温州医学院文本沉淀反应_临床免疫学检验第十六章.doc_大学文库

第十六章沉淀反应 Precipitation 要点沉淀反应的概念絮状沉淀试验测定抗原抗体的最适比单向琼脂扩散试验原理及影响因素双向琼脂扩散试验原理及应用免疫电泳、火箭免疫电泳、对流免疫电泳、免疫固定电泳的原理速率散射免疫比浊法原理、影响因素与应用沉淀反应（precipitation）是指可溶性的抗原和抗体特异性结合后，所形成的复合物以沉淀的形式出现。沉淀反应是一个古老的血清学试验，早在 1897 年 Kraus 就发现，鼠疫杆菌的培养滤液能与相应抗血清发生沉淀反应。1905 年 Bechhold 在凝胶介质中进行了免疫沉淀反应。1946 年 Oudin 用试管单扩散技术进行抗原抗体测定。1965 年 Mancini 建立了单向免疫扩散技术，可定量测定液体中的免疫球蛋白。20 世纪 70 年代免疫浊度法的出现，使沉淀反应适应了现代测定快速、微量和自动化的要求，开创了免疫化学定量检测的新纪元。根据试验中使用的介质和检测方法不同，沉淀反应可分为液体内沉淀反应和凝胶内沉淀反应两种类型。第一节液体内沉淀试验（Precipitation in Liquer）沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原、抗体特异性结合反应，可在几秒钟到几十秒钟内完成，出现可溶性小复合物，但不可见。在免疫比浊法中可测定免疫复合物形成的速率，称速率比浊；第二阶段形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时完成，如通常可见的沉淀线、沉淀环。在免疫浊度测定中反应经过一定时间后来测量形成复合物的量，称终点比浊。一、絮状沉淀试验絮状沉淀试验是将抗原、抗体溶液混合，在适量电解质存在的条件下，抗原与抗体结合形成絮状沉淀物。该试验受抗原和抗体比例的影响较明显，常用于测定抗原抗体反应的最适比。（－）抗原稀释法

抗体稀抗原稀释度释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/12对黑 11/5 ++件 +44 +4 1/10 + ++ + 1/20 + +++ + 1/40 1/80 + 从表162可以看出，方阵法可较正确地找出抗原与抗体的最适比。如抗体用1：0，抗原则按1： 320稀释：如抗原是1：160，抗体则用1：20为最恰当，二、环状沉淀试验环状沉淀试验是Ascoli于1902年建立的，其方法是：先将抗血清加人内径1.5一2m小玻管中，约装1/3高度。再用细长滴管沿管度叠加抗原溶液。如有相对应的抗原和抗体，室温10如至数小时后，在两液交界处可出现白色环状沉淀。环状试验中抗原、抗体溶液须澄清。该试验主要用于鉴定微量抗原，如法医学中鉴定血迹，道行病学用于检查媒介县虫体内的微量抗原等，亦可用于鉴定细南多糖抗原。该技术敏感皮低，且不能作两种以上抗原的分析鉴别，现已少用。第二节凝胶内沉淀试验 (Precipitation in Gel) 凝胶内沉淀试验是以适宜浓度的琼霜（或琼脂糖）凝胶作为介凝，可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩酸，形成浓度悦度，在抗原与抗体比例适当的位置出现肉限可见的沉淀环减沉淀线。瑰脂凝取含水量在8%以上，凝胶形成网络，将水分固相化，因此可将凝胶视为一种国相化的液体。可溶性抗原和抗体分子在凝胶内扩散，魏如在液体中自由运动。但抗原与相应抗体结合后，形成的大分子复合物测鼓网络固定于凝胶内。盐水浸泡后能去除游离的抗原成抗体，可将瑰脂凝取干提后进行染色分析，井可长期保存。根据试验时抗原与抗体反应的方式和特性，分为单向免疫扩散试单，双向免疫扩散试验，以及与电泳技术结合的免疫电泳、对流免疫电冰和火箭电袜等《洋见第三节)。一、单向家雕扩散试验本试验是在琼霜胶中混人一定量抗体，使特测的抗原溶液从同部向琼扇内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。根据试验形式可分为试管法和平板法两种。 (一)试管法

抗体稀释度抗原稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/12 对照 11/5 + ++ +++ +++ ++ + + - - 1/10 + ++ ++ ++ +++ ++ + - - 1/20 + + ++ ++ +++ ++ + - - 1/40 - + + + ++ +++ ++ + - 1/80 - - - - + + + + - 从表 16-2 可以看出，方阵法可较正确地找出抗原与抗体的最适比。如抗体用 1：40，抗原则按 1： 320 稀释；如抗原是 1：160，抗体则用 1：20 为最恰当。二、环状沉淀试验环状沉淀试验是 Ascoli 于 1902 年建立的，其方法是：先将抗血清加人内径 1.5～2mm 小玻管中，约装 1／3 高度，再用细长滴管沿管壁叠加抗原溶液。如有相对应的抗原和抗体，室温 10min 至数小时后，在两液交界处可出现白色环状沉淀。环状试验中抗原、抗体溶液须澄清。该试验主要用于鉴定微量抗原，如法医学中鉴定血迹，流行病学用于检查媒介昆虫体内的微量抗原等，亦可用于鉴定细菌多糖抗原。该技术敏感度低，且不能作两种以上抗原的分析鉴别，现已少用。第二节凝胶内沉淀试验（Precipitation in Gel）凝胶内沉淀试验是以适宜浓度的琼脂（或琼脂糖）凝胶作为介质，可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体比例适当的位置出现肉眼可见的沉淀环或沉淀线。琼脂凝胶含水量在 98％以上，凝胶形成网络，将水分固相化，因此可将凝胶视为一种固相化的液体。可溶性抗原和抗体分子在凝胶内扩散，犹如在液体中自由运动。但抗原与相应抗体结合后，形成的大分子复合物则被网络固定于凝胶内。盐水浸泡后能去除游离的抗原或抗体，可将琼脂凝胶干燥后进行染色分析，并可长期保存。根据试验时抗原与抗体反应的方式和特性，分为单向免疫扩散试验，双向免疫扩散试验，以及与电泳技术结合的免疫电泳、对流免疫电泳和火箭电泳等（详见第三节）。一、单向琼脂扩散试验本试验是在琼脂胶中混人一定量抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。根据试验形式可分为试管法和平板法两种。（－）试管法

该方法由0udin于195年报道。将抗血清混入约50℃的07%琼带糖溶液中，注入小口径试管内，特凝州后，在其上面叠加抗原溶液，抗原可自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当的位置形成沉淀环。在黑色背景斜射光照射下，极导观察这种白色不透明沉淀带。试管法沉淀环的数目和彩态受抗冢和抗体性质的影响较大，普多用于排准物和组织匀浆中的细菌、寄生虫、螺旋体等抗原的检测，现已少用。 (二)平板法此法由cii于1965年提出，是一种简便、易行的抗原定量技术。先将抗体如入浆新凝胶中混匀，制成含抗体的琼霜板，。然后于琼脂板上打孔，孔中如入一定量的特测抗原。由于抗体已与琼扇凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四圆扩散。结果在小孔周围出现可见的沉淀环（图1好-1），其大小与抗原量景正相美。由于试验中抗原向四周扩散，故又称单向辐射状免疫扩酸(single radial immunodiffusion,SID). 图161单向招射状免投扩晒在检测标本的月时，用已知含量的标准抗原作5一了个稀释度，同时测量沉淀环的大小，制做标准曲线。扩散后沉淀环直径咸面积的大小与抗原量相关，但这种相关是对数关系，而不是直线相关，同时，沉淀环的大小还与分子量和扩散时间有关。抗原含量与环径的关系有两种计算方法： 1,ae1l曲线适用于大分子抗原和长时间扩散(>48阶)的结果处理，扩散环直径的平方与抗星流度显线性关系（图16-2》。即：C/k(C=抗原浓度，d=沉淀环直径。=常数）。使用普通坐标纸作图。细16-2 Mancini自☒ 2.下ey曲线这种曲战适用千小分子抗原和较短时阿(24h)扩散的结果处理。浓度的对数与扩散环直径之间星线性关系（图16-3）。即：1©C/K(C=抗眼沫度，d=沉淀环直径，K=常数)，使用半对数纸作图。图16-3 Fahey由理 (三)影响因素单向琼脂免疫扩肚法作为抗原的定量方法，设备条件要求简单，试剂导得，方法稳定。常用于多种血浆蛋白的测定，除琼脂凝胶等一般试剂外，具备如下条件，即可开展SRD定量测定：①具有仅针对

该方法由 Oudin 于 1946 年报道。将抗血清混入约 50℃的 0.7％琼脂糖溶液中，注入小口径试管内，待凝固后，在其上面叠加抗原溶液，抗原可自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当的位置形成沉淀环。在黑色背景斜射光照射下，极易观察这种白色不透明沉淀带。试管法沉淀环的数目和形态受抗原和抗体性质的影响较大，曾多用于排泄物和组织匀浆中的细菌、寄生虫、螺旋体等抗原的检测，现已少用。（二）平板法此法由 Mancini 于 1965 年提出，是一种简便、易行的抗原定量技术。先将抗体加入琼脂凝胶中混匀，制成含抗体的琼脂板，然后于琼脂板上打孔，孔中加入一定量的待测抗原。由于抗体已与琼脂凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散。结果在小孔周围出现可见的沉淀环（图 16-1），其大小与抗原量呈正相关。由于试验中抗原向四周扩散，故又称单向辐射状免疫扩散（single radial immunodiffusion，SRID）。图 16-1 单向辐射状免疫扩散在检测标本的同时，用已知含量的标准抗原作 5～7 个稀释度，同时测量沉淀环的大小，制做标准曲线。扩散后沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关，但这种相关是对数关系，而不是直线相关，同时，沉淀环的大小还与分子量和扩散时间有关。抗原含量与环径的关系有两种计算方法： 1．Mancini 曲线适用于大分子抗原和长时间扩散（＞48h）的结果处理，扩散环直径的平方与抗原浓度呈线性关系（图 16-2）。即：C／d 2 =K（C=抗原浓度，d=沉淀环直径，K=常数）。使用普通坐标纸作图。图 16-2 Mancini 曲线 2．Fahey 曲线这种曲线适用于小分子抗原和较短时间（24h）扩散的结果处理。浓度的对数与扩散环直径之间呈线性关系（图 16-3）。即：logC／d=K（C=抗原浓度，d=沉淀环直径，K=常数）。使用半对数纸作图。图 16-3 Fahey 曲线（三）影响因素单向琼脂免疫扩散法作为抗原的定量方法，设备条件要求简单，试剂易得，方法稳定。常用于多种血浆蛋白的测定。除琼脂凝胶等一般试剂外，具备如下条件，即可开展 SRID 定量测定：①具有仅针对

某特测抗原的单价转异性抗血清：②己知含量的标准品：③特测品含量在1，驾μg/以上（单向瑰脂免疫扩散技术的敏感度)。试验中以下影响因素也应注意： 1,抗血清要求疑和力强，特异性好和效价高。 2。标准曲线应随每次测定同时制作，不可一次做成。长期应用。每次测定还需加测质控血清，以保证定量的准确性 3。有时出现扩散图呈两重沉淀环的双环现象，这是由千出现了抗原性相同，但扩敬率不同的两个组分，如a重链病血清中合a重链和正常1A,与多老抗【以反应，就形成内外两重环。 4.单克隆抗体的结合价单一，用此抗体测定正常人的多态性抗原。则抗体相对过到，使沉淀国的直径变小，测量值降低。反之如用多克隆抗体测定单克隆病（蛋白），则抗原相对过剩（单一抗原决定簇成分)，致使沉淀圈呈不相关的扩大，从而造成某一成分的伪性增加： 5。操作中还应注意：①保持加样孔完整，以免沉淀环不规则：②浇注凝胶版时要保持台面水平，使凝敢板厚薄均匀：③打孔后桃取瑰脂栓时，且勿将胶板挑起，防止检样在孔底流溢，④扩散时政置免疫琅脂板的提盘必策保持水平位，以南止沉淀环偏心：二、双向琼霸扩散试验将抗原与抗体分别加入察脂板相对应的小孔中，二者互相扩股，在比例近当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析，常用于抗原和抗体的纯度鉴定。此法亦可用于免疫血清抗体效价测定。 (一)试管法试管法由0k1εy首先报道。先在试管中如入含抗体的琼霜，概圆后在中间加一层普通琼脂，冷却后将抗原液体叠加到上层，收置后，下层的抗体和上层的抗原向中间琼图层内自由扩散，在抗原与抗体沫度比例恰当处形成沉淀线。此法在实际工作中极少应用。 (二)平板法平板法由0ucht©rlcy首先所采川。是抗原抗体鉴定的最基木方法之一，测定时将加热融化的琼霜观瑰所糖浇至平■内或玻片上，待媒脂凝固后，在碑脂胶板上相距3一5■成对打孔，在相对的孔中分别加入抗冢或抗体，置室温或37℃18一2h后，凝胶中各白扩收的抗原和抗体可在浓度比侧适当处形成可见的沉淀线（图16-4）：图16-4双向浆面扩广收示意图根据沉淀线形态和位置等的分析，双向免疫扩散试验可应用于：

某待测抗原的单价特异性抗血清；②已知含量的标准品；③待测品含量在 1.25μg／ml 以上（单向琼脂免疫扩散技术的敏感度）。试验中以下影响因素也应注意。 1．抗血清要求亲和力强、特异性好和效价高。 2．标准曲线应随每次测定同时制作，不可一次做成，长期应用。每次测定还需加测质控血清，以保证定量的准确性。 3．有时出现扩散圈呈两重沉淀环的双环现象，这是由于出现了抗原性相同，但扩散率不同的两个组分，如α重链病血清中含α重链和正常 IgA，与多态抗 IgA 反应，就形成内外两重环。 4．单克隆抗体的结合价单一，用此抗体测定正常人的多态性抗原，则抗体相对过剩，使沉淀圈的直径变小，测量值降低。反之如用多克隆抗体测定单克隆病（M 蛋白），则抗原相对过剩（单一抗原决定簇成分），致使沉淀圈呈不相关的扩大，从而造成某一成分的伪性增加。 5．操作中还应注意：①保持加样孔完整，以免沉淀环不规则；②浇注凝胶板时要保持台面水平，使凝胶板厚薄均匀；③打孔后挑取琼脂栓时，且勿将胶板挑起，防止检样在孔底流溢；④扩散时放置免疫琼脂板的湿盒必须保持水平位，以防止沉淀环偏心。二、双向琼脂扩散试验将抗原与抗体分别加入琼脂板相对应的小孔中，二者互相扩散，在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析，常用于抗原和抗体的纯度鉴定。此法亦可用于免疫血清抗体效价测定。（一）试管法试管法由 Oakley 首先报道。先在试管中加入含抗体的琼脂，凝固后在中间加一层普通琼脂，冷却后将抗原液体叠加到上层。放置后，下层的抗体和上层的抗原向中间琼脂层内自由扩散，在抗原与抗体浓度比例恰当处形成沉淀线。此法在实际工作中极少应用。（二）平板法平板法由 Ouchterlony 首先所采用，是抗原抗体鉴定的最基本方法之一。测定时将加热融化的琼脂或琼脂糖浇至平皿内或玻片上，待琼脂凝固后，在琼脂胶板上相距 3～5mm 成对打孔，在相对的孔中分别加入抗原或抗体，置室温或 37℃18～24h 后，凝胶中各自扩散的抗原和抗体可在浓度比例适当处形成可见的沉淀线（图 16-4）。图 16-4 双向琼脂扩散示意图根据沉淀线形态和位置等的分析，双向免疫扩散试验可应用于：

1.抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估算出现沉淀线，表明存在相应的抗原和抗体，不出现沉淀线则表明抗原成抗体的缺乏，沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线拿近抗原孔，提示抗体含量高：靠近抗体孔，提示抗原含量较多，出现多条沉淀城，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，双向免度扩散可用于鉴定抗原或抗体的纯度。 2,分析抗原成抗体的相对分子量抗原或抗体在琼脂内扩散的速度受分子量的影响。分子量大扩散慢，扩散圈小，局部浓度则较大。因此形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如二者分子量相等。则形成直线（图16-5）。抗体多为IG,分子量约150kD,据此可相略估计未知抗原的分子量：图1行5蔬原抗体相对分子量示意正 3。用于抗原性质的分析两种受检抗原的性质可完全相同、都分相同或完全不月。在一块琼脂板上打三个孔，二个孔中加入抗原。一个孔中加入抗体，扩散后通过沉淀线的形态可鉴定两种抗原的性质 (图16一6)。这种技术作为抗原的分析，是免疫化学中较常用的鉴定技术之一，图166抗泉性顺分新示意图 4,用于抗体效价的滴定双向扩散技术是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗源的浓度。稀释抗体：或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。双向免疫扩散试验的核式领多（图1仔），可积据需要灵话选择，也可自行设计。在测定未知抗原和抗体或检查其纯度时，可透川二个几的模式：在比较两种抗原异同时，应遗用三个孔的模式，而在半定量滴定抗血清效价封，通常选梅花样多孔榄式：国16-了双向免疫扩护敢试险常用模式第三节免疫电故技术 (Immunoelectrophoresis Technique) 免疫电读技术(imunoelectrophoresis techn1que)是将免疫扩散和电汰相结合的一种免疫学分析技术，由Grabar与i11ias于1防3年创立，此项技术由于既有抗原抗体反应的高度特异性，又有电冰分离技术的快速，灵敏和高分拼力，至今仍是免疫学的一项基本技术，广泛应用于生物医学领域：数十年米，根据不同的实验目的和要求，在经典的免度电林技术基陆上，又派生出根多新的技术和方法

1．抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估算出现沉淀线，表明存在相应的抗原和抗体，不出现沉淀线则表明抗原或抗体的缺乏。沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量高；靠近抗体孔，提示抗原含量较多。出现多条沉淀绒，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，双向免疫扩散可用于鉴定抗原或抗体的纯度。 2．分析抗原或抗体的相对分子量抗原或抗体在琼脂内扩散的速度受分子量的影响。分子量大扩散慢，扩散圈小，局部浓度则较大，因此形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如二者分子量相等，则形成直线（图 16-5）。抗体多为 IgG，分子量约 150kD，据此可粗略估计未知抗原的分子量。图 16-5 抗原抗体相对分子量示意图 3．用于抗原性质的分析两种受检抗原的性质可完全相同、部分相同或完全不同。在一块琼脂板上打三个孔，二个孔中加入抗原，一个孔中加入抗体，扩散后通过沉淀线的形态可鉴定两种抗原的性质（图 16-6）。这种技术作为抗原的分析，是免疫化学中较常用的鉴定技术之一。图 16-6 抗原性质分析示意图 4．用于抗体效价的滴定双向扩散技术是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。双向免疫扩散试验的模式颇多（图 16-7），可根据需要灵活选择，也可自行设计。在测定未知抗原和抗体或检查其纯度时，可选用二个孔的模式；在比较两种抗原异同时，应选用三个孔的模式，而在半定量滴定抗血清效价时，通常选梅花样多孔模式。图 16-7 双向免疫扩散试验常用模式图第三节免疫电泳技术（Immunoelectrophoresis Technique）免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique）是将免疫扩散和电泳相结合的一种免疫学分析技术，由 Grabar 与 Williams 于 1953 年创立，此项技术由于既有抗原抗体反应的高度特异性，又有电泳分离技术的快速，灵敏和高分辨力，至今仍是免疫学的一项基本技术，广泛应用于生物医学领域。数十年来，根据不同的实验目的和要求，在经典的免疫电泳技术基础上，又派生出很多新的技术和方法

一、免疫电冰免疫电袜(imnoelectrophoresis,IP)是将区带电沐与双向免疫扩散相站合的一种免疫化学分析技术。其基本原理是将蛋白质抗原在琼粉糖凝胶上进行电泳，样品中不同的抗原成分因所带电背、分子量及构型不同，电冰迁移率各异，而被分离成肉展不可见的若干区蒂。停止电辣后，在与电袜方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫扩散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琅眉中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉限可见的弧形沉淀线（图1好-8》。根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标雀（或正常）抗原、抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分的种类及其性质进行分析、鉴定。图16一8免疫电冰原耳示意图免疫电冰沉淀线的数目和分端率受许多因薰影响。如抗原与抗体的比例、抗血请的抗体话《多具动物混合抗血清较好)、电沐条件（如缓冲液、琼脂和电泳）等皆可直接影响沉淀线的分讲率。对于免疫电袜的分析，重要的是经验的积黑。只有多看，多对比分析，才能做出恰当的结论。免技电泳为定性试验，目前主要应用于纯化抗冢和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的机别，鉴定等方面。二、火管免夜电辣火黄免疫电冰(rocket immnoelectrophoresis,RIE)是将单向免疫扩散和电冰相结合的一种定量检测技术。其基本原理是：电冰时，含于琼雕凝胶中的抗体不发生移动，面样品孔中的抗原在电场的作用下向正极泳动，并与豫脂中的抗体发生反应。当二者达到适当比例时。即形成一个状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰（图16-9）。峰的高度与检样中的抗原浓度景正相美。用已知量标准抗原作对盟，绘制标准曲战。根据样品的沉淀峰长度即可计算出特测抗原的含量。反之，当琼霜中抗原浓度固定时，便可测定特检抗体的含量《即反向火簧免夜电袜)，图169火箭免薇电球沉淀峰示意图火蕾免疫电沐操作时应注意以下儿点： 1,沉淀峰应坚圆推状。如峰懒端星不清渐的云雾状或圆形，提示电冰未达终点：沉淀峰直达电沐板边锋。且未见峰尖。呈“烈肉”状，提示抗原含量过高，应稀释后重测。 2.所用琼脂要遗择无电渗域电海很小的，香则火箭形状不规测：

一、免疫电泳免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）是将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术。其基本原理是将蛋白质抗原在琼脂糖凝胶上进行电泳，样品中不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异，而被分离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后，在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫扩散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线（图 16-8）。根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准（或正常）抗原、抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分的种类及其性质进行分析、鉴定。图 16-8 免疫电泳原理示意图免疫电泳沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响。如抗原与抗体的比例、抗血清的抗体谱（多只动物混合抗血清较好）、电泳条件（如缓冲液、琼脂和电泳）等皆可直接影响沉淀线的分辨率。对于免疫电泳的分析，重要的是经验的积累，只有多看，多对比分析，才能做出恰当的结论。免疫电泳为定性试验，目前主要应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别、鉴定等方面。二、火箭免疫电泳火箭免疫电泳（rocket immnoelectrophoresis，RIE）是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。其基本原理是：电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而样品孔中的抗原在电场的作用下向正极泳动，并与琼脂中的抗体发生反应，当二者达到适当比例时，即形成一个状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰（图 16-9）。峰的高度与检样中的抗原浓度呈正相关。用已知量标准抗原作对照，绘制标准曲线，根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量。反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待检抗体的含量（即反向火箭免疫电泳）。图 16-9 火箭免疫电泳沉淀峰示意图火箭免疫电泳操作时应注意以下几点： 1．沉淀峰应呈圆锥状，如峰前端呈不清晰的云雾状或圆形，提示电泳未达终点；沉淀峰直达电泳板边缘，且未见峰尖，呈“烟囱”状，提示抗原含量过高，应稀释后重测。 2．所用琼脂要选择无电渗或电渗很小的，否则火箭形状不规则

3,标本数量多时，电汰板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小》后再加样，因加样与开始电袜之间的间隔时间太长，可形成短的宽基底沉淀峰，使定量不准。 4。作1、S1A等定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火薇峰因电渗景纺锤状。影响结果测定。为了纠正这种现象，可先将待检血清用含0.1戊二靡成2,85%甲征的电冰缓冲液稀释（甲酰化），使本来梦两性电荷的1G变为只带负电荷，加快了泳向正极的速度。瓢消了电渗作用，形成神向阳极的火箭峰。火管电泳作为抗原定量只能测定μ风/■以上的含量。将收射自显影技术与火箭电达结合起来，可明显提高火箭电沐的灵饭度。火箭电冰时加入少量1标记的标准抗原共同电辣，经洗涤干燥后，用x 线胶片显影，可出现敏射性显影，根据自显影火箭峰降低的程度〔竞争法)可计算出抗原的浓度。放射免疫自显影技术可测出/！的抗原：三、对流免夜电林对流免疫电沫(counter inmunoelectrophoresis,CIE伊)是双向免疫扩散与电沐相结合的定向加速的免技扩散技术。大留分蛋自质抗原在碱性溶液中蒂负电荷，电球时从负极向正极林动，向抗体【G 分子量大，星露的极性基团较少，在缓冲液中解离的也少，向正极的读动速度较慢，电袜时由电渗引向负极的液流速度超过了【G向正极的泳动，带动抗体向负极移动，这样就使抗原和抗体定向对流并发生反应，出现肉龈可见的沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的白由扩散。使其定向袜动，因面增加了试验的灵敏度（比双向扩散法高8一16倍），并缩短了反应时间。实验时在琼霜板上打两排孔，左侧各孔加入特测抗原，右侧孔内成人相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，带负电荷的抗原冰向阳极抗体侧，而抗体猪电渗作用流向阴极抗原侧，在两者之间减抗体的另一侧（抗原过量时》形成沉淀线（图169）。图16-10对流免疫电冰示意图 1G的4个亚型在电冰时有不月的表现，1g3和1gG4与一般蛋白质一样，读向阳极：而11和1gG2 则因其带电荷少，受电楼的作用力大于电休，所以被水分子携害向阴极移动。这斌形成了1G的特殊电泳形式：一部分冰向阳板，另一部分冰向阴极，在抗体孔两侧皆有抗体存在。因此，所谓对流只是部分 IgG的电渗作用造成。四、免疫州定电补

3．标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小）后再加样，因加样与开始电泳之间的间隔时间太长，可形成短的宽基底沉淀峰，使定量不准。 4．作 IgG、SIgA 等定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火箭峰因电渗呈纺锤状，影响结果测定。为了纠正这种现象，可先将待检血清用含 0.1％戊二醛或 2.85％甲醛的电泳缓冲液稀释（甲酰化），使本来带两性电荷的 IgG 变为只带负电荷，加快了泳向正极的速度，抵消了电渗作用，形成伸向阳极的火箭峰。火箭电泳作为抗原定量只能测定μg／ml 以上的含量。将放射自显影技术与火箭电泳结合起来，可明显提高火箭电泳的灵敏度。火箭电泳时加入少量 125I 标记的标准抗原共同电泳，经洗涤干燥后，用 x 线胶片显影，可出现放射性显影，根据自显影火箭峰降低的程度（竞争法）可计算出抗原的浓度。放射免疫自显影技术可测出 ng/ml 的抗原。三、对流免疫电泳对流免疫电泳（counter inmunoelectrophoresis，CIEP）是双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。大部分蛋白质抗原在碱性溶液中带负电荷，电泳时从负极向正极泳动，而抗体 IgG 分子量大，暴露的极性基团较少，在缓冲液中解离的也少，向正极的泳动速度较慢，电泳时由电渗引向负极的液流速度超过了 IgG 向正极的泳动，带动抗体向负极移动，这样就使抗原和抗体定向对流并发生反应，出现肉眼可见的沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，使其定向泳动，因而增加了试验的灵敏度（比双向扩散法高 8～16 倍），并缩短了反应时间。实验时在琼脂板上打两排孔，左侧各孔加入待测抗原，右侧孔内放人相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，带负电荷的抗原泳向阳极抗体侧，而抗体藉电渗作用流向阴极抗原侧，在两者之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成沉淀线（图 16-9）。图 16-10 对流免疫电泳示意图 IgG 的 4 个亚型在电泳时有不同的表现。IgG3 和 IgG4 与一般蛋白质一样，泳向阳极；而 IgG1 和 IgG2 则因其带电荷少，受电渗的作用力大于电泳，所以被水分子携裹向阴极移动。这就形成了 IgG 的特殊电泳形式：一部分泳向阳极，另一部分泳向阴极，在抗体孔两侧皆有抗体存在。因此，所谓对流只是部分 IgG 的电渗作用造成。四、免疫固定电泳

免夜固定电沫(imrunofixation el0 ctrophores1s,IFE)是区带电冰与免疫沉淀反应相结合的技术。该法单理与免技电袜类似，不月之处是区带电泳后，直接用抗血清作用于楼组分的蛋白质，或将浸有抗血清的滤低贴干其上，抗原与对应抗体直接爱生沉淀反应，使抗原在电袜位置上被免疫图定。免疫固定后的区箭为单一免疫复合物沉淀带，与同时电袜而未经免疫置定的标本比较。可判明该蛋白为何种成分，以对样品中所含成分及其性质进行分析、警定。免疫固定电泳可用于签定具有近以迁移率的多种虽白，如各种M蛋白、触珠蛋白的遗传型、补体的裂解产物，冷球蛋白、免疫球蛋白的轻链型别，酵脊液、候液或其他体液中微量蛋白的检测与鉴定， M蛋白鉴定的方法：先将患者血清减血蒙在章脂凝败上作区带电汰（一般作6条标本）。电沫后将抗血清加于蛋白质沐道上，或将浸泡过相应抗体的留酯纤纤维湖粮贴附于载体上，通常选用抗人全血清、抗1G、抗14，抗1gM,抗：轻链和抗入轻链。料育0▣■后洗去静离蛋白质，染色后则可见被倒定的相应M蛋白成分。第四节免疫流度分析技术 (Immunoturbidisetry) 经典的沉淀试发操作繁境、敏多度低(10一100μ意/l)、时间长，难以白动化。根据抗原与抗体能在液体内快速结合的原理，二十世纪T0年代出现了微量免疫沉淀测定法，即免夜浊度测定 (imnoturbidinetry),它是将液相内的沉淀试验与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。当可溶性抗照与相应的抗体特异结合，在二者比例合适、并有一定浓度的电解质存在时，可以形成不溶性的免发复合物，使反应液出现浊度。这件浊度可用肉眼或仪器测知，并可通过浊度推算出复合物的量，即抗原或抗体的量。免疫浊度测定可以测量微量的特测物质，并可在抗原抗体反应的第一阶段测得免度复合物形成的速率。是目前定量测定微量抗原物质并广泛使用的一种高灵敏度，快速的白动化免疫分析技术。免技油度测定按测量方式可分为透射免疫比浊法(turbidinetric imunoassay或turbidimetry) 和收射免疫比注法(ephelometrie1 inoassay咸nephelonetry),按测定速度可分为速率(rate)比浊法和终点《end小point)l比迫法。一、避射免夜比浊法

免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis，IFE）是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。该法原理与免疫电泳类似，不同之处是区带电泳后，直接用抗血清作用于被组分的蛋白质，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，使抗原在电泳位置上被免疫固定。免疫固定后的区带为单一免疫复合物沉淀带，与同时电泳而未经免疫固定的标本比较，可判明该蛋白为何种成分，以对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。免疫固定电泳可用于鉴定具有近似迁移率的多种蛋白，如各种 M 蛋白、触珠蛋白的遗传型、补体的裂解产物，冷球蛋白、免疫球蛋白的轻链型别，脑脊液、尿液或其他体液中微量蛋白的检测与鉴定。 M 蛋白鉴定的方法：先将患者血清或血浆在琼脂凝胶上作区带电泳（一般作 6 条标本），电泳后将抗血清加于蛋白质泳道上，或将浸泡过相应抗体的醋醋纤纤维薄膜贴附于载体上，通常选用抗人全血清、抗 IgG、抗 IgA、抗 IgM、抗κ轻链和抗λ轻链。孵育 30min 后洗去游离蛋白质，染色后则可见被固定的相应 M 蛋白成分。第四节免疫浊度分析技术（Immunoturbidimetry）经典的沉淀试验操作繁琐、敏感度低（10～100μg／ml）、时间长、难以自动化。根据抗原与抗体能在液体内快速结合的原理，二十世纪 70 年代出现了微量免疫沉淀测定法，即免疫浊度测定（immunoturbidimetry），它是将液相内的沉淀试验与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。当可溶性抗原与相应的抗体特异结合，在二者比例合适、并有一定浓度的电解质存在时，可以形成不溶性的免疫复合物，使反应液出现浊度。这种浊度可用肉眼或仪器测知，并可通过浊度推算出复合物的量，即抗原或抗体的量。免疫浊度测定可以测量微量的待测物质，并可在抗原抗体反应的第一阶段测得免疫复合物形成的速率，是目前定量测定微量抗原物质并广泛使用的一种高灵敏度、快速的自动化免疫分析技术。免疫浊度测定按测量方式可分为透射免疫比浊法（turbidimetric immunoassay 或 turbidimetry）和散射免疫比浊法（nephelometric immunoassay 或 nephelometry）。按测定速度可分为速率(rate)比浊法和终点(end-point)比浊法。一、透射免疫比浊法

195的年，Sc加1tze等根据抗原抗体结合后形成的复合物脆吲起液体介质出现浊度改变的原理，使光线的透过量碱少，则光线被吸收的量与免疫复合物形成量呈正相关，从而根据所测吸光度值即可裤算待测抗原的量，此法称为透射比浊法(transnission turbidinetry). 本法的基本原理是当一定波长的光线通过抗原抗体反应混合液时，被其中的免疫复合物反射、吸收而减弱。在一定范围内，透射光被吸收的量（吸光度或A值）与C量呈正相关，而IC量与相应抗原和抗体的量呈函数关系。当抗体量恒定时，根据所测吸光度值即可计算出待测抗原量。此法要求抗原抗体反应形成的1C达到一定的数量，而且分子颗粒较大(35一100阳)时才能精确测定，因此需时较长，敏感度相对较低，速度较慢。为了提高复合物形成速度，加入促聚剂，如4%聚乙二醇（国60008000），可使复合物形成在3一10阳in完成。二、散射免疫比油法 1967年ihie等利用潘光盟射在液相中的抗原抗体复合物微粒上时都分光线发生股射的原理，通过测量散射光的强度来得如待测抗原的量，这种比浊测定法称为散射比浊法(nephelometry)。1977年 Sternberg进一步发展建立了速率散射比被法(rat0 nephelonetry),使微量扰原的定量测定得以快连灵敏地进行。散射比浊法是指沿水平轴照射的一定波长的光，通过溶液时光线被免度复合物粒子颗粒折射，发生偏转，产生收射光，反应溶液中的悬浮分子，无论是州体或较体较子军可以是散射中心，当入射光通过时，如果颗粒直径比入财充的被长小根多（入射光波长的1/10一1/20），则散射光在各个方向上的分布比较均匀，称为Ry1动散射：粒径与入射光的比例增大，正向散射光强度趋于增强。当粒径略小于入射光被长时，称为Dby反射：如果颗粒直径接近或大于入射光被长时，则散射光显明显的不均匀分布，称为i1e散射（图16-11）. 图16-11光收射示意正 aylei融散射方程式为： 24r2 2- )2(1+c0s20) n2+2 式中1，为与入射光成9角度处散射光的强度：入和L,分别为入射光的波长和强度：r为焦点至检测器的距离：N为散射较子数（抗里抗体复合物的数量）：Y为较子的体积：为粒子的折射率：为溶剂的折射率：0为入射光与散射光的夹角

1959 年，Schultze 等根据抗原抗体结合后形成的复合物能引起液体介质出现浊度改变的原理，使光线的透过量减少，则光线被吸收的量与免疫复合物形成量呈正相关，从而根据所测吸光度值即可推算待测抗原的量，此法称为透射比浊法（transmission turbidimetry）。本法的基本原理是当一定波长的光线通过抗原抗体反应混合液时，被其中的免疫复合物反射、吸收而减弱。在一定范围内，透射光被吸收的量（吸光度或 A 值）与 IC 量呈正相关，而 IC 量与相应抗原和抗体的量呈函数关系，当抗体量恒定时，根据所测吸光度值即可计算出待测抗原量。此法要求抗原抗体反应形成的 IC 达到一定的数量，而且分子颗粒较大（35～100nm）时才能精确测定，因此需时较长，敏感度相对较低，速度较慢。为了提高复合物形成速度，加入促聚剂，如 4％聚乙二醇（MW6000～8000），可使复合物形成在 3～10min 完成。二、散射免疫比浊法 1967 年 Ritchie 等利用激光照射在液相中的抗原抗体复合物微粒上时部分光线发生散射的原理，通过测量散射光的强度来得知待测抗原的量，这种比浊测定法称为散射比浊法（nephelometry）。1977 年 Sternberg 进一步发展建立了速率散射比浊法（rate nephelometry），使微量抗原的定量测定得以快速灵敏地进行。散射比浊法是指沿水平轴照射的一定波长的光，通过溶液时光线被免疫复合物粒子颗粒折射，发生偏转，产生散射光。反应溶液中的悬浮分子，无论是固体或胶体粒子都可以是散射中心。当入射光通过时，如果颗粒直径比入射光的波长小很多（入射光波长的 1/10～1/20），则散射光在各个方向上的分布比较均匀，称为 Rayleigh 散射；粒径与入射光的比例增大，正向散射光强度趋于增强，当粒径略小于入射光波长时，称为 Debye 反射；如果颗粒直径接近或大于入射光波长时，则散射光呈明显的不均匀分布，称为 Mile 散射（图 16-11）。图 16-11 光散射示意图 Rayleigh 散射方程式为： Iθ=I0( 4 2 2 24    )NV2 ( 2 0 2 2 0 2 n 2n n n + − ) 2 (1+cos2θ) 式中 Iθ为与入射光成θ角度处散射光的强度；λ和 I0 分别为入射光的波长和强度；r 为焦点至检测器的距离；N 为散射粒子数（抗原抗体复合物的数量）；V 为粒子的体积；n 为粒子的折射率；n0 为溶剂的折射率；θ为入射光与散射光的夹角

温州医学院 文本 沉淀反应_临床免疫学检验第十六章

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