1月3日，武汉市卫健委发布不明原因病毒性肺炎最新通报：2019年12月以来， 我委开展呼吸道疾病及相关疾病监测，发现不明原因的病毒性肺炎病例，病例临 床表现主要为发热，少数病人呼吸困难，胸片呈双肺浸润性病灶。截至2020年 1月3日8时，共发现符合不明原因的病毒性肺炎诊断患者44例，其中重症11 例，其余患者生命体征总体稳定。目前所有病例均在武汉市医疗机构接受隔离治 疗，已经追踪到121名密切接触者并行医学观察，密切接触者的追踪工作仍在进 行中。病原鉴定（包括核酸检测和病毒分离培养）和病因溯源工作正在进行中， 己排除流感、禽流感、腺病毒感染等常见呼吸道疾病。 问题 1.如何快速确认病原体？未知序列的测序策略 2.病毒序列分析。 3.确认病毒序列后如何检测？ 如何进行大规模检测？ 自动化移液工作站 混检方式 检测方法 4.核酸检测和抗体检测的应用。 5.英国新冠病毒的突变位点有哪些？ 6.这些突变对新冠病毒的感染能力和检测有什么影响？ 1 SARS-CoV-2 SARS-oV-2是一种正义单链RNA病毒，在基因组水平上与蝙蝠冠状病毒 的同源性为96%，与SARS-CoV的同源性超过80%，与MERS的同源性超 过50%。同时，对SARS-CoV-2的7个保守性非结构蛋白域进行的成对蛋 白质序列分析也表明，该病毒属于冠状病毒 (severe acute respiratory syndrome-
1 月 3 日，武汉市卫健委发布不明原因病毒性肺炎最新通报：2019 年 12 月以来， 我委开展呼吸道疾病及相关疾病监测，发现不明原因的病毒性肺炎病例，病例临 床表现主要为发热，少数病人呼吸困难，胸片呈双肺浸润性病灶。截至 2020 年 1 月 3 日 8 时，共发现符合不明原因的病毒性肺炎诊断患者 44 例，其中重症 11 例，其余患者生命体征总体稳定。目前所有病例均在武汉市医疗机构接受隔离治 疗，已经追踪到 121 名密切接触者并行医学观察，密切接触者的追踪工作仍在进 行中。病原鉴定（包括核酸检测和病毒分离培养）和病因溯源工作正在进行中， 已排除流感、禽流感、腺病毒感染等常见呼吸道疾病。 问题： 1. 如何快速确认病原体？未知序列的测序策略 2. 病毒序列分析。 3. 确认病毒序列后如何检测？ 如何进行大规模检测？ 自动化移液工作站 混检方式 检测方法 4. 核酸检测和抗体检测的应用。 5. 英国新冠病毒的突变位点有哪些？ 6. 这些突变对新冠病毒的感染能力和检测有什么影响？ 1 SARS-CoV-2 SARS-oV-2 是一种正义单链 RNA 病毒，在基因组水平上与蝙蝠冠状病毒 的同源性为 96 %，与 SARS-CoV 的同源性超过 80 %，与 MERS 的同源性超 过 50 %。同时，对 SARS-CoV-2 的 7 个保守性非结构蛋白域进行的成对蛋 白质序列分析也表明，该病毒属于冠状病毒 （severe acute respiratory syndrome-
related rhinolophus bat coronavirus,SARSr-CoV),属于B-CoV的B 亚群。 SARS-CoV-2的基因组大小为29891个核苷酸，编码9860个氨基酸。其 按照5'-复制酶多聚糖蛋白(ORF1ab),刺突蛋白(S),小包膜糖蛋白 (E),膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)-3的顺序进行编码。在 SARS-CoV-2细胞膜表面存在了大量的刺突蛋白(S),这种蛋白以类似 于SARS-CoV的方式高亲和力结合人血管紧张素转化酶2（angotensin converting enzyme2,ACE2)受体，病毒膜随后与宿主细胞膜融合，以将 病毒介导到宿主细胞中。核衣壳蛋白(N)与病毒RNA相结合，参与病 毒的包装，可能具有RNA转录的开关功能。小包膜糖蛋白(E)与膜糖 蛋白(M)相互作用，参与病毒组装和释放。 值得注意的是，由于SARS-CoV-2缺乏聚合酶的校对活性，使其具有较 高的突变率。根据国家生物信息中心统计，SARS-CoV-2核苷酸变异数主 要集中于ORF1ab基因和S基因，其中ORF7a变异频率最高，ORF3a次 之。变异类型以单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)和缺失为主
related rhinolophus bat coronavirus，SARSr-CoV），属于 β- CoV 的 B 亚群。 SARS-CoV-2 的基因组大小为 29891 个核苷酸，编码 9860 个氨基酸。其 按照 5′ – 复制酶多聚糖蛋白（ORF1ab），刺突蛋白（S），小包膜糖蛋白 （E），膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N） – 3′的顺序进行编码。在 SARS-CoV-2 细胞膜表面存在了大量的刺突蛋白（S），这种蛋白以类似 于 SARS-CoV 的方式高亲和力结合人血管紧张素转化酶 2（angotensin converting enzyme 2，ACE2）受体，病毒膜随后与宿主细胞膜融合，以将 病毒介导到宿主细胞中。核衣壳蛋白（N）与病毒 RNA 相结合，参与病 毒的包装，可能具有 RNA 转录的开关功能。小包膜糖蛋白（E）与膜糖 蛋白（M）相互作用，参与病毒组装和释放。 值得注意的是，由于 SARS-CoV-2 缺乏聚合酶的校对活性，使其具有较 高的突变率。根据国家生物信息中心统计，SARS-CoV-2 核苷酸变异数主 要集中于 ORF1ab 基因和 S 基因，其中 ORF7a 变异频率最高，ORF3a 次 之。变异类型以单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）和缺失为主
包膜蛋白 膜蛋白 刺突蛋白 核衣壳蛋白 内含RNA 脂质膜 劫持 SARS-CoV-2如何在感染者的细胞中自我复制 SARS-CoV-2 细胞膜 M NM以 新SARS ④ CoV-2 ACE2 2 复制 6 RNA 复合物 个 病毒蛋白质 高尔基体 08 3 ← 蛋白质 → 制造机器 1病毒体上的刺突蛋白结合细胞表面的ACE2蛋白。蛋白酶TMPRSS2帮助病毒体进入细胞2病毒体释放RNA 3某些RNA由细胞机器翻译为蛋白质4其中某些蛋白质形成复制复合物，以生产更多的RNA 5蛋白质和RNA在高尔基体中组装成新的病毒体6释放 来源：Song et al.,Viruses,2019;Jiang etal,Emerging Microbes and Infections,,2012;《经济学人》
the authentic SARS-CoV-2 virus RNP hexon the"Eggs-in-a-nest” 90 RNP tetrahedron the“Pyramid RNP Prefusion RBD down S the“Flai Postfusion S the "Needle" Membrane Membrane 新冠英国突变株测序突变位点揭晓：与ACE2受体亲和力提高干倍」 由于新冠病毒的新变种，英国确诊病例数量在过去2周之内猛增，科学家 认为，这种新变种比原始毒株的传播性高出70%，S蛋白与人ACE2受体 结合亲和力提高了1000倍
新冠英国突变株测序突变位点揭晓:与 ACE2 受体亲和力提高千倍！ 由于新冠病毒的新变种，英国确诊病例数量在过去 2 周之内猛增，科学家 认为，这种新变种比原始毒株的传播性高出 70％，S 蛋白与人 ACE2 受体 结合亲和力提高了 1000 倍
疫情以来，虽然新亚型不断出现，但英国的这一新突变株的传播能力异 常恐怖。 这一毒株从9月在英国东南部出现，在英国迅速蔓延，目前已经成为 伦敦地区的主要毒株。该病毒株在英格兰东南部的新感染病例中占43%； 在英格兰东部占59%；在伦敦占62%。截止到12月10日英国已检测出 46,710个该毒株的感染者。 COG Table 1a.Priority mutations being tracked by COG-UK Mutation Predominant Reasons for tracking Cumulative Number over Lineage number in UK last 28 days (13/11/2020 10/12/20201 D614G 81 Moderate effect on 118,906 11,447 transmissibility A222V B1.177 Fast growing lineage but no 46,710 7,8$ evidence of mutation effect N439K B.1.141 1)Increased binding affinity to 3,320 246 B.1.258 hACE2 receptor 2)Escape to some mAbs 469-70 B.1.1 1)Evasion immune response 3504 1228 B.1.258 2)Diagnostic failure in some assays targeting the S gene including the three-target TagPath assay and the two-target Biofire assay N501Y B.1.1.7 Fast growing lineage increased 2,057 1,182 binding affinity to hACE2 receptor N501Y+ 8.1.1.7 Likely to maintain characteristics 1,524 1034 △69-70 described for N501Y and 69-70del N439K+ B.1.258 Likely to maintain characteristics 1,895 176 △69-70 described for N439Y and 69-70del Y453F B.1.1 1)Increase binding affinity to B.1.1.298 hACE2 receptor 2)Escape to some mAbs Human/mink associated umulative number as of December 15 based on data deposited into CLIMB.Caution is reauired the data will not include information from the last 2 weeks
疫情以来，虽然新亚型不断出现，但英国的这一新突变株的传播能力异 常恐怖。 这一毒株从 9 月在英国东南部出现，在英国迅速蔓延，目前已经成为 伦敦地区的主要毒株。该病毒株在英格兰东南部的新感染病例中占 43%； 在英格兰东部占 59%；在伦敦占 62%。截止到 12 月 10 日英国已检测出 46,710 个该毒株的感染者
一直追踪新冠病毒进化的英国爱丁堡大学教授Andrew Rambaut在 virological.org上传了新突变株序列的分析，指出这个新毒株有23个特殊 突变，被命名为B.1.1.7亚型
一直追踪新冠病毒进化的英国爱丁堡大学教授 Andrew Rambaut 在 virological.org 上传了新突变株序列的分析，指出这个新毒株有 23 个特殊 突变，被命名为 B.1.1.7 亚型
冠状病毒表面的刺突糖蛋白(spike glycoprotein,S)通过其受体结构 域(RBD)识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2), 在介导病毒包膜与细胞膜融合导致细胞感染的过程中发挥关键作用这使S 蛋白成为中和抗体和疫苗的主要抗原靶点。 SARS-CoV-2的S蛋白(Spike,刺突蛋白)与人类细胞表面的ACE2 受体结合是新冠病毒入侵人类细胞的第一步。这次的新病毒株，被发现其新 型冠状病毒表面刺突糖蛋白受体结合区(RBD)上的6个关键交界面氨基 酸中，发生一个突变N501Y;而Fuin切割位点毗邻位置发生了P681H突 变。 尽管N501Y早在南非出现过，但是与目前英国株的501Y.V2具有多个 不同突变。尤其是该英国株在RBD突变和Fuin毗邻同时出现了突变。大 家有在Nextstrain上可见这两个毒株分属不同进化枝。 Furin蛋白酶切割位点对SARS-CoV-2的宿主细胞结合能力影响重大， Furin切割后的S蛋白稳定性降低，暴露出开放结构，使S蛋白与ACE2受 体亲和力提高了近干倍。 这一毒株还发生了S抗原氨基酸删除突变69-70del,这一突变可能有 利于病毒逃逸宿主的免疫反应
冠状病毒表面的刺突糖蛋白( spike glycoprotein，S) 通过其受体结构 域( ＲBD) 识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶 2( ACE2) ， 在介导病毒包膜与细胞膜融合导致细胞感染的过程中发挥关键作用，这使 S 蛋白成为中和抗体和疫苗的主要抗原靶点。 SARS-CoV-2 的 S 蛋白（Spike，刺突蛋白）与人类细胞表面的 ACE2 受体结合是新冠病毒入侵人类细胞的第一步。这次的新病毒株，被发现其新 型冠状病毒表面刺突糖蛋白受体结合区（RBD）上的 6 个关键交界面氨基 酸中，发生一个突变 N501Y；而 Furin 切割位点毗邻位置发生了 P681H 突 变。 尽管 N501Y 早在南非出现过，但是与目前英国株的 501Y.V2 具有多个 不同突变。尤其是该英国株在 RBD 突变和 Furin 毗邻同时出现了突变。大 家有在 Nextstrain 上可见这两个毒株分属不同进化枝。 Furin 蛋白酶切割位点对 SARS-CoV-2 的宿主细胞结合能力影响重大， Furin 切割后的 S 蛋白稳定性降低，暴露出开放结构，使 S 蛋白与 ACE2 受 体亲和力提高了近千倍。 这一毒株还发生了 S 抗原氨基酸删除突变 69-70del，这一突变可能有 利于病毒逃逸宿主的免疫反应
a Receptor binding motif 6 N-terminal 5o脑n N-terminal domain Receptor binding motit 口a4s2 d Top view Class 1 Class4 Class 3 iass NTD Class 1 Class NTD Class 4 C科形蹈 目前变异病毒已蔓延至20多个国家。 问：英国新冠病毒的突变位点有哪些？ 答：本次英国病毒株共发生了17次非同义突变或插入缺失，其中，ORF1ab基因 4次、Spike基因8次、ORF8基因3次、N基因2次。 问：这些突变对新冠病毒RT-PCR检测试剂盒的性能有什么影响？ 答：如果这17个变异刚好落在检测引物3末端最后两个碱基时，就会降低扩
目前变异病毒已蔓延至 20 多个国家。 问：英国新冠病毒的突变位点有哪些？ 答：本次英国病毒株共发生了 17 次非同义突变或插入缺失，其中，ORF1ab 基因 4 次、Spike 基因 8 次、ORF8 基因 3 次、N 基因 2 次。 问：这些突变对新冠病毒 RT-PCR 检测试剂盒的性能有什么影响？ 答：如果这 17 个变异刚好落在检测引物 3’末端最后两个碱基时，就会降低扩
增效率，LOD会变化，影响对该变异病毒的检测性能。（华大基因新冠核酸检测 试剂的检测引物区域3'末端未发生变异，因此不影响对英国变异株的检测性 能。) 问：这些突变对新冠病毒的感染能力有什么影响？ 答：①新冠病毒刺突蛋白RBD位点的Q493、Q498和N501突变会提高病毒与 人体细胞表面ACE2受体的亲和力(affinity),因为这些突变可以降低RBD关键 残基的极性。如果有这三个位点的变异，将会增强病毒的结合能力，本次英国突 变株在N501Y刚好发生了突变，因此增强了RBD结构与人受体结合的能力，不 仅会影响传播效率，也可能对疫苗的接种效果产生影响。 ②新冠病毒存在PRRA特征序列，与后面的R残基构成了Furin酶切位点(RRAR), 而S蛋白酶切与病毒组装相关，P681H位点的突变可能会影响fuin酶切效率， 从而降低病毒组装效率，影响病毒在人体内的繁殖速度，间接影响传播效率（这 个酶切效率变化需要实验验证)
增效率，LOD 会变化，影响对该变异病毒的检测性能。（华大基因新冠核酸检测 试剂的检测引物区域 3’末端未发生变异，因此不影响对英国变异株的检测性 能。） 问：这些突变对新冠病毒的感染能力有什么影响？ 答：①新冠病毒刺突蛋白 RBD 位点的 Q493、Q498 和 N501 突变会提高病毒与 人体细胞表面 ACE2 受体的亲和力（affinity），因为这些突变可以降低 RBD 关键 残基的极性。如果有这三个位点的变异，将会增强病毒的结合能力，本次英国突 变株在 N501Y 刚好发生了突变，因此增强了 RBD 结构与人受体结合的能力，不 仅会影响传播效率，也可能对疫苗的接种效果产生影响。 ②新冠病毒存在 PRRA 特征序列，与后面的 R 残基构成了 Furin 酶切位点（RRAR）， 而 S 蛋白酶切与病毒组装相关，P681H 位点的突变可能会影响 furin 酶切效率， 从而降低病毒组装效率，影响病毒在人体内的繁殖速度，间接影响传播效率（这 个酶切效率变化需要实验验证）
实验室检测策略 核酸检测 核酸检测+血清学检测 血清学检测 血清学检测(1gG) 血清学检测(IgM 核酸检测(RT-PCR) 时间/天 7 起病2 67 14 21 28 临床分期 潜伏期 发病初期 进展期 恢复期 3~6天(1~14天)4天（第2~6天）12天（第7~19天） 20天（第10~33天） 检测结果RNA 4 + IgM IgG 4 注：大多数SARS-CoV-2感染者在起病后4-48h内核酸检测阳性，大多于5-7d达到高峰，后随病情的好转下降。IgM和IgG在发病后 4-7d和6~14d出现血清学改变，在症状发作后的19~21d内达到峰值。 图1SARS-CoV-2实验室检测策略 Inactivated Live attenuated 2 DNA Protein subunit mRNA Virus-like particles 飞a Virus vectored 3 全球新冠疫苗的开发主要基于7条技术路线（图1）。论文结合之前其他冠状病 毒疫苗的研究积累，系统地剖析了新冠疫苗潜在靶点，包括全病毒、病毒结构
全球新冠疫苗的开发主要基于 7 条技术路线（图 1）。论文结合之前其他冠状病 毒疫苗的研究积累，系统地剖析了新冠疫苗潜在靶点，包括全病毒、病毒结构