第三章核酸化学 【目的与要求】 1、掌握核酸的化学组成，结构特点，熟悉其生物学功能 2、掌握核酸的分子结构及理化性质。 3、熟悉核酸的分离及含量测定。 【教学内容】 1、核酸的概念及化学组成 2、核酸的分子结构。 3、核酸的理化性质。 4、核酸的分离及含量测定。 【重点与难点】 1、核酸的分子结构。 2、核酸的理化性质。 【教学方法】 多媒体授课。 【教学时数】 3学时
第三章 核酸化学 【目的与要求】 1、掌握核酸的化学组成，结构特点，熟悉其生物学功能。 2、掌握核酸的分子结构及理化性质。 3、熟悉核酸的分离及含量测定。 【教学内容】 1、核酸的概念及化学组成。 2、核酸的分子结构。 3、核酸的理化性质。 4、核酸的分离及含量测定。 【重点与难点】 1、核酸的分子结构。 2、核酸的理化性质。 【教学方法】 多媒体授课。 【教学时数】 3 学时
第一节核酸的概念和化学组成 I868年，F.Miescher从细胞核中分离得到一种含P量高的酸性物质，当时命名为核 素。实质是核酸与蛋白的复合物。 1889年奥尔特曼(Altman)从酵母及其它细胞中分离到不含蛋白的核酸，并以此命名， ·直沿用到今。 一、概念 是以核苷酸为基本组成单位，通过3,5磷酸二酯键相连，通过卷曲折叠形成的具有 特定生物学功能的的生物大分子，携带和传递遗传信息。 二、核酸的种类和分布 核酸分为两大类： 脱氧核糖核酸Deoxyribonucleic Acid(DNA): 核糖核酸Ribonucleic Acid(RNA)(tRNA、mRNA、rRNA): 98%核中（染色体中） ,真核 C线粒体(mtDNA) 核外 C叶绿体(ctDNA DNA 拟核 原核 核外：质粒(plasmid) 病毒： DNA病毒 RNA主要存在于细胞质中。 三、重要性 1、核酸是遗传变异的物质基础。 20世纪40年代末，Avey的“肺炎双球菌转化”实验证明DNA是有机体的遗传物质 DNA 无莫腰，不 有芙，致病 有英税，致病 2、传递遗传信息
第一节 核酸的概念和化学组成 1868 年，F. Miescher 从细胞核中分离得到一种含 P 量高的酸性物质，当时命名为核 素。实质是核酸与蛋白的复合物。 1889年奥尔特曼(Altman)从酵母及其它细胞中分离到不含蛋白的核酸，并以此命名， 一直沿用到今。 一、概念 是以核苷酸为基本组成单位，通过 3 / ,5 /磷酸二酯键相连，通过卷曲折叠形成的具有 特定生物学功能的的生物大分子，携带和传递遗传信息。 二、核酸的种类和分布 核酸分为两大类： 脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA）； 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）（tRNA、mRNA、rRNA)； 98％核中（染色体中） 真核 线粒体（mtDNA） 核外 叶绿体（ctDNA） DNA 拟核 原核 核外：质粒（plasmid） 病毒： DNA 病毒 RNA 主要存在于细胞质中。 三、 重要性 1、核酸是遗传变异的物质基础。 20 世纪 40 年代末，Avery 的“肺炎双球菌转化”实验证明 DNA 是有机体的遗传物质： 2、 传递遗传信息 DNA 无荚膜，不 致病 温育 有荚膜，致病 传代 传代 有荚膜，致病 有荚膜，致病
3、核酸与医药 许多核酸类衍生物可作为抗病毒药物。 许多抗癌药物是核苷或其衍生物。 应用基因工程技术制药。 四、核酸的基本化学组成 1.元素组成 C、H、0、N、P(910%) 2.分子组成 安酸 一→核苷酸 3、嘌岭(purine)与嘧啶(pyrimidine) 嘌呤 毫啶(pyrimidine) 4、戊糖 核糖((ribose) 脱氧核糖(deoxyribose) 5、核苷 戊糖+碱基 票呤：CN 嘧啶：CNg 6、核苷酸 核苷+磷酸 五、核酸衍生物
3、 核酸与医药 许多核酸类衍生物可作为抗病毒药物。 许多抗癌药物是核苷或其衍生物。 应用基因工程技术制药。 四、核酸的基本化学组成 1. 元素组成 C、H、O、N、P（9~10%） 2. 分子组成 3、嘌呤(purine) 与嘧啶(pyrimidine) 嘧啶(pyrimidine) 4、戊 糖 核糖(ribose) 脱氧核糖(deoxyribose) 5、核苷 戊糖+碱基 嘌呤：C1 / -N1 嘧啶：C1 / -N9 6、核苷酸 核苷+磷酸 五、核酸衍生物 核酸 核苷酸 核苷 磷酸 戊 糖 4 5 N N H H H H N N N N H H H H 2 3 4 6 7 8 9 嘌呤 碱基
多磷酸核苷酸：NMP,NDP,NTP 在体内能量代谢中的作用： ATP一是生物体生理活动所需能量的直接供体又称能量“货币 UTP一参加糖的互相转化与合成 CTP—参加磷脂的合成 GTP一参加蛋白质和票吟的合成 环化核苷酸：cAMP,cGMP:是体内代谢调节的重要物质 NH2 含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、COA-SH、FAD等都含有AMP 第二节核酸的分子结构 一、DNA的一级结构 1、定义 核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基 序列。DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓 于DNA分子中四种核苷鞍千变万化的不同排列组合之中。 2、连接键： 3，5磷酸二酯键。多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3'0H与另一分子核苷酸的 5-磷酸基形成3”，5磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。 3、方向性： 多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是5 →3'或是3′→5'。5'磷酸端（常用5-P表示）：3'羟基端（常用3'-0H表示） 4、表示方法： (1)线条表示法： (2)表示法： pApTpCpG或PATCG 5、真核细胞染色质DNA与原核生物DNA的一级结构特点
多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP 在体内能量代谢中的作用： ATP——是生物体生理活动所需能量的直接供体又称能量“货币” UTP——参加糖的互相转化与合成 CTP——参加磷脂的合成 GTP——参加蛋白质和嘌呤的合成 环化核苷酸: cAMP，cGMP：是体内代谢调节的重要物质 含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP 第二节 核酸的分子结构 一、DNA 的一级结构 1、定义 核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基 序列。DNA 的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓 于 DNA 分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。 2、连接键： 3’,5’-磷酸二酯键。多聚核苷酸是通过一个核苷酸的 C3’-OH 与另一分子核苷酸的 5’-磷酸基形成 3’,5’-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。 3、方向性： 多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是 5′ →3′或是 3′→5′。5′-磷酸端（常用 5’-P 表示）；3′-羟基端（常用 3’-OH 表示） 4、表示方法： （1）线条表示法： （2）表示法： pApTpCpG 或 pATCG 5、真核细胞染色质 DNA 与原核生物 DNA 的一级结构特点
真核生物： ()存在重复序列：高度重复序列、中度重复序列、单一序列 (2)间隔序列与插入序列：内含子与外显子。 (3)回文结构：两条链顺读与倒读意义相同。 原核生物： ()基因重叠 (2)功能相关的结构基因转录在同一mRNA分子上：多顺反子。 ()结构基因是连续的。 二、DNA的二级结构 1、定义： 线状或环状DNA的两条链绕同一中心轴旋转而成的一种空间结构。 2、提出： 1953年，Watson和Crick提出 (I)碱基组成分析：Chargaff发现DNA中A与T、C与G的数目相等。后Pauling和 Coey发现A与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。 Chargaff规则： 2[A]=I、G■C >同一生物所有组织的碱基组成相同」 >不同生物体细胞的碱基组成有较大差异，可用不对称比率A+TG+C表示。 (2)碱基的理化数据分析：电位谪定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接 (3)DNA纤维的X-线衍射图谱分析：Wilkins和Franklin发现不同来源的DNA纤 维具有相似的X射线衍射图谱。 3、DNA双螺旋结构模型要点 (1)两条多核苷酸链反向平行，右手双螺旋，直径2m。 (2)碱基内侧，A与T、G与C配对，分别形成3和2个氢键 (3)双螺旋每转一周有10个bp,螺距3.4nm。 (4)螺旋表面形成大沟和小沟，与DNA和蛋白质的识别有关。 (⑤)磷酸基和脱氧核糖在外侧，彼此间通过磷酸二酯键相连，形成DNA骨架。糖 环平面与碱基平面垂直 DNA的双螺旋结构的意义： 该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原 则，这是是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基 础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学 乃至整个生命科学飞速发展的基石。 4、双螺旋结构的稳定因素 (1)氢键（太弱）：
真核生物： (1) 存在重复序列：高度重复序列、中度重复序列、单一序列 (2) 间隔序列与插入序列：内含子与外显子。 (3) 回文结构：两条链顺读与倒读意义相同。 原核生物： (1) 基因重叠 (2) 功能相关的结构基因转录在同一 mRNA 分子上：多顺反子。 (3) 结构基因是连续的。 二、DNA 的二级结构 1、定义： 线状或环状 DNA 的两条链绕同一中心轴旋转而成的一种空间结构。 2、提出： 1953 年，Watson 和 Crick 提出 (1) 碱基组成分析：Chargaff 发现 DNA 中 A 与 T、C 与 G 的数目相等。后 Pauling 和 Corey 发现 A 与 T 生成 2 个氢键、C 与 G 生成 3 个氢键。 Chargaff 规则： ➢ [A] = [T]、[G] [C] ➢ 同一生物所有组织的碱基组成相同。 ➢ 不同生物体细胞的碱基组成有较大差异，可用不对称比率 A+T/G+C 表示。 (2) 碱基的理化数据分析：电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接 (3) DNA 纤维的 X-线衍射图谱分析 ：Wilkins 和 Franklin 发现不同来源的 DNA 纤 维具有相似的 X 射线衍射图谱。 3、DNA 双螺旋结构模型要点 (1) 两条多核苷酸链反向平行，右手双螺旋，直径 2nm。 (2) 碱基内侧，A 与 T、G 与 C 配对，分别形成 3 和 2 个氢键。 (3) 双螺旋每转一周有 10 个 bp，螺距 3.4nm。 (4) 螺旋表面形成大沟和小沟，与 DNA 和蛋白质的识别有关。 (5) 磷酸基和脱氧核糖在外侧，彼此间通过磷酸二酯键相连，形成 DNA 骨架。糖 环平面与碱基平面垂直。 DNA 的双螺旋结构的意义： 该模型揭示了 DNA 作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原 则，这是是 DNA 复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基 础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学 乃至整个生命科学飞速发展的基石。 4、双螺旋结构的稳定因素 （1）氢键（太弱）；
(2)碱基堆积力(base stacking force,由芳香族碱基r电子间的相互作用引起的， 能形成疏水核心，是稳定DNA最重要的因素； (3)离子键（减少双链间的静电斥力）。 5、DNA双螺旋的构象类型 (1)B-DNA:92%相对湿度，接近细胞内的DNA构象，与Watson和Crick提出的 模型相似。 (2)A-DNA:75%相对湿度，与溶液中DNA-RNA杂交分子的构象相似，推测转录 时发生B→A。其碱基平面倾斜20°，螺距与每一转碱基对数目都有变化。 (3)Z-DNA:主链呈锯齿型左向盘绕，直径约l.8nm,螺距4.5nm,每一转含12个 bp,只有小沟。B-DNA与Z-DNA的相互转换可能和基因的调控有关。 6、DNA的三级结构 三级结构主要指DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。 正超螺旋(positive supercoil):盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil):盘绕方向与DNA双螺旋方向相反 天然状态下都是负超螺旋，在试管内用溴乙锭处理里可出现正超螺旋 生物学意义： 有利于从结构上进行压缩和包装。 DNA复制和RNA转录过程调控有关。 7、染色质与染色体 真核生物染色质由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。 核小体的组成： DNA:约200bp 组蛋白：H1、H2A,H2B、H3、H4。是富含赖氨酸和精氨酸的碱性蛋白 后四种各两分子形成一个八聚体的中心，DNA双螺旋以146bp的长度，沿着八聚 体的核心短轴旋绕134圈，形成左手超螺旋。核小体之间通过H1相连，呈念珠状结。 8、基因与基因组 (I)DNA与基因 基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。 基因组(genome):某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。 包括：核基因组（拟核/核DNA)及核外（质粒/质体DNA) 结构基因 基因 基因组 调节基因 三、RNA的种类和分子结构
（2）碱基堆积力（base stacking force，由芳香族碱基π电子间的相互作用引起的， 能形成疏水核心，是稳定 DNA 最重要的因素； （3）离子键（减少双链间的静电斥力）。 5、DNA 双螺旋的构象类型 （1）B-DNA：92%相对湿度，接近细胞内的 DNA 构象，与 Watson 和 Crick 提出的 模型相似。 （2）A-DNA：75%相对湿度，与溶液中 DNA-RNA 杂交分子的构象相似，推测转录 时发生 B→A。其碱基平面倾斜 20°，螺距与每一转碱基对数目都有变化。 （3）Z-DNA：主链呈锯齿型左向盘绕，直径约 1.8nm，螺距 4.5nm，每一转含 12 个 bp，只有小沟。B-DNA 与 Z-DNA 的相互转换可能和基因的调控有关。 6、DNA 的三级结构 三级结构主要指 DNA 双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。 正超螺旋(positive supercoil)：盘绕方向与 DNA 双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil)：盘绕方向与 DNA 双螺旋方向相反 天然状态下都是负超螺旋，在试管内用溴乙锭处理里可出现正超螺旋。 生物学意义： 有利于从结构上进行压缩和包装。 DNA 复制和 RNA 转录过程调控有关。 7、染色质与染色体 真核生物染色质由 DNA 和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。 核小体的组成： DNA：约 200bp 组蛋白：H1、H2A，H2B、H3、H4。是富含赖氨酸和精氨酸的碱性蛋白。 后四种各两分子形成一个八聚体的中心，DNA 双螺旋以 146bp 的长度，沿着八聚 体的核心短轴旋绕 1 3/4 圈，形成左手超螺旋。核小体之间通过 H1 相连，呈念珠状结。 8、基因与基因组 (1) DNA 与基因 基因是 DNA 片段的核苷酸序列，DNA 分子中最小的功能单位。 基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。 包括：核基因组（拟核/核 DNA）及核外（质粒/质体 DNA） 三、RNA 的种类和分子结构 基因 结构基因 调节基因 基因组
1、结构特点 1、碱基组成A、G、C、U(A=U/G≡C)稀有碱基较多。 2.多为单链结构，少数局部形成螺旋 3.分子较小，几十至数千NMP 4稳定性较第，易被碱水解 2、分类 湘胞核和胞液 线粒体 功 能 核妥白体RNA rRNA mt rRNA 核蛋白体组分 信使RNA mRNA mt mRNA 蛋白质合成模板 转运RNA RNA mt tRNA 转运氯酸 核内不均一RNA HnRNA 成熟mRNA的前体 核内小RNA SnRNA 参与anRNA的剪接、转运 核仁小RNA SnoRNA rRNA的加工、修饰 胞装小RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分 3、tRNA RNA约占RNA总量的IS%,主要作用是转运氨基酸用于合成蛋白质。tRNA分子 量为4S,1965年Holley测定AlatRNA一级结构，提出三叶草二级结构模型。 (I)tRNA的结构特点： >由7493个核苷酸组成，沉降系数4S。 >3末端为一CCA-OH >5末端大多数为G >含10-20%稀有碱基，如DHU >十几个位置上的核苷酸在几乎所有的tRNA都是恒定不变的，即为恒 定核苷酸。 >几乎所有的tRNA都具有三叶草式的二级结构。 (2)tRNA的二级结构 一单链、三叶草型 >氨基酸臂 DHU环 》密码环 》额外环 TΨC环
1、结构特点 1、 碱基组成 A、G、C、U （A＝U/G≡C） 稀有碱基较多。 2. 多为单链结构，少数局部形成螺旋 3. 分子较小，几十至数千 NMP。 4. 稳定性较差，易被碱水解。 2、分类 核蛋白体RNA 信使RNA 转运RNA 核内不均一RNA 核内小RNA 胞浆小RNA 细胞核和胞液 线粒体 功 能 rRNA mRNA mt rRNA tRNA mt mRNA mt tRNA HnRNA SnRNA SnoRNA scRNA/7SL-RNA 核蛋白体组分 蛋白质合成模板 转运氨基酸 成熟mRNA的前体 参与hnRNA的剪接、转运 rRNA的加工、修饰 蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分 核仁小RNA 核蛋白体RNA 信使RNA 转运RNA 核内不均一RNA 核内小RNA 胞浆小RNA 细胞核和胞液 线粒体 功 能 rRNA mRNA mt rRNA tRNA mt mRNA mt tRNA HnRNA SnRNA SnoRNA scRNA/7SL-RNA 核蛋白体组分 蛋白质合成模板 转运氨基酸 成熟mRNA的前体 参与hnRNA的剪接、转运 rRNA的加工、修饰 蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分 核仁小RNA 3、tRNA tRNA 约占 RNA 总量的 15%，主要作用是转运氨基酸用于合成蛋白质。tRNA 分子 量为 4S，1965 年 Holley 测定 AlatRNA 一级结构，提出三叶草二级结构模型。 （1）tRNA 的结构特点： ➢ 由 74-93 个核苷酸组成，沉降系数 4S。 ➢ 3´末端为 — CCA-OH ➢ 5´末端大多数为 G ➢ 含 10~20% 稀有碱基，如 DHU ➢ 十几个位置上的核苷酸在几乎所有的 tRNA 都是恒定不变的，即为恒 定核苷酸。 ➢ 几乎所有的 tRNA 都具有三叶草式的二级结构。 （2）tRNA 的二级结构 ——单链、三叶草型 ➢ 氨基酸臂 ➢ DHU 环 ➢ 密码环 ➢ 额外环 ➢ TΨC 环
OH CCA末端 AA DD 反密子环 反南码子 醇HRNA的 领结构与二级结构 (3)tRNA的三级结构 倒L型。 4、mRNA mRNA约占细胞RNA总量的2~5%，是蛋白质合成的模板。 真核生物RNA的前体在核内合成，包括整个基因的内含子和外显子的转录产物，形 成分子大小极不均匀的hnRNA。 (1)mRNA结构特点 >大多数真核mRNA的5'末端均在转录后加上一个7甲基鸟苷，同时第一个核苷 酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7 GpppNm-。与蛋白质合成的起始有 关。原核无帽子结构。 >大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(poyA)结构，称为多聚A尾， 原核无。与mRNA从细胞核向细胞质的转运有关，也有mRNA的半衰期有关。 >每个mRNA分子可与几个至几十个核糖体结合成串珠样的多核糖体。 >原核细胞mRNA是多顺反子，真核单顺反子。 ~原核细胞转录与翻译同时进行的，而真核先转录后翻译。 5、rRNA 占细胞RNA总量的8O%,与蛋白质(4O%)共同组成核糖体，在胞浆中参与蛋白 质的合成，起着“装配机”的作用。 原核生物 真核生物 核糖体 IRNA 核糖体 irna 30s 16s 40s 185 5s、23s 0s{ 5s、5.8s、28s 50s 50s
（3）tRNA 的三级结构 倒 L 型。 4、mRNA mRNA 约占细胞 RNA 总量的 2~5%，是蛋白质合成的模板。 真核生物 mRNA 的前体在核内合成，包括整个基因的内含子和外显子的转录产物，形 成分子大小极不均匀的 hnRNA。 （1）mRNA 结构特点 ➢ 大多数真核 mRNA 的 5´末端均在转录后加上一个 7-甲基鸟苷，同时第一个核苷 酸的 C´2 也是甲基化，形成帽子结构：m7G5ppp5Nm-。与蛋白质合成的起始有 关。原核无帽子结构。 ➢ 大多数真核 mRNA 的 3´末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚 A 尾， 原核无。与 mRNA 从细胞核向细胞质的转运有关，也有 mRNA 的半衰期有关。 ➢ 每个 mRNA 分子可与几个至几十个核糖体结合成串珠样的多核糖体。 ➢ 原核细胞 mRNA 是多顺反子，真核单顺反子。 ➢ 原核细胞转录与翻译同时进行的，而真核先转录后翻译。 5、rRNA 占细胞 RNA 总量的 80%，与蛋白质（40%）共同组成核糖体，在胞浆中参与蛋白 质的合成，起着“装配机”的作用。 原核生物 真核生物 核糖体 rRNA 核糖体 rRNA 30s 70s｛ 50s 16s 5s 、23s 40s 80s｛ 50s 18s 5s、5.8s、28s
第三节核酸的理化性质 一、一般理化性质 1、呈酸性的磷酸基团又有呈弱碱性的碱基，为两性电解质，通常表现为酸性。酸 性解离与碱性解离相等时溶液的PH值叫核酸的等电点。 2、DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，微溶于水，但其钠盐在水中溶解度 较大。不溶于乙醇乙醚氯仿等有机溶剂。DNA核蛋白难溶于0.14moL的NaCI溶液。 DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。 3、DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。核酸粘度减低或消失，即意味 着变性或降解。 4、RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。 5、使用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。 加热条件下，D一核糖+浓盐酸+苔黑酚 绿色 D一2一脱氧核糖+酸+二苯胺 蓝紫色 6、液中的核酸在引力场中可以下沉，这是核酸的沉降特性，沉降速度与核酸的大 小与密度有关。应用超速离心技术可以测定核酸的沉降系数和分子量。 RNA>DNA、单链)双链、超螺旋>环状>线状。 二、核酸的紫外吸收性质 核酸的碱基具有共扼双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在260m(蛋白质的紫外 吸收峰在280nm) 核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少3040%，当核酸变性或降解时光吸收 值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。 OD260的应用 I、DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于50μgml双链DNA: 4Oug/ml单链DNA(或RNA) 2、断核酸样品的纯度 DNA纯品：OD260/OD280=1.8 RNA纯品：OD260/OD280=2.0 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭(EB),在紫外下发出荧光 三、DNA的变性、复性与分子杂交 1、变性： 稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级 结构（碱基顺序）保持不变。 (1)变性特征： 生物活性部分或全部丧失、黏度下降、浮力密度升高、沉降速度增加、紫外吸收增 加（增色效应）、酸碱滴定曲线改变 (2)变性因素：
第三节 核 酸 的 理 化 性 质 一、一般理化性质 1、呈酸性的磷酸基团又有呈弱碱性的碱基，为两性电解质，通常表现为酸性。酸 性解离与碱性解离相等时溶液的 PH 值叫核酸的等电点。 2、DNA 为白色纤维状固体，RNA 为白色粉末，微溶于水，但其钠盐在水中溶解度 较大。不溶于乙醇乙醚氯仿等有机溶剂。DNA 核蛋白难溶于 0.14mol/L 的 NaCl 溶液。 DNA 溶于苯酚而 RNA 不溶，故可用苯酚来沉淀 RNA。 3、DNA 溶液的粘度极高，而 RNA 溶液要小得多。核酸粘度减低或消失，即意味 着变性或降解。 4、RNA 能在室温条件下被稀碱水解而 DNA 对碱稳定。 5、使用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定 DNA 与 RNA。 加热条件下，D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚 绿色 D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺 蓝紫色 6、液中的核酸在引力场中可以下沉，这是核酸的沉降特性，沉降速度与核酸的大 小与密度有关。应用超速离心技术可以测定核酸的沉降系数和分子量。 RNA>DNA、单链>双链、超螺旋>环状>线状。 二、核酸的紫外吸收性质 核酸的碱基具有共扼双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在 260nm（蛋白质的紫外 吸收峰在 280nm） 核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少 30~40%，当核酸变性或降解时光吸收 值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。 OD260 的应用 1、DNA 或 RNA 的定量 OD260=1.0 相当于 50μg/ml 双链 DNA； 40μg/ml 单链 DNA（或 RNA） 2、断核酸样品的纯度 DNA 纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA 纯品: OD260/OD280 = 2.0 DNA 和 RNA 溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光 三、DNA 的变性、复性与分子杂交 1、变性： 稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级 结构(碱基顺序)保持不变。 (1) 变性特征： 生物活性部分或全部丧失、黏度下降、浮力密度升高、沉降速度增加、紫外吸收增 加（增色效应）、酸碱滴定曲线改变 (2) 变性因素：
pH(>11,3或DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将 紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用T表示。 一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的 含量有关。 >G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C 含量。 >影响Tm的因素： ◇G-C的相对含量： (G+C)%=(Tm—69.3)×2.44 令介质离子强度低，Tm低。 ◇高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。 ◆变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使T下降。 2、DNA的复性 (1)变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 (2)DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复， 具有减色效应。 (B)将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷 却时可复性，因此又称为“退火”。 退火温度=Tm-25℃ (4)复性影响因素： 片段浓度、片段大小、片段复杂性（重复序列数目）、溶液离子强度、溶液温 度的高低(T-25℃) 3、分子杂交 ()定义： DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的 过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段， (2)分类： >原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位 置。 >点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。 >Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行 杂交。用于钓基因，即用已知的DNA单链或RNA,钓取未知DNA分子中的基因， 方法如下：
pH（>11.3 或<5.0）、 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）、 低离子强度、加热 某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 (3) 热变性和 Tm： ➢ DNA 的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将 紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用 Tm 表示。 ➢ 一般 DNA 的 Tm 值在 70-85C 之间。DNA 的 Tm 值与分子中的 G 和 C 的 含量有关。 ➢ G 和 C 的含量高，Tm 值高。因而测定 Tm 值，可反映 DNA 分子中 G，C 含量。 ➢ 影响 Tm 的因素： G-C 的相对含量： （G+C）% =（Tm—69.3）×2.44 介质离子强度低，Tm 低。 高 pH 下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。 变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使 Tm 下降。 2、DNA 的复性 (1) 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 (2) DNA 复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复， 具有减色效应。 (3) 将热变性的 DNA 骤然冷却至低温时，DNA 不可能复性。变性的 DNA 缓慢冷 却时可复性，因此又称为“退火”。 退火温度＝Tm－25℃ (4) 复性影响因素： 片段浓度、片段大小、片段复杂性（重复序列数目）、溶液离子强度、溶液温 度的高低 （T – 25℃） 3、分子杂交 (1) 定义： DNA 单链与在某些区域有互补序列的异源 DNA 单链或 RNA 链形成双螺旋结构的 过程。这样形成的新分子称为杂交 DNA 分子。 探针：用放射性同位素或荧光标记的 DNA 或 RNA 片段。 (2) 分类： ➢ 原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位 置。 ➢ 点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。 ➢ Southern 印迹法：将电泳分离后的 DNA 片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行 杂交。用于钓基因，即用已知的 DNA 单链或 RNA，钓取未知 DNA 分子中的基因， 方法如下：