胞的大小和细胞的活力密切相关。而细胞的侧向散射光信号则对细胞膜、胞质 和核膜的折射更敏感，其中特别是细胞质内的颗粒成分。细胞对激发光的散射现象并不依赖任 何细胞样品的制备技术。因而，可以根据细胞散射光信号直接对未染色的活细胞进行分析和分 选。 1. 前向角散射信号 （Forward Scatter, 简称 FSC） FSC 与被测细胞的大小有关。较确切地说，是与细胞直经的平方密切相关。并且，同种细 胞群体中活细胞的前向散射光信号要强于死细胞。在 FCM 实际应用中，FSC 常被用于设阈以排 除样品中各种碎片对被测细胞的干扰。 2．侧向角散射光信号（Side Scatter, 简称 SSC） SSC 包含细胞内部结构的形态学信息，特别是细胞浆中的颗粒性成分。实际工作中，常用 SSC 区分外周血样品中的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞等；在分析骨髓标本时，SSC 常能提 供不同造血细胞系的信息。另外，当细胞生理或病理状态的改变时，细胞内“颗粒性”发生变 化，其 SSC 随之也会改变。例如，细胞凋亡时常见其 SSC 变大（同时 FSC 因细胞脱水而减小）
C与5SC组成细蓝双参散点图是目前分析中一种最常用能测量和显示方式.它能 反映年电舞体及其不同亚群形态学的有关信息。下工作中常以此来鉴别细胞醉片和细跑团块 ，并通过设阅、设门等加以排除。S汇和5C的双参数测量也常用于识别各种样品中的不 细胞亚群，如在外周血白细跑样品中区分排巴细胞、单核细电和粒细胞，或在全血样品中毁门 我出特分析的血小板群体 三、细监荧光信号划是 未经炎光染色的群品细抱在谦发光的孤射下可测到有微弱的炎光信号，称为细胞的自发关 光。心测分析的细光信号主要是指经过特异性光染色后细跑受照发射的各种特异炎 光信号。 各种特异荧光色方法是针对细电内各种不同的生化分减各种特异抗原等设计的。每 种黄光染色方法中必须用到~种成多种荧光染料。通过对细胞黄光信号的检满和定量就能得知 所研究的细胞成分咸细咆参数的存在与否和多少。问·细胞多种荧光信号的检测和定量更可进 步深入研究各种细围成分和细参数之可的相互关系，包含有富的的生物学信息 炎光染色所用的荧光素有多种多样。由干它们]分子结构不可，其炎光激发进和发射诺也名 异。不同的荧光素可用于标记同一年胞的各种分，使同时分析同一朝整的各和生物学特成 为可能。 1.荧光信号的线性测量和对数测吊 测量细胞内生化成分金量时，如细抱、、总蛋白质含量等，通常使用线性放大器 但检测细胞提表面抗尿等其它细胞参最时，常使用对最放大器，即如果原来输出是1，当输入 号大到原来的10倍时，输出为2：当输入倍号增加到原来100倍时，箱出为3等等。这是 因为各种细胞之问部见锁表面抗原的分布常相差几十倍，甚至几百倍 2.荧光光递重叠与其校正方法 用一来徽发光同时发一个细里上两种或两种以上不同荧光素时，可获取它们各自不阿 长的荧光信号，一般采用光学分来片和滤色片的适当组合，将不同波长的荧光信号送入各自的
105 FSC 与 SSC 组成细胞双参数散点图是目前 FCM 分析中一种最常用的测量和显示方式。它能 反映细胞群体及其不同亚群形态学的有关信息。FCM 工作中常以此来鉴别细胞碎片和细胞团块 等，并通过设阈、设门等加以排除。FSC 和 SSC 的双参数测量也常用于识别各种样品中的不同 细胞亚群，如在外周血白细胞样品中区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，或在全血样品中设门 找出待分析的血小板群体等。 三、细胞荧光信号测定 未经荧光染色的样品细胞在激发光的照射下可测到有微弱的荧光信号，称为细胞的自发荧 光。FCM 检测分析的细胞荧光信号主要是指经过特异性荧光染色后细胞受照发射的各种特异荧 光信号。 各种特异荧光染色方法是针对细胞内各种不同的生化成分或各种特异抗原等设计的。每一 种荧光染色方法中必须用到一种或多种荧光染料。通过对细胞荧光信号的检测和定量就能得知 所研究的细胞成分或细胞参数的存在与否和多少。同一细胞多种荧光信号的检测和定量更可进 一步深入研究各种细胞成分和细胞参数之间的相互关系，包含有丰富的的生物学信息。 荧光染色所用的荧光素有多种多样。由于它们分子结构不同，其荧光激发谱和发射谱也各 异。不同的荧光素可用于标记同一细胞的各种成分，使同时分析同一细胞的各种生物学特性成 为可能。 1．荧光信号的线性测量和对数测量 测量细胞内生化成分含量时，如细胞 DNA、RNA、总蛋白质含量等，通常使用线性放大器。 但检测细胞膜表面抗原等其它细胞参数时，常使用对数放大器，即如果原来输出是 1，当输入 信号增大到原来的 10 倍时，输出为 2；当输入信号增加到原来 100 倍时，输出为 3 等等。这是 因为各种细胞之间细胞膜表面抗原的分布常相差几十倍，甚至几百倍。 2．荧光光谱重叠与其校正方法 用一束激发光同时激发一个细胞上两种或两种以上不同荧光素时，可获取它们各自不同波 长的荧光信号。一般采用光学分束片和滤色片的适当组合，将不同波长的荧光信号送入各自的
光电格增检测器。由于月前使用的各种荧光染料剂属完发射诺性质的，虽然它们有各自不可 的发：峰值，但发射进范图都有一定的重叠，见图33，这样，在别量一种荧光信号的时促了 可整免地会进部分相邻的荧光信号。这就是多光信号测中荧光光端重叠带米能麻烦。克 服这什测量误差的最有效方法是使用荧光补层技术（有使作或软件等方式）。利用已知标准料 丛或根些细样品的生物学意义可合理设置各光号之间的相互补棕债 图23-3荧光光谱及其重叠 四、CM细监分达Ce11 Sorting)的原胜 下在高逗分析细型的问时，可根若细散多种生物学特性，将样品中特殊的细似亚群高过 度（每秒可达几千上万个细）、高纯度地◇9)分远出来。例如从件情或脐血标本中分 进出其中少量的造血干氧胞等，以供形态学、细胞功能学以及分子生物学等的适一步深入研究 这是M技术的重要功能之一 1.超声报动整 一般采用压电岗瓷品片，将其固定在流动室的顶部。压电陶瓷品片在输入电脉神的票动下 产生振动。压电瓷品片的振动号流动室的强叛动，节输入电肤冲的本可变流动室 的振动频本，此振动传递至流动室液泼喷口后又沿液道表面传指，并造成液流斯高成演。成滴 领本一般为每秒几万到十几方。在一连串均匀的液滴中只有一小部分液滴内包含有细胞，而 大邻分是不包含细胞的空白液簧。贝买将包含需分法细胞的液滴与其它液液分开，单独收集 就实现了特定细监的分这和纯化， 2,液滴充电电略
106 光电倍增管检测器。由于目前使用的各种荧光染料都属宽发射谱性质的，虽然它们有各自不同 的发射峰值，但发射谱范围都有一定的重叠，见图 23-3。这样，在测量一种荧光信号的时候不 可避免地会漏进部分相邻的荧光信号。这就是多荧光信号测量中荧光光谱重叠带来的麻烦。克 服这种测量误差的最有效方法是使用荧光补偿技术（有硬件或软件等方式）。利用已知标准样 品或根据一些细胞样品的生物学意义可合理设置各荧光信号之间的相互补偿值。 图 23-3 荧光光谱及其重叠 四、FCM 细胞分选(Cell Sorting)的原理 FCM 在高速分析细胞的同时，可根据细胞多种生物学特性，将样品中特殊的细胞亚群高速 度（每秒可达几千上万个细胞）、高纯度地（>99%）分选出来。例如，从骨髓或脐血标本中分 选出其中少量的造血干细胞等，以供形态学、细胞功能学以及分子生物学等的进一步深入研究。 这是 FCM 技术的重要功能之一。 1．超声振动器 一般采用压电陶瓷晶片，将其固定在流动室的顶部。压电陶瓷晶片在输入电脉冲的驱动下 产生振动。压电陶瓷晶片的振动导致流动室的强迫振动，调节输入电脉冲的频率可改变流动室 的振动频率。此振动传递至流动室液流喷口后又沿液流表面传播，并造成液流断离成滴。成滴 频率一般为每秒几万到十几万滴。在一连串均匀的液滴中只有一小部分液滴内包含有细胞，而 大部分是不包含细胞的空白液滴。只要将包含需分选细胞的液滴与其它液滴分开，单独收集， 就实现了特定细胞的分选和纯化。 2．液滴充电电路
包含有需要分细跑的液流只有带上净电荷后，才可能在通过高压电场时偏转。使特定 液滴荷电是在该液滴即将从液流上断离时对其充电而实现的。充电款冲可以是正歇冲，也可以 是负冲，赦充电液滴所的电荷可以是正电荷。也可是负电荷。正电荷液滴和负电荷液滴通 过同一高压醉电场时偏转方向相反，故可问时分别收集。 细型的分是在细分析的基上进行的。0对细多个参数选行分析的同时判断实 杏符合予先设置的分法参数组合范围。如果是需要分选的细散，就在该细散到达液流断离端的 即刻，由液演充电电路发出一个充电脉冲，保正包含有该细胞的液滴新离后带上净电荷 1。电高正偏转板 对偏转板安置在液流新离咸滴处的下方，带电液葡向下运动经过偏枝板之问的高压电场 时，在护电力的作用下偏离原运动迹。带正电荷的液满问电板，带复电荷的液编向正 电板。这样，包含有被分进细收的液滴就能单独进行收集。 4,分选细型的收集表置 0分选所得的组可以用试进行收集。金有自动克店器装置的M还可将分选的细散 定量地（可以是单个细胞，也可以是一定数量的年甩）自动移入96孔或24孔等培养板、 也可将分法的细监自动收集在载玻片上的阳邻位。供形态学检查。由于PC采用List Mode 数据存贮方式，站合分后的细出启养、形态学察和细胞图像分析停料，可综合单个细 更多的生物学信总 细分述的实际操作中，还必须根据样品的量、样品中目的细占总细胞数的比例、 分达纯化后细胞的用途、特别是月的御电与其余年胞在生物学特性分布范困上重叠等各种不同 情况，适当选泽各科不同的分进参题，这里主要包折分选遮度、分法纯度、分法收获率等、 如，对细电纯度要求特别高的分透工作，应近当降低分进迪度和成弃一些分进收获率，而对 些富果日标细监的研究工作可进用高分达迪度和高分达收获率方式湾 第二书FCM数抵的显示与分析Display and Analysis of Data)
107 包含有需要分选细胞的液滴只有带上净电荷后，才可能在通过高压电场时被偏转。使特定 液滴荷电是在该液滴即将从液流上断离时对其充电而实现的。充电脉冲可以是正脉冲，也可以 是负脉冲。故充电液滴所带的电荷可以是正电荷，也可是负电荷。正电荷液滴和负电荷液滴通 过同一高压静电场时偏转方向相反，故可同时分别收集。 细胞的分选是在细胞分析的基础上进行的。FCM 对细胞多个参数进行分析的同时判断其是 否符合予先设置的分选参数组合范围。如果是需要分选的细胞，就在该细胞到达液流断离端的 即刻，由液滴充电电路发出一个充电脉冲，保证包含有该细胞的液滴断离后带上净电荷。 3．静电高压偏转板 一对偏转板安置在液流断离成滴处的下方，带电液滴向下运动经过偏转板之间的高压电场 时，在静电力的作用下偏离原运动轨迹。带正电荷的液滴偏向负电板，带负电荷的液滴偏向正 电板。这样，包含有被分选细胞的液滴就能单独进行收集。 4．分选细胞的收集装置 FCM 分选所得的细胞可以用试管进行收集。配有自动克隆器装置的 FCM 还可将分选的细胞 定量地（可以是单个细胞，也可以是一定数量的细胞）自动移入 96 孔或 24 孔等培养板。FCM 也可将分选的细胞自动收集在载玻片上的相邻位置，供形态学检查。由于 FCM 采用 List Mode 数据存贮方式，结合分选后的细胞培养、形态学观察和细胞图像分析等资料，可综合单个细胞 更多的生物学信息。 FCM 细胞分选的实际操作中，还必须根据样品的量、样品中目的细胞占总细胞数的比例、 分选纯化后细胞的用途、特别是目的细胞与其余细胞在生物学特性分布范围上重叠等各种不同 情况，适当选择各种不同的分选参数，这里主要包括分选速度、分选纯度、分选收获率等。例 如，对细胞纯度要求特别高的分选工作，应适当降低分选速度和放弃一些分选收获率，而对一 些富集目标细胞的研究工作可选用高分选速度和高分选收获率方式等。 第二节 FCM 数据的显示与分析(Display and Analysis of Data)
可快速测量胞大群体中一个细胞的多个数。如果每个细有五个效，测量 10,00个细胞，就能获得5M.000个数据、月武CM多参数测量一般采用List Vode的数据行 贮方式。Lit方式就是用表格的方式将每一个被测细的众多原始温最数据全部记录下 米，咸为个数据文件。它保存了测成过程中所有的信息，并且方便今后的数据加工、处理、 显示和问等。 一、参致 快遮分析量细跑形态学特征和细胞各科生将学特性，每一种测量信号就是一个数 月前心M一般至少有两个散射光卷数和三个荧光态数（绿色荧光、橙色荧光和红色荧光）， 改射光套数包括细前向放射光信号S0)和细测向放射光信号60。细胞荧光餐数是 通过不同荧光探针的标记来检则细胞内各种生化成分或各种特异抗原，随著下技术的发展， 现己可问时分析满量问·细啦的十几种生物学参数，并由细也或光相对黄测量发展到绝对值割 二、数据显示方式 L1tM0d方式的数据文件保行的信息量大，并客品进一步加工、处理和调等，现已发 展了多种图形显示方式可直现获得其中包含的众多生物学信皂。 1.单参致测量数据的尿示和分析 多个测量专数中每一专数的测量数据都可整理为其统计分布，以分布直方图 《distributicn his1ogra)来显示，见图2-4.图中横轴为该参最测量强废和对恤，单位 是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对最的。图的轴一般是细胞数或细跑出现的须
108 FCM 可快速测量细胞大群体中每一个细胞的多个参数。如果每个细胞有五个参数，测量 10,000 个细胞，就能获得 50,000 个数据。目前 FCM 多参数测量一般采用 List Mode 的数据存 贮方式。List Mode 方式就是用表格的方式将每一个被测细胞的众多原始测量数据全部记录下 来，成为一个数据文件。它保存了测量过程中所有的信息，并且方便今后的数据加工、处理、 显示和调阅等。 一、参数 FCM 快速分析测量细胞形态学特征和细胞各种生物学特性，每一种测量信号就是一个参数。 目前 FCM 一般至少有两个散射光参数和三个荧光参数（绿色荧光、橙色荧光和红色荧光）。 散射光参数包括细胞前向散射光信号(FSC)和细胞测向散射光信号(SSC)。细胞荧光参数是 通过不同荧光探针的标记来检测细胞内各种生化成分或各种特异抗原。随着 FCM 技术的发展， 现已可同时分析测量同一细胞的十几种生物学参数，并由细胞荧光相对值测量发展到绝对值测 量。 二、数据显示方式 List Mode 方式的数据文件保存的信息量大，并容易进一步加工、处理和调阅等，现已发 展了多种图形显示方式可直观获得其中包含的众多生物学信息。 1. 单参数测量数据的显示和分析 细胞多个测量参数中每一参数的测量数据都可整理为其统计分布，以分布直方图 ( distribution histogram ) 来显示，见图 21-4。图中横轴为该参数测量强度相对值，单位 是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。图的纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数
图234华参数测分布直方图 A.线性分布直方图B.对数分布直方图 图234植为一增细地萨体的细鱼N1含量分布查方图。可以看到图中的较低道数上和较 离道数上各有一个分峰，各代表一样含品基本致的细慰位于高道数上的细实测 含最正好是位于低道数上的细散W雕含量的两倍。在这两群纽散之间，还有一些含量莲封 变化的闻胞。分布直方图中的第一个峰是由其中的G,细胞群组成，而第二个峰由为/M到 抱群组成。两峰中间连续分布的区城由各阶段5期细胞群组成。从分布曲线可了解各期细所 占的比率，并估计其帕殖能力，在年电榄表面抗原检测碎研究中，从单参数荧光强度分布直方 图上可以直现了解闭性衣达细监样是否存在、所占比率及抗原表农达的强两等见图23B。 单参数分布直方图的设区分析是数居分析中最简单的一种方法，即在直方图X轴上网 定若干区城的始术座标值，分析纹作就可湿示和打印出各以中细型数目及其百分比值，该参划 的测最平均值、中植、标雅差和变护系数等计数。 2.双参数测量数据的显示和分析 年参数直方图表示的是一个测量餐数与细跑数量之河的分布关系，双数显示不仅能供 两个酸数各自与细监数量的关系，更重要的是获得这两个餐数之何的相关关系，包含众多的生 学信恩. 双参最数据示最常用的是二的点图(Dot Plot).小在二图上，X轴代未站一个 量泰数。Y辅代表纳二个测量态数。图中每一个点代表一个胞，此点的x荆坐标效为该细胞 一最的测量，而其Y轴坐标值为该细炮第二数的测量值，见图125。 图235Wrd0二维的版点 109
109 图 23-4 细胞单参数测量分布直方图 A.线性分布直方图 B.对数分布直方图 图 23-4A 为一增殖细胞群体的细胞 DNA 含量分布直方图。可以看到图中的较低道数上和较 高道数上各有一个分布峰，各代表一群 DNA 含量值基本一致的细胞。位于高道数上的细胞其 DNA 含量正好是位于低道数上的细胞 DNA 含量的两倍。在这两群细胞之间，还有一些 DNA 含量连续 变化的细胞。分布直方图中的第一个峰是由其中的 G0/G1 细胞群组成，而第二个峰由为 G2/M 细 胞群组成。两峰中间连续分布的区域由各阶段 S 期细胞群组成。从分布曲线可了解各期细胞所 占的比率，并估计其增殖能力。在细胞膜表面抗原检测等研究中，从单参数荧光强度分布直方 图上可以直观了解阳性表达细胞群是否存在、所占比率及抗原表达的强弱等, 见图 23-4B。 单参数分布直方图的设区分析是 FCM 数据分析中最简单的一种方法，即在直方图 X 轴上确 定若干区域的始末座标值，分析软件就可显示和打印出各区中细胞数目及其百分比值，该参数 的测量平均值、中值、标准差和变异系数等统计数据。 2. 双参数测量数据的显示和分析 单参数直方图表示的是一个测量参数与细胞数量之间的分布关系。双参数显示不仅能提供 两个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得这两个参数之间的相关关系，包含众多的生 物学信息。 双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，X 轴代表第一个测 量参数，Y 轴代表第二个测量参数。图中每一个点代表一个细胞，此点的 X 轴坐标值为该细胞 第一参数的测量值，而其 Y 轴坐标值为该细胞第二参数的测量值，见图 12-5。 图 23-5 DNA/BrdU 二维的散点图
双参数显示还可有等高线轮咏图、密度图和三排立休显示等，见图26和图2器-7， 图236等高线显示图 图23-7三维立体显示图 图23-5、图236和图23-7丛同一样品测量数据的不同显示方式。在F0分析中，形杰与 结构相似、具各相同功能的细拉群体其测量值总是相近的、这些组电在单参数直方阁上以一个 分布峰出现，在双数版点图上，测量值相近或离散的细胞样总表现为放点的集或稀疏，这 在符高纹轮密图上可用不同颜色或标有不同细监数的各种尚线轮心来表示，轻始线水平可按线 性或对数分布，也可达择显示阀和显示间隔等以去除一些背碎片成充分示样品的某些细 节。双参数密度图与双参数放点图类似，它是用不问的色彩米显示不问的细胜数。 双参数三推立体最示其X轴和Y细分判代表细型二个不问的测量参数，而Z拍为细型数 也称为“假三维”品示。这种是示根直现，它与等高线轮廊图的关系类似于甲上立体形 图与等高线地图的关系，见图23-7。测量效值相近的细电#表现为一座座高低不等的“峰”， 立体显示有时会有立休重叠地盖的情况。计算机作可方便地从任何不同立体角度显示同双 数数品，现其中包含的每·个组书， 在W或据显示中，要记任细胞结构和细胞功能相同的细胞业群总表现为集中分布的趋势 不的御胞亚群有其各自的分布区板。这样就很音易用设1分区的方法将各银更群分别圈出 后进行数君处理，主买包各细胞亚严在总群体中所占的百分比，每亚群细跑的X参数和Y参 数的均值、标准差、变异系数等等 3.多餐数测量数据的显示和分析 要在单一图上同时显示众多的测量参数，全面反映样品的生物学信息是不可能的。 际工作中是丹若个分布直方图和各种不同组合的双参数数据显示米反映的。多参数测一个 重要意义是通过有关参数进行”设门广分析(8 ating analysis),可以是单参数设门，也可以是
110 双参数显示还可有等高线轮廓图、密度图和三维立体显示等，见图 23-6 和图 23-7 。 图 23-6 等高线显示图 图 23-7 三维立体显示图 图 23-5、图 23-6 和图 23-7 是同一样品测量数据的不同显示方式。在 FCM 分析中，形态与 结构相似、具备相同功能的细胞群体其测量值总是相近的。这些细胞在单参数直方图上以一个 分布峰出现。在双参数散点图上，测量值相近或离散的细胞群总表现为散点的密集或稀疏，这 在等高线轮廓图上可用不同颜色或标有不同细胞数的各种曲线轮廓来表示。轮廓线水平可按线 性或对数分布，也可选择显示阈值和显示间隔等以去除一些背景碎片或充分揭示样品的某些细 节。双参数密度图与双参数散点图类似，它是用不同的色彩来显示不同的细胞数。 双参数三维立体显示其 X 轴和 Y 轴分别代表细胞二个不同的测量参数，而 Z 轴为细胞数， 故也称为“假三维”显示。这种显示很直观，它与等高线轮廓图的关系类似于地理上立体地形 图与等高线地图的关系，见图 23-7。测量数值相近的细胞群表现为一座座高低不等的“山峰”， 立体显示有时会有立体重叠遮盖的情况。计算机软件可方便地从任何不同立体角度显示同一双 参数数据，观察其中包含的每一个细节。 在 FCM 数据显示中，要记住细胞结构和细胞功能相同的细胞亚群总表现为集中分布的趋势； 不同的细胞亚群有其各自的分布区域。这样就很容易用设门分区的方法将各细胞亚群分别圈出 后进行数据处理，主要包括各细胞亚群在总群体中所占的百分比，每亚群细胞的 X 参数和 Y 参 数的均值、标准差、变异系数等等。 3. 多参数测量数据的显示和分析 要在单一图上同时显示 FCM 众多的测量参数，全面反映样品的生物学信息是不可能的。实 际工作中是用若干个分布直方图和各种不同组合的双参数数据显示来反映的。多参数测量一个 重要意义是通过有关参数进行"设门"分析( gating analysis )。可以是单参数设门，也可以是