第十八章荧光免疫技术 Inmunofluorescence Technique 第一节荧光标记物的制备(Preparetion Of Fluorescein Lablled》 一、光和萸光物质 二，荧光标记物的制备 第二节荧光免疫显微技术(Imunofluorescent Microscop时Technique) 一，基本原理 二，技术类型 三、技术要点 四、方法评价 第三节荧光免夜测定技术(F1 uorescence Immunoassay Technique) 一，时问分辨荧光免疫测定 二、荧光偏振荧光免疫测定 学习要点 ·荧光和荧光物质 ·荧允免疫的基本技术类型 ·荧光免疫的基本原理 ·爱光免疫方法的评价和监闲应用 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观 性结合起来的一种免疫分析技术。Coos等于1941年首次采用异硫氟酸荧光素 标记抗体，检测小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原而获得成功。1970 年后发展建立起了荧光免技测定技术(f1 uorescence imnunoassay,FIA),近年 米，随着一系列新仪器和新方法的问世，莪光免疫技术有了根大的改进和发展， 其标准化、定量化和自动化进入了一个新的发展阶段，已成为检验医学、科学 研究中很有实用价值的测定方法之一· 荧充免疫技术分为荧光抗体索色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体索 色技术是用荧光抗体对细围，组织韧片暖其他标本中的抗原或抗体进行显定和 定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为爱光免疫显微技术，或是应 用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式萸光免疫技术；荧光免疫测定主要 用于体液标本中抗原成抗体的定量检测
第十八章 荧 光 免 疫技术 I m m u nofluore scence T e c h nique 第一节 荧光标记物的制备(Preparetion Of Fluorescein Lablled ) 一、 荧光和荧光物质 二、荧光标记物的制备 第二节 荧光免疫显微技术(Immunofluorescent Microscopy Technique) 一、基本原理 二、技术类型 三、技术要点 四、方法评价 第三节 荧光免疫测定技术 ( Fluorescence Immunoassay Technique) 一、时间分辨荧光免疫测定 二、荧光偏振荧光免疫测定 学习要点 ·荧光和荧光物质 ·荧光免疫的基本技术类型 ·荧光免疫的基本原理 ·荧光免疫方法的评价和临床应用 荧光免 疫技 术是将 抗原 抗体 反应 的特异 性与 荧光 物质检 测的 敏感 性和直 观 性结合起来的一种免疫分析技术。Coon s 等 于 1941 年 首次采用异硫氰 酸荧光素 标记抗体 ，检测小 鼠组织 切片中 的可溶性 肺炎球 菌多糖 抗原而 获得成功 。1970 年后发展建立起了荧光免疫测定技术(fl uorescence i mmunoassay，FI A)，近年 来，随着一系列新仪器和新方法的问世，荧光免疫技术有了很大的改进和发展， 其标准化、 定量化 和自动 化进入了 一个新 的发展 阶段，已 成为检 验医学 、科学 研究中很有实用价值的测定方法之一。 荧光免疫 技术分为 荧光抗 体染色 技术和 荧光免疫 测定两 大类。 荧光抗 体染 色技术是用 荧光抗 体对细 胞、组织 切片或 其他标 本中的抗 原或抗 体进行 鉴定和 定位检测， 可在荧 光显微 镜下直接 观察结 果，称 为荧光免 疫显微 技术， 或是应 用流式细胞 仪进行 自动分 析检测， 称为流 式荧光 免疫技术 ；荧光 免疫测 定主要 用于体液标本中抗原或抗体的定量检测
第一节荧光标记物的制备 Preparetion Of Fluorescein Lablled 一、荧光和荧光物质 (一)荧光 1.荧光的产生一线化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能） 面进入激发态，当其从激爱态再目复至基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形 式发射即发光，荧光发射的特点是可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻 引起发光，而一且停止供能，发光（荧光》现象随即停止。可引发荧光的能量种 类很多，由光微发所引起的荧光称为光致荧光，由化学反应所引起的称为化学 荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光咸阴极射线荧光。荧光免夜 技术一股应用光致荧究物质进行标记。 2.荧光效率荧光效率是指笑光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率。 荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，而是或多或少地以其他形式释 放。发射荧光的光量子数亦称荧光强度。除受藏发完强度影响外，也与激发光 的波长有美。各个荧光分子有其特定的吸收光游和发射光语（荧光光讲），即在 某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择薇发光被长最接近于荧光分 子的最大吸收峰波长，且测定光波最接近子最大发射光被峰时，可得到最强的 荧光效率。 荧光效率= 发射荧光的光量子数（荧光强度） 吸收光的光量子数（缓光强度） 3。荧光寿命指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰 诚到一定程度时所用的时间， 4.荧光的滓灭指荧光分子的辐射能力受到激发光较长时间的照射后会减 蜀的现象，这是由于薰发态分子的电子不能国复到基态，所吸收的能量无法以 荧光形式发射所致。 5,影响因素 (1)H:荧光素在溶剂中基本上处于离子化状态，因此，溶剂中的氧离子浓 度对荧光强度的影响是极大的。每一种荧光素都有自己合适的H值，它保持荧 光素分子与溶剂之间的电离平衡，的改变可以引起荧光素荧光光谱的改变， 并可造成荧光强度的降低
第一节 荧 光 标 记物的制备 Preparetion Of Fluorescein Lablled 一 、 荧 光 和荧光物 质 (一)荧光 1．荧光的产生 一些化学物 质能从外界吸收 并储存能量(如光 能、化 学能) 而进入激发 态，当 其从激 发态再回 复至基 态时， 过剩的能 量可以 电磁辐 射的形 式发射即发 光。荧 光发射 的特点是 可产生 荧光的 分子或原 子在接 受能量 后即刻 引起发光， 而一旦 停止供 能，发光 (荧光)现象随 即停止 。可引发 荧光的 能量种 类很多，由 光激发 所引起 的荧光称 为光致 荧光， 由化学反 应所引 起的称 为化学 荧光，由 X 线 或阴极射线引起 的分别称为 X 线荧光或 阴极射线荧光。 荧光免疫 技术一般应用光致荧光物质进行标记。 2．荧光效率 荧光效 率是指荧光分子 将吸收的光能转 变成荧光的百分 率。 荧光分子不 会将全 部吸收 的光能都 转变成 荧光， 而是或多 或少地 以其他 形式释 放。发射荧 光的光 量子数 亦称荧光 强度， 除受激 发光强度 影响外 ，也与 激发光 的波长有关 。各个 荧光分 子有其特 定的吸 收光谱和 发射光 谱(荧光 光谱)，即在 某一特定波 长处有 最大吸 收峰和最 大发射 峰。选 择激发光 波长最 接近于 荧光分 子的最大吸 收峰波 长，且 测定光波 最接近 于最大 发射光波 峰时， 可得到 最强的 荧光效率。 荧光效率= 吸收光的光量子数（激发光强度） 发射荧光的光量子数（荧光强度） 3. 荧 光寿命 指荧 光物 质被 一瞬 时光 脉冲激 发后 产生 的荧 光随 时间 而衰 减到一定程度时所用的时间。 4．荧光的淬灭 指荧 光分子的辐射能 力受到激发光较 长时间的照射后 会减 弱的现象。 这是由 于激发 态分子的 电子不 能回复 到基态， 所吸收 的能量 无法以 荧光形式发射所致。 5．影响因素 (1)pH：荧光素在溶剂 中基本上处于离 子化状态，因此 ，溶剂中的氢离 子浓 度对荧光强度的影响是极大的。每一种荧光素都有自己合适的 p H 值，它保持荧 光素分子与溶剂之间的电离平衡。pH 的改变可以引起 荧光素荧光光谱 的改变， 并可造成荧光强度的降低
(2)温度：环境温度对荧允染色有明显的影南。一股情况下，温度在20℃时， 荧光素即开始表现温度淳灭作用，以后随温度升高而加强，可至荧光完全淬灭， 温度在20℃以下，荧光素的荧光强度随温度的变化改变不明显，基本上保持恒 量。荧光显微镜观察在适当的低温环境中进行可得到更好的结果。 (3)荧光素的浓度：浓度对荧光素的发光影响极大。在一定浓度范围内。荧 光强度随荧光素浓度增加而增加。当浓度增加到一定程度时，荧光强度就达到 最大，再增加浓度，免光强度即开始下降 (4)杂质对细胞荧光染色的影响：杂质对荧光的淬灭作用多由于溶剂中含有 一些不发光的物质如溴化物、碘化物和氨基茶等。 (5)某丝细胞固定剂对细胞荧光染色的影响：在细胞染色中，固定细胞的溶 剂对荧充染色有明显影响。如戊二醛、甲能园定的细胞比不固定的饵胞荧光强 度减蜀50%左右。 (6)一线化合物如苯被、酚、硝基苯及一些南化物等都有较强的爱光淬灭作 用，在进行荧光免疫试险中，要避免沾染这些物质。另外，这些物质可被用作 淬灭剂来清除不需要的荧光，如用硝基苯处理有荧允的镜油等。荧光物质的保 存应注意避免光《特聊是餐外光)的直接照射和与其他化合物的接触。 (二)荧光物质 1.荧光素 荧光素是能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物。常用的黄光 素有： (1)异疏氯酸荧光素(fluorescein isothiocyanate.FITC)纯品为黄色 或橙黄色结品粉末，易溶千水和酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长 为490~495m日，最大发射光波长为520一530m■，呈明亮的黄绿色英光。有两种 同分异构体，其中异构体【型在效率、稳定性，与蛋白质结合力等方面都更良 好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人 眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色，有利于降低背 景干找。 (2)四乙基罗丹明(rhodanine.,B200)为橘红色静末，不溶于水，易溶于 酒精和丙附，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570■，最大发射光 波长为595一600mn,星橘红色荧光
(2)温度：环境温度对荧 光染色有明显的 影响。一般情况 下，温度在 20℃时， 荧光素即开始表现温度淬灭作用，以后随温度升高而加强，可至荧光完全淬灭。 温度在 20℃以下，荧 光素的荧光强度 随温度的变化改 变不明显，基本 上保持恒 量。荧光显微镜观察在适当的低温环境中进行可得到更好的结果。 (3)荧光素的浓度：浓 度对荧光素的发 光影响极大。在 一定浓度范围内 ，荧 光强度随荧 光素浓 度增加 而增加。 当浓度 增加到 一定程度 时，荧 光强度 就达到 最大，再增加浓度，荧光强度即开始下降。 (4)杂质对细胞荧光染色 的影响：杂质 对荧光的淬灭作 用多由于溶剂中 含有 一些不发光的物质如溴化物、碘化物和氨基苯等。 (5)某些细胞固定剂对细胞荧光染色的影响：在细胞染色中，固定细胞的溶 剂对荧光染 色有明 显影响 。如戊二 醛、甲 醛固定 的细胞比 不固定 的细胞 荧光强 度减弱 50%左右。 (6)一些化合物如苯胺、酚、硝基苯及一些卤化物等都有较强的荧光淬灭作 用，在进行 荧光免 疫试验 中，要避 免沾染 这些物 质。另外 ，这些 物质可 被用作 淬灭剂来消 除不需 要的荧 光，如用 硝基苯 处理有 荧光的镜 油等。 荧光物 质的保 存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。 (二)荧光物质 1．荧光素 荧光素是 能产生明 显的荧 光并能 作为染 料使用的 有机化 合物。 常用的 荧光 素有： (1)异 硫 氰 酸 荧光 素 (fluorescein isothiocyanate,FITC) 纯品为黄色 或橙黄色结晶粉末，易溶于 水和酒精等溶剂。分 子量为 389.4，最大吸 收光波长 为 490～495nm，最大发 射光波长为 520～530nm，呈明 亮的黄绿色荧光 。有两种 同分异构体 ，其中 异构体 Ⅰ型在效 率、稳 定性、 与蛋白质 结合力 等方面 都更良 好，在冷暗 干燥处 可保存 多年，是 应用最 广泛的 荧光素。 其主要 优点是 ：①人 眼对黄绿色 较为敏 感，② 通常切片 标本中 的绿色 荧光少于 红色， 有利于 降低背 景干扰。 (2)四乙基罗 丹明(rhodam ine,RB200) 为橘 红色粉末 ，不溶于 水，易 溶于 酒精和丙酮 ，性质稳 定，可 长期保存 。最大吸 收光波长 为 570n m，最大 发射光 波长为 595～600nm，呈橘红色荧光
(3)四甲基异硫氰酸罗丹明(tetranethyl rhodamine isothiocynate,TRITC) 为罗丹明的句生物，为紫红色粉末，较稳定，最大吸收光波长为550m■，最大 发射光该长为20■：呈橙红色萸光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合 用于双标记，其异硫氰基可与蛋白质结合。但荧光效率较低， (4)藻红蛋白(phycoerythrin,.PE)是从红藻(red algate)中提取的一种 藻胆蛋白(phycob11 iprotein),最大吸收波长为490m■-560mn,潘发产生的荧 光波长为595n,景现红色荧光。PE可和F1TC同时用于对各种抗体或配体进行 双标记，在流式荧光免疫技术中较常用 2,其他荧光物质 (1)细系稀土元素某些三价阀系稀土元素如铕(Ew")、够(S■)，献(Tb“) 等的整合物可发射特征性的荧光，其中以E▣“应用最广。Eu“整合物激发光波长 范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适合于时间分辨荧光免疫测 定。 (2)酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无凳光效应，一旦经酶作用 便形成具有强荧光的物质，例如，4-甲基伞解-B-D半乳糖苷(G),受B-半乳 糖普酶(B-G)的作用分解成4-甲基伞酮(WU),后者可发出荧光，藏发光被长为 360nm:发射光被长为4S0nn,其他如碱性南酸南(AP)的底物，4-甲基伞附磷酸 盐(WUP)和辣根过氧化物酶（阳P)的底物，对羟基苯乙酸(PA)等都具有荧光成物 的性质，可以用于酶免疫荧光分析（表16-1）。 表18-1酶和荧光底物 酶 底物 产物 激发光 发射光 相应的信号 B-G MUG W 360 450 10 AP MUP 360 450 10 HRP HPA 二聚体 317 414 0.03 二、 荧光标记物的制备 (一)荧光素标记物的制备 1。荧光素标记抗体的方法 用于荧光素标记的抗体应具有高特异性和高亲和力。所用抗血清中不应含 有针对标本中正常组凯的抗体。一般需经纯化，提取1xG后再作标记。 作为标记的荧光素应符合以下条件：①应具有与蛋白顾分子形成稳定共铃 健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的荧光素及其降解产物易
(3)四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamin e isothio cynate, T RITC) 为罗丹明的 衍生物， 为紫红 色粉末， 较稳定。 最大吸收 光波长 为 550nm，最大 发射光波长为 620 nm，呈橙红色荧 光，与 FI TC 的翠绿 色荧光对比鲜明 ，可配合 用于双标记。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。 (4)藻红蛋白 (phycoerythrin,PE) 是从红藻 (red algate)中提 取 的 一 种 藻胆蛋白(phycobiliprotein)，最大吸 收波长为 490n m～560nm，激发 产生的荧 光波长为 595nm，呈现红色荧 光。PE 可和 FITC 同时用 于对各种抗体或 配体进行 双标记，在流式荧光免疫技术中较常用。 2．其他荧光物质 (1)镧系稀土元素 某 些三价镧系稀土 元素如铕(Eu3 + )、钐(Sm3 + )、铽 (Tb3 + ) 等的螯合物可发射特征性的荧光，其中以 Eu3 +应用最广。Eu 3 +螯合物激 发光波长 范围宽、发 射光波 长范围 窄、荧光 衰变时 间长， 最适合于 时间分 辨荧光 免疫测 定。 (2)酶作用后产生荧光的物质 某些化 合物本身无荧光 效应，一旦经酶 作用 便形成具有强荧光的物 质。例如，4-甲基伞酮-β -D 半乳糖苷(MUG )，受β-半乳 糖苷酶(β-G)的作用分 解成 4-甲基伞 酮(MU)，后者可 发出荧光，激发 光波长为 360nm，发射光波长 为 450nm。其他如 碱性磷酸酶(AP)的底物，4-甲基 伞酮磷酸 盐(MUP)和辣根过氧化物 酶(HRP)的底物 ，对羟基苯乙 酸(HPA)等都具有 荧光底物 的性质，可以用于酶免疫荧光分析(表 16-1)。 表 18-1 酶和荧光底物 酶 底物 产物 激发光 发射光 相应的信号 β-G MUG MU 360 450 10 AP MUP MU 360 450 10 HRP HPA 二聚体 317 414 0.03 二 、 荧 光 标记物的 制备 (一)荧光素标记物的制备 1．荧光素标记抗体的方法 用于荧光 素标记的 抗体应 具有高 特异性 和高亲和 力。所 用抗血 清中不 应含 有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化，提取 IgG 后再作标记。 作为标记 的荧光素 应符合 以下条 件：① 应具有与 蛋白质 分子形 成稳定 共价 键的化学基 团，与 蛋白质 结合后不 易解离 ，而未 结合的荧 光素及 其降解 产物易
于去除。②荧光效率高，与蛋自质结合后，仍能保特较高的荧光效率。③荧光 色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后，不影响蛋白顺原有的生 化和免疫性质。⑤标记方法简单、安全无毒。团与蛋白质的结合物稳定，易于 保存。 常用的标记方法有授拌法和透析法两种。搅锌标记法：以FTC标记为例， 先将待标记的蛋白质溶液用0.5o1/LpH9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力 授拌下逐滴加入PITC溶液，在室温持续搅样4~6h后，离心，上清即为标记物。 此法适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。优点是标记时间短，荧光素 用量少·但本法的影响因素多，若操作不当会引起较强的丰特异性荧光染色。 透析标记法：仍以FIT℃标记为例，先将特标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置 于含FITC的0,01aol/儿pH9,4碳酸盐缓冲液反应过夜，以后再对PBS透析去除 游离荧光素。低违离心，取上清即为标记物。此法逅用于标记样品量少，蛋自 含量低的抗体溶液。此法标记均匀，非特异性荧光染色也较弱， 2,荧光素标记抗体的鲍化 抗体标记完成后，还应对标记抗体作进一步纯化，以去除游离的突光素· 可采用透析法和减胶柱层析法(Sephadex G-25或Sephadex G-5O):采用DEAE- 纤维素或DEAE-Sephadex A-50离子交换层析法去除未标记及过度标记的抗体： 采用组织制剂（正常大白鼠或小白鼠的肝粉）吸收法和固相抗解吸收法去除非期 望抗体或交叉反应抗体。 3,荧光素标记抗体的鉴定 荧光素标记的抗体，在使用前应加以鉴定。鉴定指标包括抗体效价（抗体活 性)和荧光素与蛋白质结合比率等。抗体效价可以用脂双扩散试验进行满定， 效价大于1：16者较为理想：荧光素与蛋自质结合比半(F/P)的测定和计算方法 是：将制备的荧光抗体溶液稀释至A,钓为1.0，分别测定标记荧光素的特异 吸收峰和蛋白质特异吸收峰(A:,),按公式计算， (FITC)F/P=- 287×An5m n=-035XA4# F/P比值越高，说明抗体分子上结合的黄光素越多，反之则感少。一般用于 固定标本的抗体以F/P比值=1.5为宜，用于活细胞染色的以F/P=2.4为宜
于去除。② 荧光效 率高， 与蛋白质 结合后 ，仍能 保持较高 的荧光 效率。 ③荧光 色泽与背景 组织的 色泽对 比鲜明。 ④与蛋 白质结 合后，不 影响蛋 白质原 有的生 化和免疫性 质。⑤ 标记方 法简单、 安全无 毒。⑥ 与蛋白质 的结合 物稳定 ，易于 保存。 常用的标记方法有搅拌法和透析法两种。搅拌标记法：以 FITC 标记为例 ， 先将待标记的蛋白质溶液用 0.5mol/L pH9.0 的碳酸盐 缓冲液平衡，随 后在磁力 搅拌下逐滴加入 FITC 溶 液，在室 温持续搅拌 4～6 h 后，离心 ，上清即 为标记物。 此法适用于 标记体 积较大 、蛋白含 量较高 的抗体 。优点是 标记时 间短， 荧光素 用量少。但 本法的 影响因 素多，若 操作不 当会引 起较强的 非特异 性荧光 染色。 透析标记法：仍以 FIT C 标记为例，先 将待标记的蛋白 质溶液装入透析 袋中，置 于含 FITC 的 0.01mol/L pH9.4 碳酸盐 缓冲液反应过夜 ，以后再对 PBS 透析去除 游离荧光素 。低速 离心， 取上清即 为标记 物。此 法适用于 标记样 品量少 ，蛋白 含量低的抗体溶液。此法标记均匀，非特异性荧光染色也较弱。 2．荧光素标记抗体的纯化 抗体标记 完成后， 还应对 标记抗 体作进 一步纯化 ，以去 除游离 的荧光 素。 可采用透析法和凝胶柱 层析法(Sephadex G-25 或 Sephadex G-50)；采 用 DEAE- 纤维素或 DEAE-Sephade x A-50 离子交换 层析法去除未标 记及过度标记的 抗体； 采用组织制 剂(正 常大白鼠 或小白 鼠的肝 粉)吸收 法和固 相抗原吸 收法去 除非期 望抗体或交叉反应抗体。 3．荧光素标记抗体的鉴定 荧光素标记的抗体，在使用前应加以鉴定。鉴定指标包括抗体效价(抗 体活 性)和荧光素与蛋白质结合比率等。抗体效价可以用琼脂双扩散试验进行滴定， 效价大于 1∶16 者较为 理想。荧光素 与蛋白质结合比 率(F/P)的测定和 计算方法 是：将制备的荧光抗体溶液稀释至 A280nm 约为 1.0，分别测定标记荧光素的特异 吸收峰和蛋白质特异吸收峰（A280nm），按公式计算。 (FITC)F/P= A nm A nm A 280 495 495nm 0.35 2.87 − F/P 比值越高，说明抗体分子 上结合的荧光素 越多，反之则越少。一般 用于 固定标本的抗体以 F/P 比值=1.5 为宜，用于活细胞染色的以 F/P=2.4 为宜
抗体的工作浓度的确定方法是，将荧光抗体做一系列倍比稀释(1：4一1： 256),对切片标本作荧光抗体染色，以能清晰显示特异性荧光且非特异桌色端 的最高稀释度为茂光抗体工作浓度。 荧凳抗体的保存最好小量分装(0.51/瓶)，-20℃冻存，这样可放置3一4 年。在4℃中一般也可存放1一2年。 (二)佩系稀土元素标记物的制备 铜系稀土元素离子不能直接与蛋自质结合，因此需要利用具有双功能基团 的整合剂。将解士元素与抗体或抗原分子的氨基偶联，以获得稳定的解土元素 标记物。 1.常用的酸合剂①多我基酸类整合剂：异硫氰酸-苯基-EDTA、异疏氰酸 -苯基-DTTA,二乙烯三腹五乙酸(DPTA)和环肝(CDPTA)等。②B-二解体类螯合 剂12-泰酰三额丙酮(2-NTA》,③1174,4,7-双（氯化苯酚磺酸盐）-1,10菲洛林 (简称BCPDA). 2。标记方法对于抗体和完全抗原可直接标记，对于小分子半抗原则需先 与大分子载体蛋白如牛血清白蛋白(BS),多聚赖氨酸等连接，再标记E"”。标 记方法分为一步法和二步法两种。一步法是鑫合剂先整合E"，再连接蛋白顺。 方法是！在纯化的抗体溶液中加入Eu“-TTA整合物，调H至9,5,4℃反应 过夜。用5 ephacry1S-200凝胶柱层析，经A,值测定，收集含蛋自的洗脱液， 同时取样加黄光增强液测定Ea"含量。按公式Ea”/IgG=Eu”(μo1/L)/蛋白（μ o1/L),计算标记率，一般为10.0左右. 二步法是先连接蛋自质，再整合E”。方法是：在纯化的杭体溶液中加入 DPTA整合剂，博旧至7.O,快速旋动混合，室温反应，4℃透析除去未结合的 DPTA。加入EuCl,或SC1:溶液，室温搅拌反应。用Sephadex G-50凝胶柱层析， 其余步露同一步法。 第二节荧光免度显撒技术 Immunofluoresceat Microscopy Technique 一、基本原理
抗体的工 作浓度的 确定方 法是： 将荧光抗 体做一 系列倍 比稀释( 1∶4～ 1∶ 256)，对切 片标本 作荧光抗 体染色 。以能 清晰显 示特异性 荧光且 非特异 染色弱 的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。 荧光抗体 的保存 最好小 量分装(0.5 ml/瓶)，-20℃ 冻存， 这样可 放置 3～4 年。在 4℃中一般也可存放 1～2 年。 (二)镧系稀土元素标记物的制备 镧系稀土 元素离子 不能直 接与蛋 白质结 合，因此 需要利 用具有 双功能 基团 的螯合剂， 将稀土 元素与 抗体或抗 原分子 的氨基 偶联，以 获得稳 定的稀 土元素 标记物。 1．常用的螯合剂 ①多羧基酸 类螯合剂：异硫氰酸-苯基-E DTA、异硫 氰酸 -苯基-DTTA、二乙 烯三胺 五乙酸( DPTA)和 环酐(CDPTA )等。 ②β-二酮体 类螯合 剂：2-萘酰三氟丙酮(2-NTA)。③ W1174、4,7-双(氯化 苯酚磺酸盐)-1,1 0 菲洛林 (简称 BCPDA)。 2．标记方法 对于抗体和完 全抗原可直接标 记，对于 小分子半抗原则 需先 与大分子载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、多聚赖氨酸等 连接，再标记 Eu3 +。标 记方法分为一步法和二步法两种。一步法是螯合剂先螯合 Eu3 +，再连接蛋白质。 方法是：在纯化的抗体溶液中加入 Eu3 + - DTTA 螯合物 ，调 pH 至 9.5，4℃反应 过夜。用 Sephac ryl S-200 凝胶 柱层析，经 A280nm 值测定，收集含蛋白 的洗脱液， 同时取样加荧光增强液测定 Eu3 +含量。按公式 Eu3 + /IgG= Eu3 + (μmol/L) /蛋白(μ mol/L)，计算标记率，一般为 10.0 左右。 二步法是先 连接蛋白 质，再螯 合 Eu3 +。方法 是：在纯 化的抗 体溶液中 加入 DPTA 螯合剂， 调 pH 至 7.0，快速旋 动混合，室温反 应，4℃透析除去 未结合的 DPTA。加入 EuCl3 或 SmCl3 溶液 ，室温搅拌 反应。用 Se phadex G-50 凝 胶柱层析， 其余步骤同一步法。 第二节 荧 光 免 疫显微技术 Immunofluorescent Microscopy T e chniq ue 一 、 基 本 原理
荧充免疫显微技术是以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记特异性抗体 或抗抗体，检测固定组织饵胞上的抗原或血清中的抗体，常用于定性和定位检 查的一门技术。 二、技术类型 根据标记物和反应程序的不同，可将荧光免疫显微技术分为直接法、间接 法，补体结合法和双标记法等四类。 1,直接法用受光素标记特异性抗体，将特异性受光抗体直接滴加于待测 标本上，直接与相应抗原反应（图18-1》。此法常用于细商和病毒等病原微生物 的快速检测、肾活检及皮肤活检的免疫病理检查， 图18-1直接荧光免度法示意图 2.阿接法用荧光素标记抗球蛋白抗体（抗抗体），特基质标本中的抗原与 相应抗体（第一抗体）反应，再用光素标记的抗抗体（第二抗体）结合第一抗体， 通过荧光现象检查抗原暖抗体（图18-）。此法常用于检测各种自身抗体 图18一2间接荧光免疫法示意图 3,补体结合法用羹光素标记抗补体抗体，待基质标本中的抗原与抗体反 应后，加入补体，补体和抗原抗体复合物结合，再加入荧光素标记的抗补体抗 体，通过荧光现象检查抗凰或抗体（图18-3）， 图18-3补体结合荧光免疫法示意图 4,双标记法用两种荧光素(FITC和RB200》分别标记不同抗体，对同一 标本进行荧光染色，若有相应的两种抗原同时存在，在爱光显微镜下用两种不 同的激发光，同时显示两种荧光（黄绿色和橘红色荧光），方法与直接法相同。 本法主要用于月时观察细胞表面两种抗原的分布与消长关系，区分末椭血或同 一切片中T和B细胞等。 三、技术要点 荧亮免疫显微技术主要包括标本的制作、荧光抗体染色和荧光显微镜检查 等步裸。 (一)标本的制作 荧免疫显微技术主要靠观察标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定 和定位，因此标本制作的好坏直接影响到检测结果。在制备标本过程中，应力 求保持抗原的光整性，并在桌色和洗涤等过程中不发生溶解和变性，也不扩散
荧光免疫 显微技术 是以荧 光显微 镜为检 测工具， 用荧光 素标记 特异性 抗体 或抗抗体， 检测固 定组织 细胞上的 抗原或 血清中 的抗体， 常用于 定性和 定位检 查的一门技术。 二 、 技 术 类型 根据标记 物和反应 程序的 不同， 可将荧 光免疫显 微技术 分为直 接法、 间接 法、补体结合法和双标记法等四类。 1．直接法 用荧光素标记特 异性抗体 ，将特异性荧光 抗体直接滴加于 待测 标本上，直接与相应抗原反应(图 18- 1)。此法常用于 细菌和病毒等病 原微生物 的快速检测、肾活检及皮肤活检的免疫病理检查。 图 18-1 直接荧光免疫法示意图 2．间接法 用荧光素标记抗 球蛋白抗体(抗抗 体)，待 基质标本中的抗 原与 相应抗体(第一抗体)反 应，再用荧光 素标记的抗抗体(第二抗体)结合 第一抗体， 通过荧光现象检查抗原或抗体(图 18-2)。此法常用于检测各种自身抗体。 图 18-2 间接荧光免疫法示意图 3．补体结合法 用荧光素标 记抗补体抗体 ，待基质标 本中的抗原与抗 体反 应后，加入 补体， 补体和 抗原抗体 复合物 结合， 再加入荧 光素标 记的抗 补体抗 体，通过荧光现象检查抗原或抗体(图 18-3)。 图 18-3 补体结合荧光免疫法示意图 4．双标记法 用两种荧光素 (FITC 和 RB200) 分别标记不同 抗体，对 同一 标本进行荧 光染色 ，若有 相应的两 种抗原 同时存 在，在荧 光显微 镜下用 两种不 同的激发光 ，同时 显示两 种荧光(黄绿色 和橘红色 荧光)，方法与 直接法 相同。 本法主要用 于同时 观察细 胞表面两 种抗原 的分布 与消长关 系，区 分末梢 血或同 一切片中 T 和 B 细胞等。 三 、 技 术 要点 荧光免疫 显微技术 主要包 括标本 的制作 、荧光抗 体染色 和荧光 显微镜 检查 等步骤。 (一)标本的制作 荧光免疫 显微技术 主要靠 观察标 本上荧 光抗体的 染色结 果作为 抗原的 鉴定 和定位，因 此标本 制作的 好坏直接 影响到 检测结 果。在制 备标本 过程中 ，应力 求保持抗原 的完整 性，并 在染色和 洗涤等 过程中 不发生溶 解和变 性，也 不扩散
至临道细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜 检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。 常见的临床标本材料主要有组织、细胞和细菌三大类。按不同标本可制作 涂片，印片或切片。组织材料可制备成石蜡切片或冷漆切片。石蜡切片对于组 织细胞的精细结构显现清楚，可用于回顾性研究，但对抗原的保存量不如冷冻 切片，操作烦项，结果不稳定，非特异性荧光反应强。冷冻切片可使抗原大量 的保存，操作简便，自发荧光较少，缺点是组织结构欠清晰。粗织材料也可制 成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片黏上1一2层组织细散。细 胞或细菌可制成涂片，涂片应湖面均匀。培养的细胞可待细胞在玻片上培养生 长形成单层，悬浮培养的饵胞可制成涂片，还可将培养细胞用病毒或病人标本 感染。用荧光抗体染色法检查病毒。 除活细胞外，其他标本片应在染色前以适当方式固定·丙酮和乙醇是常用 的固定剂。尤以冷丙翻对冷冻切片的倒定效果好。面乙醇知95冰桶酸对于涂片 抗原的因定效果较理想。周定时间5一15■1。对制备好的标本应尽快染色检查， 或置-20℃下低温保存。 (二)荧光抗体染色 在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，置带盖的提盒内，在一定 温度下温有一定时间，一取以25一37℃温有30■m,不耐格抗源的检测期以4℃ 过夜为宜。盟育后充分洗涤干燥， (三)荧光显微镜检查 经羹光抗体染色的标本，需要在冀光显微镜下观察。最好在染色当天即作 镜检，以防荧光消退。影响结果。荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。 荧光显微镜与普通显微镜的不月之处在于光源、滤光片、聚光器及镜头等 1,光源由于荧光物质的量子效率极低，要有一个很强的激发光源，通常 用高压系灯、氩灯或卤素灯做为激发光源。 2。滤光片滤光片的正确选择是获得良好荧光观黎效果的重要条件。滤光 片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片。隔热滤光片安装在灯室的聚光 镜前面，能阻断红外线的通过而隔热。在光源前面的一组激发滤光片：其作用 是提供合适的激发光。激发滤光片有两种，其中紫外光滤片（心G)只透过波长 275~400m■的紫外光，最大透光度在365n■：蓝紫外光滤片(BG)具透过波长
至临近细胞 或组织 间隙中 去。标本 切片要 求尽量 薄些，以 利抗原 抗体接 触和镜 检。标本中干扰抗原抗体反应 的物质要充分洗 去，有传染性的标本要 注意安全。 常见的临 床标本材 料主要 有组织 、细胞 和细菌三 大类。 按不同 标本可 制作 涂片、印片 或切片 。组织 材料可制 备成石 蜡切片 或冷冻切 片。石 蜡切片 对于组 织细胞的精 细结构 显现清 楚，可用 于回顾 性研究 ，但对抗 原的保 存量不 如冷冻 切片，操作 烦琐， 结果不 稳定，非 特异性 荧光反 应强。冷 冻切片 可使抗 原大量 的保存，操 作简便 ，自发 荧光较少 ，缺点 是组织 结构欠清 晰。组 织材料 也可制 成印片，方法是用洗净 的玻片轻压组织 切面，使玻片粘 上 1～2 层组织 细胞。细 胞或细菌可 制成涂 片，涂 片应薄而 均匀。 培养的 细胞可待 细胞在 玻片上 培养生 长形成单层 ，悬浮 培养的 细胞可制 成涂片 ，还可 将培养细 胞用病 毒或病 人标本 感染，用荧光抗体染色法检查病毒。 除活细胞 外，其他 标本片 应在染 色前以 适当方式 固定。 丙酮和 乙醇是 常用 的固定剂，尤以冷丙酮对冷冻 切片的固定效果 好，而乙醇加 95%冰醋酸 对于涂片 抗原的固定效果较理想。固定 时间 5～15min。对制备 好的标本应尽快 染色检查， 或置-20℃下低温保存。 (二)荧光抗体染色 在已固定 的标本上 滴加经 适当稀 释的荧 光抗体， 置带盖 的湿盒 内，在 一定 温度下温育一定时间，一般以 2 5～37℃温育 30 min。不耐热抗原的检测 则以 4℃ 过夜为宜。温育后充分洗涤干燥。 (三)荧光显微镜检查 经荧光抗 体染色的 标本， 需要在 荧光显 微镜下观 察。最 好在染 色当天 即作 镜检，以防荧光消退，影响结果。荧 光显微镜检查应 在通风良好的暗 室内进行。 荧光显微镜与普通显微镜的不同之处在于光源、滤光片、聚光器及镜头等。 1．光源 由于 荧光物质的量子 效率极低，要有一个很强的 激发光源，通常 用高压汞灯、氙灯或卤素灯做为激发光源。 2．滤光片 滤光片 的正确选 择是获 得良好荧 光观察效 果的重要 条件。 滤光 片分为隔热 滤光片 、激发 滤光片和 吸收滤 光片。 隔热滤光 片安装 在灯室 的聚光 镜前面，能 阻断红 外线的 通过而隔 热。在 光源前 面的一组 激发滤 光片， 其作用 是提供合适的激发光。激发滤光片有两种，其中紫外光滤片 (UG)只透过波长 275～400nm 的紫外光，最大透光度在 365nm；蓝紫外光 滤片 (BG) 只 透过波长
325-500■的置餐外光，最大透光度为410■m。章近目镜的一组吸收滤光片的 作用是滤除激发允，只允许黄光通过，透光范围为410~850■，代号有0G(橙 黄色》和GG(淡绿黄色》两种。观察FITC标志物可选用激发滤光片BG12。配以吸 收滤光片0G4成GG9。观察RB200标记物时，可达用BG12与0G5配合。 3,聚充器聚光器有明视野、暗视野和相差荧光器等。紧光器不应吸收紫 外线，它与光源、光路、激发滤光片适宜组合，以期在■色的背景上铁得满意 的荧光。 4.镜头镜头需无荧光。目镜有消色差、氟及复消色差三类镜头，常用的 是消色差镜头。 5。光路光路分为透射光和落射光两种形式。透射光的照明光线从标本下 方经过聚光器会聚后透过标本进入物镜，适干观察对光可透的标本。落射光的 黑明光线从标本上方经特殊的分光镜（同义词：分色镜，反射镜）反射从物镜周 围落射到标本上，荧光经标本反射面进入物镜，适于观察透明度不好的标本以 及各种活性组织等。落射光与透射光联合照明，可同时观察两种荧光煮的荧光， 成同时观察发荧允物质在细型内的定位， 6,荧光强度判定特异性荧光强度的判断一般用“+”号表示。“-”为无 成仅见极微蛋荧光：“+”为荧光较蛋但清楚可见：“+”为荧光明亮：“++”为 曜眼的强荧光。临床上根据特异性荧光强度达“++”以上判定为阳性，面对黑 光应星“-”或“土”。根据星“+”的血请最高稀释度判定特异性抗体效价。 在荧光显微镜检查中，非特异性荧光染色是直接影响检测结果的主要问题。 非特异性荧光染色可能是某些抗原的白发荧光及交叉反应等所致，可以通过对 黑进行签别与排除。羹光抗体染色的对儒包括阳性和阴性对照。阳性对無即为 己知的阳性对盟，阴性对照包括：①用与特异性抗体种属相同的动物血清成同 一动物免疫前的血清标记荧光素代替特异性抗体，结果应为阴性，②染色抑制 试验：将未标记荧光煮的抗体先与切片的杞抗原反应，然后再加荧光煮标记的 相同抗体，结果应为路阳性成阴性。③用PBS代替荧光抗体，结果应为阴性。 ④标本自发爱光对照，即切片标本轻P5洗后不加荧光抗体，应为阴性。 四、方法评价 荧光免疫最微技术可用于组织学中抗原或抗体的定位、定性检查，既有抗 原抗体反应的高度特异性，又能在萸光显微镜下清晰地显示其形态。直观性强
325～500nm 的蓝紫外光，最大透光度为 410nm。靠近 目镜的一组吸收 滤光片的 作用是滤除激发光，只允许荧光通过，透光范围为 410～650nm，代号有 OG(橙 黄色)和 GG(淡绿黄色)两种。观察 FITC 标志物 可选用激发滤光 片 BG12，配以吸 收滤光片 OG4 或 GG9。观察 RB200 标记物时，可选用 BG12 与 OG5 配合。 3．聚光器 聚 光器有明视野 、暗视野和相 差荧光器等 。聚光器不应吸 收紫 外线，它与 光源、 光路、 激发滤光 片适宜 组合， 以期在黑 色的背 景上获 得满意 的荧光。 4．镜头 镜头需无荧光。目 镜有消色差、氟及复 消色差三类镜头，常 用的 是消色差镜头。 5．光路 光 路分为透射光和 落射光两种形式 。透射光 的照明光线从标 本下 方经过聚光 器会聚 后透过 标本进入 物镜， 适于观 察对光可 透的标 本。落 射光的 照明光线从 标本上 方经特 殊的分光 镜(同 义词：分 色镜、 反射镜)反射从 物镜周 围落射到标 本上， 荧光经 标本反射 而进入 物镜， 适于观察 透明度 不好的 标本以 及各种活性组织等。落射光与透射光联合照明，可同时观察两种荧光素的荧光， 或同时观察发荧光物质在细胞内的定位。 6．荧光强 度判定 特异 性荧光强 度的判 断一般 用“+” 号表示。“-” 为无 或仅见极微弱荧光；“+”为荧光较弱但 清楚可见；“++”为荧光明亮；“+++”为 耀眼的强荧 光。临 床上根 据特异性 荧光强 度达“+ +”以上 判定为 阳性， 而对照 光应呈“-”或“±”。根据呈“++”的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 在荧光显微镜检查中 ，非特异性荧光 染色是直接影响 检测结果的主要 问题。 非特异性荧 光染色 可能是 某些抗原 的自发 荧光及 交叉反应 等所致 ，可以 通过对 照进行鉴别 与排除 。荧光 抗体染色 的对照 包括阳 性和阴性 对照。 阳性对 照即为 已知的阳性 对照， 阴性对 照包括： ①用与 特异性 抗体种属 相同的 动物血 清或同 一动物免疫 前的血 清标记 荧光素代 替特异 性抗体 ，结果应 为阴性 。②染 色抑制 试验：将未 标记荧 光素的 抗体先与 切片的 靶抗原 反应，然 后再加 荧光素 标记的 相同抗体，结果应为弱阳性或阴性。③用 PBS 代替荧 光抗体，结果应 为阴性。 ④标本自发荧光对照，即切片标本经 PBS 洗后不加荧光抗体，应为阴性。 四 、 方 法 评价 荧光免疫 显微技术 可用于 组织学 中抗原 或抗体的 定位、 定性检 查，既 有抗 原抗体反应的高度特异性，又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强
其缺点是荧光容易消退，难以制备水久性标本，非特异荧光的干扰常影响结果 的判新 直接荧允免疫法操作简梗，特异性高、非特异性荧完干扰因素少，缺点是 敏感性偏低，而且每检查一种抗原需制备相应的特异性荧充抗体。间接荧光免 疫法的敏感性高干直接法，面且制备一种笑光抗体可用于检测多种抗原或抗体， 缺点是参与的因素多，易出现非特异性荧光，操作时间较长。补体结合荧光免 授法的敏感性高，制备一种荧光抗补体抗体可检测多种抗原或航体，并且适用 于任何动物的抗原抗体系统，峡点是易出现非特异性荧光染色，并且每次试验 都需要新鲜补体，操作复桑· 五、临束应用 荧充免疫显微技术在临床检验中已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身 免疫病的诊断等。 1,鱼清中自身航体的检测荧光免疫是微技术是橙测各种白身抗体的良好 工具，在自身免疫病的实验诊断中应用日益广泛。其突出的优点是能够用简单 的方法同时检测抗体和与抗体起特异反应的组织成分，并且能够在同一组枫中 同时检查抗不同组织成分的抗体。主要用于检查抗核抗体、抗线粒体抗体、抗 平带肌抗体，抗山sDWA抗体，抗甲状腺球蛋白抗体、抗骨骼肌抗体及抗肾上腺 抗体等。 2,各种微生物的快遮检查和整定在细面学检验中主要用于商种的整定， 如脑膜炎奈氏阁、荆疾志贺菌、霍乱弧南，布氏杆菌和炭疽杆菌等的鉴定，比 细南鉴定的其他直清学方法速度快，操作简便，做感性高。国在细菌实验诊断 中，常作为一种补充手段使用，不能代替常规诊断。荧光抗体荣色法检测血清 中的抗体可用干流行病学调查和临床国顺诊断。用羹光抗体染色法检测梅毒螺 旋体抗体是梅毒特异性诊断的常用方法之一·荧光免疫技术在病毒学检险中具 有重要意义，因为普通光学显微镜看不到病毒，用蒙光抗体染色法可检出病毒 及其繁殖情况， 3,寄生虫感染的珍断以间接荧光免疫法应用非常广泛，是当前公认的最 有效的检测老疾抗体的方法，对肠外可米巴、尤其是阿米巴肝脓肿也有很高的 诊断价值
其缺点是荧 光容易 消退， 难以制备 永久性 标本， 非特异荧 光的干 扰常影 响结果 的判断。 直接荧光 免疫法操 作简便 、特异 性高、 非特异性 荧光干 扰因素 少，缺 点是 敏感性偏低 ，而且 每检查 一种抗原 需制备 相应的 特异性荧 光抗体 。间接 荧光免 疫法的敏感性高于直接 法，而且制备 一种荧光抗体可 用于检测多种抗 原或抗体， 缺点是参与 的因素 多，易 出现非特 异性荧 光，操 作时间较 长。补 体结合 荧光免 疫法的敏感 性高， 制备一 种荧光抗 补体抗 体可检 测多种抗 原或抗 体，并 且适用 于任何动物 的抗原 抗体系 统，缺点 是易出 现非特 异性荧光 染色， 并且每 次试验 都需要新鲜补体，操作复杂。 五 、 临 床 应用 荧光免疫 显微技术 在临床 检验中 已用作 细菌、病 毒和寄 生虫的 检验及 自身 免疫病的诊断等。 1．血清中自身抗体的检 测 荧光免疫 显微技术是检测 各种自身抗体的 良好 工具，在自 身免疫 病的实 验诊断中 应用日 益广泛 。其突出 的优点 是能够 用简单 的方法同时 检测抗 体和与 抗体起特 异反应 的组织 成分，并 且能够 在同一 组织中 同时检查抗 不同组 织成分 的抗体。 主要用 于检查 抗核抗体 、抗线 粒体抗 体、抗 平滑肌抗体、抗 dsDNA 抗体、抗甲状 腺球蛋白抗体、 抗骨骼肌抗体及 抗肾上腺 抗体等。 2．各种微生物的快速检查和鉴定 在 细菌学检验中主 要用于菌种的鉴 定， 如脑膜炎奈 氏菌、 痢疾志 贺菌、霍 乱弧菌 、布氏 杆菌和炭 疽杆菌 等的鉴 定，比 细菌鉴定的 其他血 清学方 法速度快 、操作 简便、 敏感性高 。但在 细菌实 验诊断 中，常作为 一种补 充手段 使用，不 能代替 常规诊 断。荧光 抗体染 色法检 测血清 中的抗体可 用于流 行病学 调查和临 床回顾 诊断。 用荧光抗 体染色 法检测 梅毒螺 旋体抗体是 梅毒特 异性诊 断的常用 方法之 一。荧 光免疫技 术在病 毒学检 验中具 有重要意义 ，因为 普通光 学显微镜 看不到 病毒， 用荧光抗 体染色 法可检 出病毒 及其繁殖情况。 3．寄生虫感染 的诊断 以间 接荧光免疫法应 用非常广泛 ，是当前公认 的最 有效的检测 疟疾抗 体的方 法，对肠 外阿米 巴、尤 其是阿米 巴肝脓 肿也有 很高的 诊断价值