第二十一章化半发光免技批术 Chapter21 Cheniluminescence Imunosasay Technology 克一节发光与化.学发脊剂(luninescen<e and cheni上mninescence reagent) 一、发光 二，化学发光剂 三、化学发光标记物的制备 处二节发光醇免疫分析(1 uninescence enxyme immunoassay) 一，原用 二、技术装点 三、方法学泽价 第三节化学发光兔整分折Cheniluninescence imunouss透y) “、原理 二、技术要点 三、方法学深价 第四节电化学发光免疫分析E1 ectrochoriluminesc0mc0 immnoassay) 一，凰理 二、技术奖点 三、方法学深价 效五节化学发光免疫找术在医学检验中的交用(Clinical uses of cheniluninescence inmnoassay 学习要点 ·化学发光剂 ·发光醇免数分析 ·化学发光免疫分析 ·电化学发光免数分斯 平习要点 化学发光免度拉术是量新发脱起米的能实现免疫学自动化分析的免疫学标记技术，本章 主要介绍了发光现象、化学发光剂种类及化学发光标记物的制备以及化学发光免疫技术的技 术类平和在医学怜的中的应用。重点学挥发的中整分析、化学发光单投分析、电化平发光 免度分折的息理和技术要点及方法学评价
第二十一章 化学发光免疫技术 Chapter21 Chemiluminescence Immunoassay Technology 第一节 发光与化学发光剂(luminescence and chemiluminescence reagent) 一、发光 二、化学发光剂 三、化学发光标记物的制备 第二节 发光酶免疫分析(luminescence enzyme immunoassay) 一、原理 二、技术要点 三、方法学评价 第三节 化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay) 一、原理 二、技术要点 三、方法学评价 第四节 电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay) 一、原理 二、技术要点 三、方法学评价 第五节 化学发光免疫技术在医学检验中的应用(Clinical uses of chemiluminescence immunoassay） 学习要点 ·化学发光剂 ·发光酶免疫分析 ·化学发光免疫分析 ·电化学发光免疫分析 学习要点 化学发光免疫技术是最新发展起来的能实现免疫学自动化分析的免疫学标记技术。本章 主要介绍了发光现象、化学发光剂种类及化学发光标记物的制备以及化学发光免疫技术的技 术类型和在医学检验中的应用。重点掌握发光酶免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光 免疫分析的原理和技术要点及方法学评价
化学发光免疫技术(cheniluinescence irmunoassay technology)是将化学发光分析和 免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术，该方法不仅具有发光分析的高灵敏度和抗 眼抗体反应的高度特异性，而且还具有分离简便，可以实现自动化分析的特点，是医学和生物 学研究领域中一种新的重要的免疫学分析手段. 根据化学发光免疫技术中发允反应的不同体系和标记物及标记方法不同，大体上可分为 三种类型，即发光衡免疫分析(cheniluminescence enzyme imun0 assay)、化学发光免疫分 析(cheniluninescence imunoassay)和电化学发光免疫分析(electrocher■iluinescence n©ass):也可根据分离方法的不月进行分类，如微粒子化学发光免疫分析和继颗粒化 学发光免疫分析等： 第一节发光与化学发光剂 一、发光 一种物质由电子激发老回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射，称为发光 (1 uninescence)。恨据形成澄发态分子的滏发陵可将爱光分为三种类型：光照发光、生物爱 光和化学发光， (一)光黑发光(hotolusinescence) 发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长被长的可见光《见 第十八章)。 《二》生物发允bioluminescence) 典型例子为蒙火虫发光。反应底物为莹火虫荧光素(firefly luciferin》,在荧光 素酶(1 uciferase》的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化董火虫荧光素 (oxyluciferin》,后者在目复到基态时多余的能量以光子形式放出。反应式如下： 第二十一章无标题图1 (三)化学发允(Chemiluminescence] 在常温下经化学反应所产生的发射光：化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某线化 合物（发光剂成发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子成反应中同态分 子上升至电子激发老，当此产物分子或中间态分子衰退至基老时，以发射充子的形式释收能 量（即发光）
化学发光免疫技术(chemiluminescence immunoassay technology)是将化学发光分析和 免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。该方法不仅具有发光分析的高灵敏度和抗 原抗体反应的高度特异性,而且还具有分离简便,可以实现自动化分析的特点,是医学和生物 学研究领域中一种新的重要的免疫学分析手段。 根据化学发光免疫技术中发光反应的不同体系和标记物及标记方法不同，大体上可分为 三种类型，即发光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay)、化学发光免疫分 析(chemiluminescence immunoassay)和电化学发光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay)；也可根据分离方法的不同进行分类，如微粒子化学发光免疫分析和磁颗粒化 学发光免疫分析等。 第一节 发光与化学发光剂 一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射，称为发光 (luminescence)。根据形成激发态分子的激发能可将发光分为三种类型:光照发光、生物发 光和化学发光。 （一）光照发光(photoluminescence) 发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光 (见 第十八章)。 （二）生物发光(bioluminescence) 典型例子为萤火虫发光。反应底物为萤火虫荧光素 (firefly luciferin)，在荧光 素 酶 (luciferase) 的 催 化 下 利 用 ATP 产 能 ， 生 成 激 发 态 的 氧 化 萤 火 虫 荧 光 素 (oxyluciferin)，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。反应式如下: 第二十一章无标题图 1 （三）化学发光(Chemiluminescence) 在常温下经化学反应所产生的发射光。化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某些化 合物(发光剂或发光底物)可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分 子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能 量(即发光)
二化学发光剂 发光剂(luminescence reagent)是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的 形式释放陵量的化合物，根据上述发光特点可将发光剂分为卖光素、生物发光剂和化学发光 剂三种。下面主要叙述化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光成物。 《一》促反应的发是成物 是指经剧的降解作用面发出光的一类发光底物，目前化学发光解免疫技术中常用的解有 辣根过氧化物酶（服即）和碱性南酸酶(P),相应发光底物为： 1,H即的发光底物常用的度物为鲁米诺或其面生物和对-羟基苯乙酸。 (1)鲁米诺或其衍生物鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.11/L 服.6Tr1s缓冲液作底物液。发充反应式如下： 第二十一章无标题图2 要注意的是：首先，鲁米诺和L0在无服即催化时也能缓慢自发发光，从而在最后光强度 测定中造成空白干扰。因而宜分别配制成2原试剂溶液，只在用前即刻混合：其次，HP发 光增强剂如某些酚试剂（如邻-确酚）或萤火虫莫光素酶可增强服即催化鲁米诺氧化的反应 和延长发光时间，提高发光敏感度。 (2)对-经基馨乙假(PA)对-经基拳乙酸(HPA)在H0存在下被HP氧化成氧化二 聚体（荧光物质），在350nn激发光作用下，发出50波长的荧光，可用突光光度计测量： 反应式如下： 第二十一章无标盟图3 2LP的爱光底物常用的成物为3-(2-螺旋金刚烷》一甲氧基--甲基-一《3-磷酸 氧基)一-苯基-1,2-二氧乙统(A阳)和-甲基伞形酮磷酸盐(4-姐P。荧光庭物)》。 (I》PO0在碱性条件下，被LP酶解生成相当稳定的P-D阴离子，其有 230▣in的分解半衰期，发出波长为470a■的持续性光，在15ain时其强度达到高峰， 1560ain内光强度保持相对稳定。发光反应式如下： 第二十一章无标愿图4 (2)4银P4P在LP霍化下生成4甲基伞形刚，在36Om激发光的作用下，发 出448m的荧光，用黄光光度计进行测量。反应式如下： 第二十一章无标塑图5 (二)直接化学发光剂
二 化学发光剂 发光剂（luminescence reagent）是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的 形式释放能量的化合物，根据上述发光特点可将发光剂分为荧光素、生物发光剂和化学发光 剂三种。下面主要叙述化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光底物。 （一）酶促反应的发光底物 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有 辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），相应发光底物为： 1. HRP 的发光底物 常用的底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸。 （1）鲁米诺或其衍生物 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以 0.1mol/L pH8.6Tris 缓冲液作底物液，发光反应式如下: 第二十一章无标题图 2 要注意的是:首先,鲁米诺和 H2O2 在无 HRP 催化时也能缓慢自发发光，从而在最后光强度 测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成 2 瓶试剂溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP 发 光增强剂如某些酚试剂（如邻-碘酚）或萤火虫荧光素酶可增强 HRP 催化鲁米诺氧化的反应 和延长发光时间，提高发光敏感度。 （2）对-羟基苯乙酸（HPA）对-羟基苯乙酸（HPA）在 H2O2 存在下被 HRP 氧化成氧化二 聚体（荧光物质），在 350nm 激发光作用下，发出 450nm 波长的荧光，可用荧光光度计测量。 反应式如下： 第二十一章无标题图 3 2. ALP 的发光底物 常用的底物为 3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸 氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和 4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。 (1)AMPPD AMPPD 在碱性条件下，被 ALP 酶解生成相当稳定的 AMP-D 阴离子，其有 2~30min 的分解半衰期，发出波长为 470nm 的持续性光，在 15min 时其强度达到高峰， 15~60min 内光强度保持相对稳定。发光反应式如下： 第二十一章无标题图 4 （2）4-MUP 4-MUP 在 ALP 催化下生成 4-甲基伞形酮，在 360nm 激发光的作用下，发 出 448nm 的荧光，用荧光光度计进行测量。反应式如下： 第二十一章无标题图 5 （二）直接化学发光剂
这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的用等条件就能发光，如可定衢 (acridinium,E》在含过氧化氢的稀碱溶液中即能发光，反应式如下： 第二十一章无标题图6 (三)电化学发光剂 带通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。电化学发光剂三联赋壁钉 [u(化y)]”(图21-1)和电子供体三丙胺(TPA)在阳性电极表面可同时失去一个电子面发 生氧化反应。二价的[和(by),]P按氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳 离子白由基P以，它很不稳定，可白发地失去一个质子(F),形成白由基P,成为一种 银强的还原剂，可将一个高能量的电子运命三价的[upy)]”使其形成撒发态的 [和心py》:】,激发态的三联赋呢钉不稳定。很快发射出一个波长为20a的光子，国复到 基态的三联吡定钉。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强 (图21-20. 图21-】三联比啶钉分子结构图 图21-2电化学发光原理图 三、化学发光标记物的制备 化学发光标记物是将化学发光剂与抗体或抗原结合在一起的复合物。其标记方法很多， 大多是利用交联剂使化学发光剂与被标记物分子结构中的游离的氢基，段基，硫复基(-S), 羟基等基团形成不可逆连接。如旷定酚类化学发光剂常用《一羟基或珀酰亚胺活化法，使蛋 白质（抗体或抗原）分子中的骏基通过？-羟基玻珀酰亚胺活化，再与发光剂的氢基俱联形 成酰按量而成。 三联赋啶钉[u6即y):]”-羟基琥珀酰按(s)可与蛋白质、抗原潘素、核酸等多 种化合物结合成化李发光标记物，故面I检测的项目根广泛。 第二节发光降免支分析 一、原理
这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的 pH 等条件就能发光，如吖啶酯 （acridinium, AE）在含过氧化氢的稀碱溶液中即能发光,反应式如下: 第二十一章无标题图 6 （三）电化学发光剂 指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。电化学发光剂三联吡啶钌 [Ru(bpy)3] 2+（图 21-1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发 生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3] 2+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA 失去电子后被氧化成阳 离子自由基 TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H +），形成自由基 TPA.，成为一种 很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的[Ru(bpy)3] 3+ 使其形成激发态的 [Ru(bpy)3] 2+.。激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为 620nm 的光子，回复到 基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强 (图 21-2)。 图 21-1 三联吡啶钌分子结构图 图 21-2 电化学发光原理图 三、化学发光标记物的制备 化学发光标记物是将化学发光剂与抗体或抗原结合在一起的复合物。其标记方法很多， 大多是利用交联剂使化学发光剂与被标记物分子结构中的游离的氨基、羧基、硫氢基（-SH）、 羟基等基团形成不可逆连接。如吖啶酯类化学发光剂常用 N-羟基琥珀酰亚胺活化法，使蛋 白质（抗体或抗原）分子中的羧基通过 N-羟基琥珀酰亚胺活化，再与发光剂的氨基偶联形 成酰胺键而成。 三联吡啶钌[Ru(bpy)3] 2+ N-羟基琥珀酰胺（NHS）可与蛋白质、半抗原激素、核酸等多 种化合物结合成化学发光标记物，故 ECLIA 检测的项目很广泛。 第二节 发光酶免疫分析 一、原 理
发光酶免度分析(1 minescence0n罢ym1 munoasssay,qEIA》是用参与催化某一发 光反应的酶米标记抗原或抗体，在抗原抗体反应结束后，加入底物。通过酶催化底物发充反 应，发出的光在特定仪器上进行测定。常用的标记酶有辣根过氧化物酶(rserad1s动 peroxidase,取即)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AlP),根据酶促反应底物不同， 可分为荧光酶免疫分析和化学发充酶免疫分析。荧光酶免疫分析就是利用理想的南统光底 物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定英光强度进行定量（图1-3）1化学 发光酯免疫分析就是利用酶对发光定物雁化作用而直接发光，通过光强度的测定面直接透行 定量（图21-4）. 图21-3荧完酶免疫分析《双抗体夹心法】 图21-4化学发光酶免技分析（双抗体夹心法） 二、技术要点 发光酶免薇分析的技术要点包括抗原抗体反应、标记物游离都分和结合部分分离，解促 发光反应及检测三部分： (一)抗原抗体反应 抗原抗体反应模式主要有以下三类。 1.双抗体夹心法用战相抗体和酶标抗体与特测标本中相应抗原反应，生成国相抗体= 待测抗原-酶标抗体复合物，经B、F分离，如入底物经酶促反应后发光，其发光量与待测标 木中抗原含量呈正比， 2.双抗原夹心法该法常用于抗体的检测。用固相抗源和酶标抗原与待测杯本中相应 抗体反应，生成固相抗景-待测抗体-酶标抗原复合物，经B,F分离。在免度夏合物中加入 底物进行酶促发光，其发光量与待测标本中抗体含量呈正比。 3,固相抗源竟争法该法常用于多肽类小分子抗累的测定。用己知固相抗原和待测标 本的相应抗原与一定量的酶标记抗体发生竞争性结合反应，反应平衡后经B、F分离，因相 抗原与酶标抗体形成复合物被留下来，通过加入底物选行酶促发光反应，其发光量与传测标 本中抗原含量呈反比， (二)B,F分离 是指将游离酶标记物和解标记物免疫复合物进行分离的过程。常用分离技术有：
发光酶免疫分析（luminescence enzyme immunoasssay， CLEIA）是用参与催化某一发 光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应结束后，加入底物，通过酶催化底物发光反 应，发出的光在特定仪器上进行测定。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ,ALP）,根据酶促反应底物不同， 可分为荧光酶免疫分析和化学发光酶免疫分析。荧光酶免疫分析就是利用理想的酶荧光底 物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度进行定量（图 21-3）；化学 发光酶免疫分析就是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行 定量（图 21-4）。 图 21-3 荧光酶免疫分析（双抗体夹心法） 图 21-4 化学发光酶免疫分析（双抗体夹心法） 二、技术要点 发光酶免疫分析的技术要点包括抗原抗体反应、标记物游离部分和结合部分分离、酶促 发光反应及检测三部分。 （一）抗原抗体反应 抗原抗体反应模式主要有以下三类。 1．双抗体夹心法 用固相抗体和酶标抗体与待测标本中相应抗原反应，生成固相抗体- 待测抗原-酶标抗体复合物，经 B、F 分离，加入底物经酶促反应后发光，其发光量与待测标 本中抗原含量呈正比。 2．双抗原夹心法 该法常用于抗体的检测。用固相抗原和酶标抗原与待测标本中相应 抗体反应，生成固相抗原-待测抗体-酶标抗原复合物，经 B、F 分离，在免疫复合物中加入 底物进行酶促发光，其发光量与待测标本中抗体含量呈正比。 3．固相抗原竞争法 该法常用于多肽类小分子抗原的测定。用已知固相抗原和待测标 本的相应抗原与一定量的酶标记抗体发生竞争性结合反应，反应平衡后经 B、F 分离，固相 抗原与酶标抗体形成复合物被留下来，通过加入底物进行酶促发光反应，其发光量与待测标 本中抗原含量呈反比。 （二）Ｂ、Ｆ分离 是指将游离酶标记物和酶标记物免疫复合物进行分离的过程，常用分离技术有：
1.磁顿粒分离法用抗原或抗体包被的磁颗粒与标本中相应抗原或抗体和倒标的抗体或 抗原通过一定模式的免疫学反应后，最终通过磁场将结合衡标记物免疫复合物和游离酬标记 物进行分离的技术。 2.微粒子捕获法与磁顾粒分离法所不月的是用无磁性的微粒子作为抗体或抗原的包被 载体，然后用纤维膜柱子进行结合状态和游离状态酶的标记物的分离。 3.包被珠分离法用聚苯乙稀等实验材料制成小殊，在小珠上包被抗原或抗体，经抗原 抗体反应后，将结合状态和游离状态的酶标记物进行分离。 (三)酶促发光反应及其结果计算 以荧光剧免疫分析为例，如入底物4-P,解标抗体上P将P分解，脱南酸基团 后形成4-甲基伞形相(4如)，它在360m激发光的愿射下，发出448m的荧光，经荧光读 数仪记录、放大，最后根据标准由线由电脑计算出所测物质的含量。 三、方法学评价 (一》灵敏度高 经过酶和发光两级故大，并加入发光增强剂以提高敏感度和发光福定性，故方法灵敏度 较高。 《二》特异性本底高 隔标抗体或南标抗原因特异性吸附面号产生较高本底，实验评价时应引起注意， (三》青特异性酶的影响 由于洗涤不够彻底，血清中其他来源的过氧化物南类物质易产生半特异性解发光反应， 影响测定结果。 第三节化学发光免疫分析 一、原理 化学发光免疫分析(chemiluninescence imunoassay,CIA)是用化学发光剂（吖定 图)直接标记抗原减抗体与传测标本中相应抗体或抗原、磁顾粒性的抗原或抗体反应，通过 磁场把结合状态(B)和游离状态(F)的化学发光剂标记物分离开来，然后在结合状志(B) 部分中加入发光促选剂进行发光反应，通过对结合状态(B)发光强度的测定进行定量或定 性检测（图21-5）. 图21-5化学发光免疫分析反应原理（双抗体夹心法）
1．磁颗粒分离法 用抗原或抗体包被的磁颗粒与标本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或 抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合酶标记物免疫复合物和游离酶标记 物进行分离的技术。 2．微粒子捕获法 与磁颗粒分离法所不同的是用无磁性的微粒子作为抗体或抗原的包被 载体, 然后用纤维膜柱子进行结合状态和游离状态酶的标记物的分离。 3．包被珠分离法 用聚苯乙稀等实验材料制成小珠, 在小珠上包被抗原或抗体,经抗原 抗体反应后,将结合状态和游离状态的酶标记物进行分离。 （三）酶促发光反应及其结果计算 以荧光酶免疫分析为例，加入底物 4-MUP，酶标抗体上 ALP 将 4-MUP 分解，脱磷酸基团 后形成 4-甲基伞形酮（4-MU），它在 360nm 激发光的照射下，发出 448nm 的荧光，经荧光读 数仪记录、放大，最后根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量。 三、方法学评价 （一）灵敏度高 经过酶和发光两级放大，并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性，故方法灵敏度 较高。 （二）非特异性本底高 酶标抗体或酶标抗原因非特异性吸附而易产生较高本底，实验评价时应引起注意。 （三）非特异性酶的影响 由于洗涤不够彻底，血清中其他来源的过氧化物酶类物质易产生非特异性酶发光反应， 影响测定结果。 第三节 化学发光免疫分析 一、原 理 化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是用化学发光剂（吖啶 酯）直接标记抗原或抗体与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过 磁场把结合状态（B）和游离状态（F）的化学发光剂标记物分离开来，然后在结合状态（B） 部分中加入发光促进剂进行发光反应，通过对结合状态（B）发光强度的测定进行定量或定 性检测（图 21-5）。 图 21-5 化学发光免疫分析反应原理（双抗体夹心法）
二、技术要点 化学发光免疫分析的技术要点包括抗眼抗体反应、标记物游离部分和结合部分分离、直 接发光反应及检测三部分。 《一)抗愿抗体反型 抗原抗体反应类型同酶发光免夜测定技术，也有双抗体夹心法，双抗原夹心法和固相抗 原竟争法三种主要慎式，现以双抗体夹心法为例说明。将包被单克隆抗体的磁颗粒和特测标 本加入到反应管中，标本中待测抗原与磁颈枚上抗体结合，再加上吖定留标记抗体，经过温 育，形成磁颗较抗体-特测抗原-可熨酯标记抗体复合物。 (二》游离和结合部分的分离 常用@颈粒分离技术，在电磁场中进行23次洗涤后，根快地将未结合的多余抗原和旷 定酯标记抗体洗去，面磁颗粒抗体一特测抗原一矿度盾标记抗体复合物和磁颜轮抗体留下， (三》化学发光反应 经过洗涤的磁性颗粒中，加入用纠正液〔X:0阳)使其星城性，然后加入氧化剂(Q), 这时吖定酯在不需要催化剂的情况下分解并发光，由集光器进行接收，经光电倍增管放大， 记录1砂钟内所产生的光子能，这部分光的积分与被测抗星含量成正比，根据标准曲线，仪 器可以自动计算出待测抗原含量。 三、方法学评价 (一)吖壁留发光特点 吖定酯发光背最堤音低，化学反应简单，快速而无缓催化剂： (二)吖啶酯标记的特点 吖定酯可直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的生物学活性和理化特性，试 剂有效期可达一年。 (三)分离特点 所用分离剂为极细的园相醚粉，除可增大包被面积，加快反应外，亦同时使清流及分离 更简便、快捷。 (四》吖壁酯发光检测特点 吖定图发光为瞬间发光，持续到间短，因此。对信号检测仪的灵敏度要求比较高。 第四节电化学发光免成分析 一、原理
二、技术要点 化学发光免疫分析的技术要点包括抗原抗体反应、标记物游离部分和结合部分分离、直 接发光反应及检测三部分。 （一）抗原抗体反应 抗原抗体反应类型同酶发光免疫测定技术，也有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗 原竞争法三种主要模式，现以双抗体夹心法为例说明。将包被单克隆抗体的磁颗粒和待测标 本加入到反应管中，标本中待测抗原与磁颗粒上抗体结合，再加上吖啶酯标记抗体，经过温 育，形成磁颗粒抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物。 （二）游离和结合部分的分离 常用磁颗粒分离技术，在电磁场中进行 2~3 次洗涤后，很快地将未结合的多余抗原和吖 啶酯标记抗体洗去，而磁颗粒抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物和磁颗粒抗体留下。 （三）化学发光反应 经过洗涤的磁性颗粒中，加入 pH 纠正液（NaOH）使其呈碱性，然后加入氧化剂（H2O2）， 这时吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解并发光，由集光器进行接收，经光电倍增管放大， 记录 1 秒钟内所产生的光子能，这部分光的积分与被测抗原含量成正比，根据标准曲线，仪 器可以自动计算出待测抗原含量。 三、方法学评价 （一）吖啶酯发光特点 吖啶酯发光背景噪音低，化学反应简单，快速而无须催化剂。 （二）吖啶酯标记的特点 吖啶酯可直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的生物学活性和理化特性，试 剂有效期可达一年。 （三）分离特点 所用分离剂为极细的固相磁粉，除可增大包被面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离 更简便、快捷。 （四）吖啶酯发光检测特点 吖啶酯发光为瞬间发光，持续时间短，因此，对信号检测仪的灵敏度要求比较高。 第四节 电化学发光免疫分析 一、 原 理
电化学发光免授分析(electrochemi1 uninescence1 mnoassay,CLI)是电化学发光 (CL)和免疫测定相结合的产物。它的标记物的发光原理与一般化学发光(CL)不月。是 一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。实际上但括了电化学和化学发完两个 过程。L.与L的差异在于.是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应， 用电化学发光剂三联吡定钉如()，]广标记抗体，通过抗原抗体反应和磁颗粮分离技术，根 据三联吡呢了在电极上发出的光强度的大小对待测抗厚或抗体进行定量成定性检测（图 21-6). 图216电化学发光免疫分析技术反位原理（双抗体夹心法） 二、技术要点 电化学发光免疫分析的技术要点也包括抗源抗体反应、标记物游离部分和结合部分分 离、电化学发光反应及检测三富分 (一》抗原抗体反应 抗原抗体反应类型同酶发光免夜测定技术，主要也有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固 相抗原意争法三种模式，观以双抗体夹心法为例说明。三联吡啶钉标记抗体和生物素标记抗 体与待测标本同时加入一个反应杯中解有反应，然后加入链霉亲和素包被磁珠，再次等育， 使生物素通过与亲和素的结合将磁味、抗体连接为一体，形成双抗体夹心物即[y),]P一 抗体-待测抗原-抗体一生物素-性柔和素一磁珠复合体。 (二)等离和结合部分的分离 常用極颗粒分离技术，蠕动泵将形成的双抗体突心物吸入流动测量室，此时，磁珠被工 作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，等离的抗体（与生物素结合的和与[uy),]P 结合的抗体)也被吸出测量室。 (三》电化学发光反应 蠕动系加入含三丙腹(TPA)的缓冲液，同时电极加电压，启动L.反应过程。该过程 在电极表面圆而复给地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[®如)：] 的浓度星线性关系根据标准曲线算出特测抗原的含量。最后，终止电压，移开磁珠，加入 清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。 三、方法学评价 (一》电化学发光特点
电化学发光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)是电化学发光 （ECL）和免疫测定相结合的产物。 它的标记物的发光原理与一般化学发光（CL）不同，是 一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个 过程。ECL 与 CL 的差异在于 ECL 是电启动发光反应，而 CL 是通过化合物混合启动发光反应。 用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3] 2+标记抗体，通过抗原抗体反应和磁颗粒分离技术，根 据三联吡啶钌在电极上发出的光强度的大小对待测抗原或抗体进行定量或定性检测（图 21-6）。 图 21-6 电化学发光免疫分析技术反应原理(双抗体夹心法) 二、技术要点 电化学发光免疫分析的技术要点也包括抗原抗体反应、标记物游离部分和结合部分分 离、电化学发光反应及检测三部分。 （一）抗原抗体反应 抗原抗体反应类型同酶发光免疫测定技术，主要也有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固 相抗原竞争法三种模式，现以双抗体夹心法为例说明。三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗 体与待测标本同时加入一个反应杯中孵育反应，然后加入链霉亲和素包被磁珠，再次孵育， 使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、抗体连接为一体，形成双抗体夹心物即[Ru(bpy)3] 2+ - 抗体-待测抗原-抗体-生物素-链霉亲和素-磁珠复合体。 （二）游离和结合部分的分离 常用磁颗粒分离技术，蠕动泵将形成的双抗体夹心物吸入流动测量室，此时，磁珠被工 作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的抗体（与生物素结合的和与[Ru(bpy)3] 2+ 结合的抗体）也被吸出测量室。 （三）电化学发光反应 蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动 ECL 反应过程。该过程 在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3] 2+ 的浓度呈线性关系,根据标准曲线算出待测抗原的含量。最后，终止电压，移开磁珠，加入 清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。 三、方法学评价 （一）电化学发光特点
三联赋啶钉在电场中因不断得到三丙胶提供的电子，可网面复始地发光，特续时间长， 信号强度强，容易测定，容易控制。标记物的循环再利用，使发光强度更强、时间更长、更 易于测定。 (二》标记特点 三联赋呢钉直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的理化特性，标记物稳定性 好. (三)方法学特点 本法具有灵敏度高，可达pl水平，线性范围宽，反应时间短等特点。 第五节化学发光免疫技术在医学检验中的应用 化学发光免疫技术因标记物为非放射性物质，而且易于实现自动化。具有快速、，简便、 灵饭、特异等精点，已广泛应用于各种藏素、肿粒标志物、药物及其他微量生物活性物质测 定， 一、甲状题激素及相关抱标测定 如T3、T4、、FT4、T3、抗0、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋自抗体等。 二、生殖米素测定 如日-G、罹乳素、促卵泡激素、促黄体董素、孕酮、能二醇、雌三醇、塞酮、硫酸脱 氢异排制等。 三、骨上膝和进体激素测定 如醛因副、皮质醇、尿皮质醇、人生长激素、甲状旁腺素、足肾上腺皮质藏素等。 四、黄血因子测定 如雀生素B:,叶酸、铁蛋白等。 五、肿常标记物测定 年AFP、CEA、P5A、f5A.CA19-9,CA125、CA15-3等： 大、感染性疾病诊断 如衣原体抗原、保衣原体抗原、弓彩体1G抗体，弓形体【从抗体、风疹病毒1G抗体、 风疹病毒I山抗体，巨细胞瑞毒Ig心抗体、巨细胞病毒I抗体、Bxg、抗-B、抗-Bc, HBeAg、抗-围e、抗-IVI/2、抗-CW测定等。 七、糖尿病诊断
三联吡啶钌在电场中因不断得到三丙胺提供的电子，可周而复始地发光，持续时间长， 信号强度强，容易测定，容易控制。标记物的循环再利用，使发光强度更强、时间更长、更 易于测定。 （二）标记特点 三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标记物的理化特性，标记物稳定性 好。 （三）方法学特点 本法具有灵敏度高，可达 pg/ml 水平，线性范围宽，反应时间短等特点。 第五节 化学发光免疫技术在医学检验中的应用 化学发光免疫技术因标记物为非放射性物质，而且易于实现自动化，具有快速、简便、 灵敏、特异等特点，已广泛应用于各种激素、肿瘤标志物、药物及其他微量生物活性物质测 定。 一、甲状腺激素及相关指标测定 如 T3、T4、TSH、FT4、FT3、抗 TPO、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。 二、生殖激素测定 如β-HCG、催乳素、促卵泡激素、促黄体激素、孕酮、雌二醇、雌三醇、睾酮、硫酸脱 氢异雄酮等。 三、肾上腺和垂体激素测定 如醛固酮、皮质醇、尿皮质醇、人生长激素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素等。 四、贫血因子测定 如维生素 B12、叶酸、铁蛋白等。 五、肿瘤标记物测定 如 AFP、CEA、PSA、fPSA、CA19-9、CA125、CA15-3 等。 六、感染性疾病诊断 如衣原体抗原、尿衣原体抗原、弓形体 IgG 抗体、弓形体 IgM 抗体、风疹病毒 IgG 抗体、 风疹病毒 IgM 抗体、巨细胞病毒 IgG 抗体、巨细胞病毒 IgM 抗体、HBsAg、抗-HBs、抗-HBc、 HBeAg、 抗-HBe、 抗-HIV1/2、抗-HCV 测定等。 七、糖尿病诊断
如陕岛素，直清C-肽，谷氨酸股羧酶抗体(G4A》,陕岛细胞抗体(ICA)和碳岛素自 身抗体(IM)测定等， 八、心山管疾病诊断 如肌酸激酶(K)、肌酸激酶月工酶(C保姐)，肌红蛋白，肌钙蛋白I测定等。 九、泊疗药物监测 如茶碱、地高辛，环雅素、苯巴比妥血药浓度测定等。 (陶志华)
如胰岛素、血清 C-肽、谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）、胰岛细胞抗体（ICA）和胰岛素自 身抗体（IAA）测定等。 八、心血管疾病诊断 如肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌红蛋白、肌钙蛋白 I 测定等。 九、治疗药物监测 如茶碱、地高辛、环孢素、苯巴比妥血药浓度测定等。 (陶志华)