第二章蛋白质化学 【目的与要求】 1、使学生了解蛋白质的主要功能、分类： 2、掌握蛋白质组成的基本单位L--氨基酸的特点、分类： 3、掌握蛋白质的分子结构：一级结构、二级结构、三级结构和四级结构的概念及特点： 4、了解蛋白质分子结构与功能的关系： 5、掌握蛋白质的重要理化性质及分离纯化方法、技术。 【教学内容】 1、蛋白质的化学组成、主要功能及分类： 2、氨基酸的结构、分类、理化性质及分离与分析 3、蛋白质的分子结构： 4、蛋白质的结构与功能的关系： 5、蛋白质的性质； 6、蛋白质的分离纯化。 【重点与难点】 1、蛋白质的基本结构单位一氨基酸（结构特点、分类、理化性质）： 2、肽的组成及结构特点，肽、肽键、肽平面。 3、蛋白质的分子结构： 4、蛋白质的理化性质（两性电离、胶体、变性、沉淀、凝固、紫外吸收的性质，蛋白 质的茚三酮和双缩脲反应)及分离纯化方法。 【教学方法】 多媒体授课。 【教学时数】 6学时
第二章 蛋白质化学 【目的与要求】 1、使学生了解蛋白质的主要功能、分类； 2、掌握蛋白质组成的基本单位 L-α-氨基酸的特点、分类； 3、掌握蛋白质的分子结构：一级结构、二级结构、三级结构和四级结构的概念及特点； 4、了解蛋白质分子结构与功能的关系； 5、掌握蛋白质的重要理化性质及分离纯化方法、技术。 【教学内容】 1、蛋白质的化学组成、主要功能及分类； 2、氨基酸的结构、分类、理化性质及分离与分析； 3、蛋白质的分子结构； 4、蛋白质的结构与功能的关系； 5、蛋白质的性质； 6、蛋白质的分离纯化。 【重点与难点】 1、蛋白质的基本结构单位—氨基酸（结构特点、分类、理化性质）； 2、肽的组成及结构特点，肽、肽键、肽平面。 3、蛋白质的分子结构； 4、蛋白质的理化性质（两性电离、胶体、变性、沉淀、凝固、紫外吸收的性质，蛋白 质的茚三酮和双缩脲反应）及分离纯化方法。 【教学方法】 多媒体授课。 【教学时数】 6 学时
第一节概述 一、蛋白质的概念 蛋白质是由20种氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空间构象和生物学活 性的高分子有机化合物。 二、蛋白质的生物学功能 正因为蛋白质是生物体内数量和种类最多的物质，所以赋子它承担生物体生命活动过程 中所有的重要的生物学功能。 1、催化功能。蛋白质的一个最重要的生物功能是作为生物体新陈代谢的催化剂一一酶 生物体内各种化学反应几乎都是在酶的参与下进行的。酶的催化效率远大于合成的催化剂。 酶催化的反应速率为非催化速率的1016倍。 2、调节功能。参与代谢调节的许多激素是蛋白质或多肽，如胰岛素、胸腺素等。 3、免疫保护功能：机体的免疫功能与抗体有关，而抗体是一类特异的蛋白质。 4、储存和运输功能：体内很多小分子物质的转运和贮存可由一些特殊的蛋白质来完成。 如血红蛋白运输氧和二氧化碳：血浆转运蛋白转运铁，并在肝形成铁复合物而贮存：很多药 物吸收后也与血浆蛋白结合而运转。 5、运动与支持功能：负责运动的肌肉收缩系统也是蛋白质。如肌动蛋白，肌球蛋白等。 一些蛋白（胶原蛋白、弹性蛋白等）作为结构蛋白，维持器官、细胞的正常形态，抵御外界 伤害，保护机体正常生理功能。 6、接受和信息传递功能：一些跨膜蛋白和胞内蛋白作为受体蛋白能够与一些激素或药 物结合，起到接受信息，将信息放大，传递的作用。 7、基因表达调控功能：生物体在复制、转录、翻译过程中需要蛋白因子的参与：生物 体的生长、繁殖、遗传、变异与核蛋白有关：一些调节蛋白如阻遏蛋白等对基因表达起调节 作用。 8、生物膜功能：生物膜的基本成份是蛋白质和脂类。 9、是细胞和组织的结构成分 总之，生物体的一切生理活动，无不与蛋白质发生密切的关系。 三、蛋白质的元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质 还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约 为：碳50%-55%、氢6%-8%、氧19%-24%。氮13%-19%。 一切蛋白质都含有氮，并且大多蛋白质含氮量比较接近而恒定，平均为16%。因此，可 以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量。取平均含氮量倒数100/16=6.25，即为 蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有625g蛋白质：故： ※蛋白质含量=蛋白质含氮量×100/16=蛋白质含氮量×6.25 四、蛋白质的分类 1、根据化学组成成分分类： (1)简单蛋白质：又称为单纯蛋白质：这类蛋白质只含由a氨基酸组成的肽链，不含其
第一节 概述 一、蛋白质的概念 蛋白质是由 20 种氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空间构象和生物学活 性的高分子有机化合物。 二、蛋白质的生物学功能 正因为蛋白质是生物体内数量和种类最多的物质，所以赋予它承担生物体生命活动过程 中所有的重要的生物学功能。 1、催化功能。蛋白质的一个最重要的生物功能是作为生物体新陈代谢的催化剂－－酶。 生物体内各种化学反应几乎都是在酶的参与下进行的。酶的催化效率远大于合成的催化剂。 酶催化的反应速率为非催化速率的 10 16 倍。 2、调节功能。参与代谢调节的许多激素是蛋白质或多肽，如胰岛素、胸腺素等。 3、免疫保护功能：机体的免疫功能与抗体有关，而抗体是一类特异的蛋白质。 4、储存和运输功能 ：体内很多小分子物质的转运和贮存可由一些特殊的蛋白质来完成。 如血红蛋白运输氧和二氧化碳；血浆转运蛋白转运铁，并在肝形成铁复合物而贮存；很多药 物吸收后也与血浆蛋白结合而运转。 5、运动与支持功能：负责运动的肌肉收缩系统也是蛋白质。如肌动蛋白，肌球蛋白等。 一些蛋白（胶原蛋白、弹性蛋白等）作为结构蛋白，维持器官、细胞的正常形态，抵御外界 伤害，保护机体正常生理功能。 6、接受和信息传递功能 ：一些跨膜蛋白和胞内蛋白作为受体蛋白能够与一些激素或药 物结合，起到接受信息，将信息放大，传递的作用。 7、基因表达调控功能 ：生物体在复制、转录、翻译过程中需要蛋白因子的参与；生物 体的生长、繁殖、遗传、变异与核蛋白有关；一些调节蛋白如阻遏蛋白等对基因表达起调节 作用。 8、生物膜功能：生物膜的基本成份是蛋白质和脂类。 9、是细胞和组织的结构成分 总之，生物体的一切生理活动，无不与蛋白质发生密切的关系。 三、蛋白质的元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质 还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约 为：碳 50％-55%、氢 6%-8％、氧 19%-24%。氮 13%-19%。 一切蛋白质都含有氮，并且大多蛋白质含氮量比较接近而恒定，平均为 16%。因此，可 以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量。取平均含氮量倒数 100/16=6.25，即为 蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在 1g 元素氮，就说明含有 6.25g 蛋白质；故： ※蛋白质含量=蛋白质含氮量×100/16=蛋白质含氮量×6.25 四、蛋白质的分类 1、根据化学组成成分分类： (1) 简单蛋白质：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由 a-氨基酸组成的肽链，不含其
它成分。如清蛋白（白蛋白）、球蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白和植物谷蛋白等。 (2)结合蛋白：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，非蛋白部分称为辅基，根据辅 基不同可分为以下几类： >色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 >糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 >脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清ā-，b-脂蛋白等。 >核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。 >磷蛋白：分子中含有磷酸基，一般与蛋白质分子中的丝氨酸或苏氨酸的羟基相连，如 酪蛋白、胃蛋白酶等。 >金属蛋白：直接与金属结合的蛋白质如含铁、锌等。 2、根据分子形状分类： (I)球状蛋白质：globular protein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶， 有特异生物活性，大多数蛋白质属于这一类。 (2)纤维状蛋白质：fibrous protein分子类似纤维或细棒。一般不溶于水，多为生物组 织的结构材料，如毛发中的角蛋白、结缔组织的胶原蛋白和弹性蛋白等。 3、根据溶解度分类： (1)可溶性蛋白：指可溶于水，稀中性盐和稀酸溶液。如清蛋白、球蛋白、组蛋白、精 蛋白等。 (2)醇溶蛋白：不溶于水、稀盐，而溶于70%80%的乙醇溶液。如醇溶谷蛋白。 (3)不溶性蛋白：不溶于水、中性盐、稀酸、碱和一般有机溶剂。如角蛋白、胶原蛋白、 弹性蛋白等。 4、根据功能分类： (1)活性蛋白质：具有一定的生物活性，大多为球状蛋白质。 (2)非活性蛋白质：主要包括一大类起保护和支持作用的蛋白质，实际上相当于按分子 形状分类的纤维状蛋白和按溶解度分的不溶性蛋白。 5、根据营养价值不同： (1)完全蛋白：含有人体所必需的八种氨基酸。 (2)不完全蛋白：缺乏人体所必需的某种氨基酸。 第二节蛋白质的基本组成单位一氨基酸 蛋白质是高分子有机化合物，结构复杂、种类繁多，但它们在酸、碱或酶的作用下水解 的最终产物都是氨基酸。因此把氨基酸称为蛋白质结构的基本单位。 一、氨基酸的结构 天然存在的氨基酸约为180种，但组成蛋白质的氨基酸有20余种，称为基本氨基酸。除 脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为： COOH
它成分。如清蛋白（白蛋白）、球蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白和植物谷蛋白等。 (2) 结合蛋白：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，非蛋白部分称为辅基，根据辅 基不同可分为以下几类： ➢ 色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 ➢ 糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 ➢ 脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清 a - ， b - 脂蛋白等。 ➢ 核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。 ➢ 磷蛋白：分子中含有磷酸基，一般与蛋白质分子中的丝氨酸或苏氨酸的羟基相连，如 酪蛋白、胃蛋白酶等。 ➢ 金属蛋白：直接与金属结合的蛋白质如含铁、锌等。 2、根据分子形状分类： （1）球状蛋白质：globular protein 外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶， 有特异生物活性，大多数蛋白质属于这一类。 （2）纤维状蛋白质：fibrous protein 分子类似纤维或细棒。一般不溶于水，多为生物组 织的结构材料，如毛发中的角蛋白、结缔组织的胶原蛋白和弹性蛋白等。 3、根据溶解度分类： （1）可溶性蛋白：指可溶于水，稀中性盐和稀酸溶液。如清蛋白、球蛋白、组蛋白、精 蛋白等。 （2）醇溶蛋白：不溶于水、稀盐，而溶于 70%-80%的乙醇溶液。如醇溶谷蛋白。 （3）不溶性蛋白：不溶于水、中性盐、稀酸、碱和一般有机溶剂。如角蛋白、胶原蛋白、 弹性蛋白等。 4、根据功能分类： （1）活性蛋白质：具有一定的生物活性，大多为球状蛋白质。 （2）非活性蛋白质：主要包括一大类起保护和支持作用的蛋白质，实际上相当于按分子 形状分类的纤维状蛋白和按溶解度分的不溶性蛋白。 5、根据营养价值不同： （1）完全蛋白：含有人体所必需的八种氨基酸。 （2）不完全蛋白：缺乏人体所必需的某种氨基酸。 第二节 蛋白质的基本组成单位—氨基酸 蛋白质是高分子有机化合物，结构复杂、种类繁多，但它们在酸、碱或酶的作用下水解 的最终产物都是氨基酸。因此把氨基酸称为蛋白质结构的基本单位。 一、氨基酸的结构 天然存在的氨基酸约为 180 种，但组成蛋白质的氨基酸有 20 余种，称为基本氨基酸。除 脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为： COOH
HN-CH (1)与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸，但脯氨酸例外，为α 亚氨基酸。 (2)不同的α-氨基酸，其R侧链不同。它对蛋白质的空间结构和理化性质有重要的影响 (3)除R侧链为氢原子的甘氨酸外，其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都为不对称碳原 子，可形成不同的构型，具有旋光性。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型α-氨基酸。 二、氨基酸的分类 1、根据R基团的化学结构： 脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）人、杂环族氨基酸（组氨酸、 脯氨酸) 2、根据R基团的酸碱性分为：中性氨基酸、酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、碱性氨基酸 (赖氨酸、精氨酸、组氨酸) 3、根据R基团的带电性质分为：疏水性氨基酸、带电荷极性氨基酸、不带电荷的极性氨基 酸 上述20种氨基酸是构成天然蛋白质的基本单位。各自都有相应的遗传密码，无种属间的 差异。 4、几种重要的不常见氨基酸 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为蛋白质的稀有氨基酸。这些氨基 酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、胱氨 酸、四碘甲腺原氨酸（甲状腺素）等。此外，在生物界还发现有150多种非蛋白质氨基酸， 它们以游离或结合形式存在，但不存在于蛋白质中。这些非蛋白质氨基酸有些在代谢中起着 重要的前体或中间体作用。如阝丙氨酸是构成维生素、泛酸的成份：瓜氨酸和鸟氨酸是尿素 合成的中间产物。Y氨基丁酸是谷氨酸脱羧的产物对中枢神经系统有抑制作用。 5、人体所需的八种必需氨基酸 必需氨基酸：指人（或其它脊椎动物）自己不能合成，需要从食物中获得的氨基酸。 赖氨酸Lys) 缬氨酸(Va) 蛋氨酸Met) 色氨酸(Ty) 亮氨酸(Leu) 异亮氨酸Ile) 苏氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe)
H2N CH R (1)与羧基相邻的 α-碳原子上都有一个氨基，因而称为 α-氨基酸，但脯氨酸例外，为 α- 亚氨基酸。 (2)不同的 α-氨基酸，其 R 侧链不同。它对蛋白质的空间结构和理化性质有重要的影响。 (3) 除 R 侧链为氢原子的甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的 α-碳原子都为不对称碳原 子，可形成不同的构型，具有旋光性。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为 L-型-α-氨基酸。 二、氨基酸的分类 1、根据 R 基团的化学结构： 脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）、杂环族氨基酸（组氨酸、 脯氨酸 ） 2、根据 R 基团的酸碱性分为：中性氨基酸、酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、碱性氨基酸 （赖氨酸、精氨酸、组氨酸） 3、根据 R 基团的带电性质分为：疏水性氨基酸、带电荷极性氨基酸、不带电荷的极性氨基 酸 上述 20 种氨基酸是构成天然蛋白质的基本单位。各自都有相应的遗传密码，无种属间的 差异。 4、几种重要的不常见氨基酸 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为蛋白质的稀有氨基酸。这些氨基 酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有 4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、胱氨 酸、四碘甲腺原氨酸（甲状腺素）等。此外，在生物界还发现有 150 多种非蛋白质氨基酸， 它们以游离或结合形式存在，但不存在于蛋白质中。这些非蛋白质氨基酸有些在代谢中起着 重要的前体或中间体作用。如 β-丙氨酸是构成维生素、泛酸的成份；瓜氨酸和鸟氨酸是尿素 合成的中间产物。γ-氨基丁酸是谷氨酸脱羧的产物对中枢神经系统有抑制作用。 5、人体所需的八种必需氨基酸 必需氨基酸：指人（或其它脊椎动物）自己不能合成，需要从食物中获得的氨基酸。 赖氨酸(Lys) 缬氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Try) 亮氨酸(Leu) 异亮氨酸(Ile) 苏氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe)
表23组成蛋白质的蒸酸 机分秀《酸名件器有寻 瓢基酸例链R 英文全名时M 天冬氯酸 DAp一CH-COOH 酸性氨茶酸 aspartic acid 2.97 133 谷酸 -CH:)-cOO用 glutamic acid 3.22 147 氨酸 R Avg -(C)-NI- arginine 10.76 174 碱性氨基酸晚氨限： Kn一(CH.-NH nie9.74147 氨酸 7.59155 统氨酸 S Ser -CH2一OH mme5.6810s 苏氨酸· T The CH CH-OH 5.60119 半航氨酸 C Cys -CH-SH 5.07121 极作斯氨酸 YTn-c(O0州 n 5.66181 Nm-GH一GoNH Q Gln(CH )-CONH glutamine 5.65 146 色氯酸· CH- 5.89204 中性 甲统（覆）原破”MMt(C方一S一CH methicnine 5.74 149 氨然酸 甘氨靓 G Gly -H 8hew5.9775 丙氨酸 A一CH 6.0089 valine 596117 幸线经凳氨根· CH L Le CHCH-CH, leucine 5.98131 氨基酸 isoleucine 6.02 131 苯丙氢酸 FPme一cH<O phenylalanine 5.48 165 分子结构 的氨酸 NH COOH proline 6.30 115 ·为膏养必霸额新酸：余为青第非必香氨装酿 三、氨基酸的主要理化性质 1、一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶，其形状因构型而异 (1)溶解性：氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解 于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 (2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200℃以上。 (③)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单 钠盐有鲜味，是味精的主要成分。 (④)旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左
三、氨基酸的主要理化性质 1、一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异 (1) 溶解性：氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解 于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 (2) 熔点：氨基酸的熔点极高，一般在 200℃以上。 (3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单 钠盐有鲜味，是味精的主要成分。 (4) 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左
旋者通常用(-)表示，右旋者用(+)表示。 (5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220m) 均有光吸收。在近紫外区(220-300m)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 2、氨基酸的解离性质 ()氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解 成两性离子。在同一氨基酸分子上含有等量的正负两种电荷，又称兼性离子或偶极离子。在 两性离子中，氨基是以质子化(NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(COO-)存在。（使水的介 电常数升高) (2)在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化 3、氨基酸的等电点 当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH+和COO数目正好相等，净电荷 为0，这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pl。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极 移动，即氨基酸处于两性离子状态。此时氨基酸的溶解度最小。在一定PH值范围内，氨基 酸溶液的PH值离等电点越远，所带净电荷越多。 中性氨基酸：pl=(pK1+pK'2)2 酸性氨基酸：pl=(pK1+pKR)2 碱性氨基酸：pl=(pK'2+pK'R)2 带电状态判定：P-PH氨基酸与水合茚三酮在弱酸性溶液中共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。 水合茚三酮变为还原型茚三酮。 >加热过程中酮酸裂解，放出CO2,自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型 茚三酮。 >NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物 反应要点： >该反应由NH2与COOH共同参与。 >茚三酮是强氧化剂。 >该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值。 >测定范围：0.5-50μgml。 >脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH) 应用： >氨基酸定量分析（先用层析法分离） >氨基酸自动分析仪：
旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。 (5) 光吸收：构成蛋白质的 20 种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm) 均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 2、氨基酸的解离性质 (1) 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解 成两性离子。在同一氨基酸分子上含有等量的正负两种电荷，又称兼性离子或偶极离子。在 两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。（使水的介 电常数升高） (2) 在不同的 pH 条件下，两性离子的状态也随之发生变化 3、氨基酸的等电点 当溶液浓度为某一 pH 值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷 为 0，这一 pH 值即为氨基酸的等电点，简称 pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极 移动，即氨基酸处于两性离子状态。此时氨基酸的溶解度最小。在一定 PH 值范围内，氨基 酸溶液的 PH 值离等电点越远，所带净电荷越多。 中性氨基酸：pI = (pK’1 + pK’2 )/2 酸性氨基酸：pI = (pK’1 + pKR )/2 碱性氨基酸：pI = (pK’2 + pK’R )/2 带电状态判定：PI-PH<0 带负电 PI-PH<0 带负电 PI-PH=0 不带电 4、氨基酸的化学反应 (1) 与茚三酮的反应（颜色反应） 反应过程： ➢ 氨基酸与水合茚三酮在弱酸性溶液中共热，发生氧化脱氨反应，生成 NH3 与酮酸。 水合茚三酮变为还原型茚三酮。 ➢ 加热过程中酮酸裂解，放出 CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型 茚三酮。 ➢ NH3 与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物 反应要点： ➢ 该反应由 NH2 与 COOH 共同参与。 ➢ 茚三酮是强氧化剂。 ➢ 该反应非常灵敏，可在 570nm 测定吸光值。 ➢ 测定范围：0.5~50µg/ml 。 ➢ 脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放 NH3）。 应用： ➢ 氨基酸定量分析（先用层析法分离） ➢ 氨基酸自动分析仪：
用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。 氨基酸 OH 蓝紫色物质 (2)与2,4二硝基氟苯(DNFB)反应(Sanger反应) NH HN CH-COOH NO. N02 DNFB DNP氨基酸 24二硝基氟苯 >为a-NH2的反应，鉴定多肽或蛋白质的N末端氨基酸 >首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构。 >在弱碱性条件下肽分子与DNFB反应，得DNP肽。 >水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸。 >分离DNP氨基酸（乙醚抽提）。 >层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目
用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。 (2) 与 2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应(Sanger 反应) ➢ 为 α- NH2 的反应，鉴定多肽或蛋白质的 N-末端氨基酸。 ➢ 首先由 Sanger 应用，确定了胰岛素的一级结构。 ➢ 在弱碱性条件下肽分子与 DNFB 反应，得 DNP-肽。 ➢ 水解 DNP-肽，得 DNP-N 端氨基酸及其他游离氨基酸。 ➢ 分离 DNP-氨基酸（乙醚抽提）。 ➢ 层析法定性 DNP-氨基酸，得出 N 端氨基酸的种类、数目
(3)与异硫氰酸苯酯(PITC)的反应(Edman反应) OH N-C-s HN-CH 在弱碱中 苯异疏氢酸酯 H HO H (CH NO]) 苯氨基硫甲酰衍生物 苯乙内酰硫脲衍生物 (PTC-氨基酸) (PTH-氨基酸) >由Edman于19s0年首先提出。 >为a-NH2的反应。 >用于N末端分析，又称Edman降解法。 女肽链(N端氨基酸)与PITC偶联，生成PTC-肽。 令环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTH氨基酸和少一残基的肽链， 同时PTC氨基酸环化生成PTH氨基酸。该法最适合N末端氨基酸的测定。 令分离PTH-氨基酸（乙酸乙酯抽提）。 令层析法鉴定。 四、氨基酸的分离与分析 1、层析法 层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差别，使各组分以不同程度分布 在两个“相”中。这两个相中的一个被固定在一定的支持介质上，称为固定相(stationary phase):另一个是移动的，称为移动相(mobile phase)。当移动相流过固定相时，在流动过程 中由于各组分在两相中时分配情况不同，或电荷分布不同，或离子亲和力不同等，而以不同 速度前进，从而达到分离的目的。 根据层析法的原理与方式的不同，层析法有分配层析、吸附层析、离子交换层析、分子 筛层析以及亲和层析等不同类别。这里仅介绍分配层析和离子交换层析原理，其它层析方法 将在以后有关的章节予以介绍。 (①)滤纸层析 滤纸层析是一种分配层析。当一种溶质（例如氨基酸）在两种一定的不互溶或几乎不互 溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，它在两相中的浓度比值与在这两种溶剂中的 溶解度比值相等，称为分配定律。这个比值是一个常数，称为分配系数。 滤纸层析是以滤纸为支持物，以滤纸纤维所吸附的水为固定相，以水饱和的有机溶剂为
(3) 与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应（Edman 反应） ➢ 由 Edman 于 1950 年首先提出。 ➢ 为 α- NH2 的反应。 ➢ 用于 N 末端分析，又称 Edman 降解法。 肽链（N 端氨基酸）与 PITC 偶联，生成 PTC-肽。 环化断裂：最靠近 PTC 基的肽键断裂，生成 PTH-氨基酸和少一残基的肽链， 同时 PTC-氨基酸环化生成 PTH-氨基酸。该法最适合 N 末端氨基酸的测定。 分离 PTH-氨基酸（乙酸乙酯抽提）。 层析法鉴定。 四、氨基酸的分离与分析 1、层析法 层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差别，使各组分以不同程度分布 在两个“相”中。这两个相中的一个被固定在一定的支持介质上，称为固定相 ( stationary phase)；另一个是移动的，称为移动相（mobile phase）。当移动相流过固定相时，在流动过程 中由于各组分在两相中时分配情况不同，或电荷分布不同，或离子亲和力不同等，而以不同 速度前进，从而达到分离的目的。 根据层析法的原理与方式的不同，层析法有分配层析、吸附层析、离子交换层析、分子 筛层析以及亲和层析等不同类别。这里仅介绍分配层析和离子交换层析原理，其它层析方法 将在以后有关的章节予以介绍。 (1) 滤纸层析 滤纸层析是一种分配层析。当一种溶质（例如氨基酸）在两种一定的不互溶或几乎不互 溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，它在两相中的浓度比值与在这两种溶剂中的 溶解度比值相等，称为分配定律。这个比值是一个常数，称为分配系数。 滤纸层析是以滤纸为支持物，以滤纸纤维所吸附的水为固定相，以水饱和的有机溶剂为
移动相。将氨基酸的混合样品点于滤纸上，当有机相经过样品时，混合物中的各种氨基酸就 在有机溶剂和水中分配。 薄层层析 (2)薄层层析 薄层层析是一种快速而微量的层析方法。这是一种将固体支持剂涂布玻璃板或塑料板上， 对物质进行层析的方法。根据所用支持剂及分离原理不同，薄层层析又有多种不同类型。如 有吸附薄层层析、分配薄层层析、离子交换薄层层析、凝胶过滤薄层层析等。 2、高效液相色谱法 它是近30多年内发展起来的一项快速、灵敏、高效的分离分析技术。它有两个特点：ā、 使用固定相支持剂的颗粒很细，表面积大。b、溶剂系统采取高压，洗脱速率大。 3、氨基酸自动分析仪 使用氨基酸自动分析仪能准确测定蛋白质样品中各种氨基酸的组份及含量。 第三节肽 蛋白质是由一条或多条多肽polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与 多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量 变化范围很大，从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。 一、肽与肽键 l、肽(peptide):是由一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱水缩合连接而成的化合物.。 由二个氨基酸连接成的肽称为二肽，三个氨基酸形成的肽称为三肽，依次类推，多个氨基 酸形成的肽称为多肽。一般少于25个氨基酸组成的多肽称为寡肽。构成肽链的氨基酸相对完 整的氨基酸变的不完整，称为氨基酸残基(amino acid residue)。 2、肽键(peptide bond): 蛋白质分子是由一条或多条多肽链组成的。多肽链组成的基本单位为氨基酸。氨基酸之 间脱水后形成的共价键称为肽键(C0-NH)。 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 ()组成肽键的原子处于同一平面，称为酰胺平面。 (2)肽键中的CN键具有部分双键性质，不能自由旋转。 (3)在大多数情况下，以反式结构存在。 3、肽链的书写： 不论多肽链由多少个氨基酸组成，通常一端为游离的α-氨基，称N端（又称氨基端）， 习惯上写在肽链左侧，用HN-或H-表示：另一端为游离的a-羧基，称C端（又称为羧基端）， 写在肽链右侧，用-COOH或OH表示。例如，由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸组成的三肽。 肽链也可用中文或英文代号来表示如H-丙甘丝-OH或H-A-GS-OH 4、肽链的化学命名原则： 是将羧基末端的残基仍称原氨基酸名，置于肽名末尾，其余残基都按酰基命名，并从N端 开始依次列出，连于C端氨基酸名称之前，如上述三肽称为丙氨酰甘氨酰丝氨酸
移动相。将氨基酸的混合样品点于滤纸上，当有机相经过样品时，混合物中的各种氨基酸就 在有机溶剂和水中分配。 薄层层析 (2) 薄层层析 薄层层析是一种快速而微量的层析方法。这是一种将固体支持剂涂布玻璃板或塑料板上， 对物质进行层析的方法。根据所用支持剂及分离原理不同，薄层层析又有多种不同类型。如 有吸附薄层层析、分配薄层层析、离子交换薄层层析、凝胶过滤薄层层析等。 2、高效液相色谱法 它是近 30 多年内发展起来的一项快速、灵敏、高效的分离分析技术。它有两个特点：a、 使用固定相支持剂的颗粒很细，表面积大。b、溶剂系统采取高压，洗脱速率大。 3、氨基酸自动分析仪 使用氨基酸自动分析仪能准确测定蛋白质样品中各种氨基酸的组份及含量。 第三节 肽 蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与 多肽并无严格的界线，通常是将分子量在 6000 道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量 变化范围很大, 从大约 6000 到 1000000 道尔顿甚至更大。 一、肽与肽键 1、肽（peptide）：是由一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱水缩合连接而成的化合物。 由二个氨基酸连接成的肽称为二肽，三个氨基酸形成的肽称为三肽，依次类推，多个氨基 酸形成的肽称为多肽。一般少于 25 个氨基酸组成的多肽称为寡肽。构成肽链的氨基酸相对完 整的氨基酸变的不完整，称为氨基酸残基（amino acid residue）。 2、肽键(peptide bond)： 蛋白质分子是由一条或多条多肽链组成的。多肽链组成的基本单位为氨基酸。氨基酸之 间脱水后形成的共价键称为肽键（-C0-NH-）。 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 (1) 组成肽键的原子处于同一平面，称为酰胺平面。 (2)肽键中的 C-N 键具有部分双键性质，不能自由旋转。 (3)在大多数情况下，以反式结构存在。 3、肽链的书写： 不论多肽链由多少个氨基酸组成，通常一端为游离的 α-氨基，称 N 端（又称氨基端）， 习惯上写在肽链左侧，用 H2N-或 H-表示；另一端为游离的 α-羧基，称 C 端（又称为羧基端）， 写在肽链右侧，用-COOH 或-OH 表示。例如，由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸组成的三肽。 肽链也可用中文或英文代号来表示:如 H-丙-甘-丝-OH 或 H-A-G-S-OH 4、肽链的化学命名原则： 是将羧基末端的残基仍称原氨基酸名,置于肽名末尾，其余残基都按酰基命名，并从 N 端 开始依次列出，连于 C 端氨基酸名称之前，如上述三肽称为丙氨酰甘氨酰丝氨酸
5、肽的理化性质： (1)与氨基酸一样子在溶液中以两性离子存在，具有等电点。 (2)肽的化学反应与氨基酸一样，游离的a-氨基和羧基及R基可以发生与氨基酸中相 应基团类似的反应。能与茚三酮发生反应，N末端能与Sanger试剂和Edman试剂发生反应。 但双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而氨基酸不发生双缩脲反应。 6、几种生物体内的生物活性肽： 神经肽：脑啡肽，内啡肽 谷胱甘肽：Y-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸（还原型GSH、氧化型GSSG 肽类激素：催产素，加压素 第四节蛋白质的分子结构 一、蛋白质的一级结构 1、一级结构(Primary structure) 肽链中氨基酸的排列顺序叫蛋白质的一级结构。多肽链内或链间二硫键的数目和位置也 是一级结构研究的内容。一级结构连键：肽键和二硫键。一级结构是蛋白质空间结构及生物 功能的基础。 2、蛋白质的一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年E.Sanger测定了胰岛素 的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定 (1)测定蛋白质的一级结构的要求 >样品必需纯(>97%以上)： >知道蛋白质的分子量： >测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量 (2)测定步骤： ①多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助 非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体：可用 8molL尿素或6molL盐酸胍处理，即可分开多肽链亚基)】 ②测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量 之间的关系，即可确定多肽链的数目。 ③二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8molL尿素或6molM 盐酸胍存在下，用过量的阝巯基乙醇或过甲酸氧化处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基 化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 ④测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比： ⑤分析多肽链的N-末端和C末端 末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N端氨基酸和C端氨基酸。在肽链氨 基酸顺序分析中，最重要的是N端氨基酸分析法。 末端氨基酸测定的主要方法有：
5、肽的理化性质： （1）与氨基酸一样子在溶液中以两性离子存在，具有等电点。 （2）肽的化学反应与氨基酸一样，游离的 α-氨基和 α-羧基及 R 基可以发生与氨基酸中相 应基团类似的反应。能与茚三酮发生反应，N 末端能与 Sanger 试剂和 Edman 试剂发生反应。 但双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而氨基酸不发生双缩脲反应。 6、几种生物体内的生物活性肽： 神经肽：脑啡肽，内啡肽 谷胱甘肽：γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸（还原型 GSH、氧化型 GSSG） 肽类激素：催产素，加压素 第四节 蛋白质的分子结构 一、蛋白质的一级结构 1、一级结构(Primary structure) 肽链中氨基酸的排列顺序叫蛋白质的一级结构。多肽链内或链间二硫键的数目和位置也 是一级结构研究的内容。一级结构连键：肽键和二硫键。一级结构是蛋白质空间结构及生物 功能的基础。 2、蛋白质的一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从 1953 年 F.Sanger 测定了胰岛素 的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 (1) 测定蛋白质的一级结构的要求 ➢ 样品必需纯（>97%以上）； ➢ 知道蛋白质的分子量； ➢ 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 (2)测定步骤： ① 多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助 非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用 8mol/L 尿素或 6mol/L 盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). ② 测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量 之间的关系，即可确定多肽链的数目。 ③ 二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用 8mol/L 尿素或 6mol/L 盐酸胍存在下，用过量的 -巯基乙醇或过甲酸氧化处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基 化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 ④ 测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比； ⑤ 分析多肽链的 N-末端和 C-末端 末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和 C-端氨基酸。在肽链氨 基酸顺序分析中，最重要的是 N-端氨基酸分析法。 末端氨基酸测定的主要方法有：