安徽科技学院：《生物化学》课程教学资源（电子教案）第十一章核酸的生物合成.doc_大学文库

第一节DNA复制概述一、半保留复制 Watson和Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为DNA 分子的复制提供了理论基础，即亲代的DNA双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导DNA新链的合成，这样合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的DNA链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制 (semiconservative replication). 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制，他们将大肠杆菌放在含有1N标记的NH4C1培养基中繁殖了15代，使所有的大肠杆菌 DNA被5N所标记，可以得到I5N标记的DNA。然后将细菌转移到含有1N标记的NH4C 培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯(CsC)密度梯度离心法观察DNA所处的位置。由于I5N-DNA的密度比普通DNA(4N-DNA)的密度大，在氯化铯密度梯度离心(density gradient centrifugation)时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带（如下图）。二、半不连续复制 DNA双螺旋的两股链是反向平行(antiparallel)的，新合成的两股子链，一股的方向为 5'→3，另一股为3→5'。那么体内是否存在两种DNA聚合酶？一种催化核苷酸以5'→3方向聚合，另一种以3”一→5方向聚合。但从现知所有的DNA聚合酶都只能催化5一3方向合成。这个问题直到1968年冈崎(Okazaki)发现大肠杆菌DNA复制过程中出现一些含1000 ~2000个核苷酸的片段，一旦合成终止，这些片段即连成一条长链。这种小片段被称为冈崎片段(Okazaki fragment))。因此，复制时亲代DNA分子中那股3'→5'方向的母链作为模板，指导新链以5'→3'方向连续合成，此链称为前导链(1 eading strand).在前导链延长1000~2000 个核苷酸后，另一母链也作为模板指导新链也是沿5'→3'合成1000~2000个核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称为随从链(lagging strand)。可见，随从链为不连续复制，所以DNA为半不连续复制(semi-discontinuous repicton,)如图12-2所示。复制后，这些冈崎片段由DNA连接酶的作用而连接成完整的新链。三、复制起点、单位和方向 DNA的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。 1、复制单位复制子Replicon):Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个

第一节 DNA 复制概述一、半保留复制 Watson 和 Crick 于 1953 年提出的 DNA 双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为 DNA 分子的复制提供了理论基础，即亲代的 DNA 双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导 DNA 新链的合成，这样合成的两个子代 DNA 分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的 DNA 链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制 (semiconservative replication)。 1958 年 Meselson 和 Stahl 利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了 DNA 的半保留复制，他们将大肠杆菌放在含有 15N 标记的 NH4Cl 培养基中繁殖了 15 代，使所有的大肠杆菌 DNA 被 15N 所标记，可以得到 15N 标记的 DNA。然后将细菌转移到含有 14N 标记的 NH4Cl 培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法观察 DNA 所处的位置。由于 15N-DNA 的密度比普通 DNA(14N-DNA)的密度大，在氯化铯密度梯度离心(density gradient centrifugation)时，两种密度不同的 DNA 分布在不同的区带（如下图）。二、半不连续复制 DNA 双螺旋的两股链是反向平行(antiparallel)的，新合成的两股子链，一股的方向为 5′→3′，另一股为 3′→5′。那么体内是否存在两种 DNA 聚合酶?一种催化核苷酸以 5′→3′方向聚合，另一种以 3′→5′方向聚合。但从现知所有的 DNA 聚合酶都只能催化 5′→3′方向合成。这个问题直到 1968 年冈崎(Okazaki)发现大肠杆菌 DNA 复制过程中出现一些含 1000 ~2000 个核苷酸的片段，一旦合成终止，这些片段即连成一条长链。这种小片段被称为冈崎片段(Okazaki fragment)。因此，复制时亲代 DNA 分子中那股 3′→5′方向的母链作为模板，指导新链以 5′→3′方向连续合成，此链称为前导链(1eading strand)。在前导链延长 1000 ~2000 个核苷酸后，另一母链也作为模板指导新链也是沿 5′→3′合成 1 000 ~2 000 个核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称为随从链(1agging strand)。可见，随从链为不连续复制，所以 DNA 为半不连续复制(semi-discontinuous replication)，如图 12-2 所示。复制后，这些冈崎片段由 DNA 连接酶的作用而连接成完整的新链。三、复制起点、单位和方向 DNA 的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。 1、复制单位复制子(Replicon)：Genome 能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器 DNA 都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。真核生物的染色体 DNA 是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个

复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。 2、复制起点复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。多数生物的复制起点，通常从一个固定的起点开始复制，该起点是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含AT。原核一个，真核多个起点。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。 3、复制方向定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。 a.单向 b.双向等速 c.双向异速第二节参与DNA复制的一些酶类和蛋白质一、大肠杆菌的DNA聚合酶 DNA聚合酶(DNA polymerase)的作用是将脱氧核苷酸连接成DNA,所用底物必须是四种脱氧核苷三磷酸(NTP),Mg2*存在和一个DNA模板，按模板的序列将配对的脱氧核苷酸逐个接上去，并且需要一个具有3'-OH的RNA引物或DNA的3'-OH端。使3'-OH 与合成上去的dNTP分子a-磷酸连接成3'，5'磷酸二酯键，合成方向为5'→3'，如图12-4。从大肠杆菌纯化得到3种DNA聚合(I,Ⅱ，Ⅲ) (一)DNA聚合酶I 1955年Komberg发现了DNA聚合酶I(简称为polI),故也称为Komnberg酶，并因此而获得诺贝尔奖金。DNA聚合酶I是一条分子质量为103X10Da的多肽链。具有多种催化功能。若用蛋白酶轻度水解可得一个分子质量68X103Da的大片段和一个分子质量为 36X10Da的小片段，常将大片段称为Klenow片段，此片段具有两种催化活性，一为上述的聚合功能，另一为3'→5外切酶的活性，从3端水解DNA产生3'单核苷酸。小片段则具5→3'外切酶的活性，它能从5’→3方向一个挨一个切除，产物为5单核背酸，或跨过若干个核苷酸再进行酶解，从5末端释放一寡核苷酸。可除去冈崎片段5端的 RNA引物和在DNA损伤修复中起重要的作用。可见，DNA聚合酶I为一条多肽链上具有三种酶的活性，也是一种多功能酶。但DNA聚合酶I并不是大肠杆菌DNA复制中主要的DNA合成酶，它的主要作用，是切除RNA引物、填补空缺和DNA损伤的修复。 (二)DNA聚合酶I 由一条多肽链构成。此酶除具有聚合酶的活性外，还具有3”→5外切酶活性。它在生物体内的确切作用不详，可能也是在DNA损伤修复中起作用，无5'一→3外切酶活性

复制子约有 100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有 1000 个复制子。病毒 DNA 多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。 2、复制起点复制起点是以一条链为模板起始 DNA 合成的一段序列。多数生物的复制起点，通常从一个固定的起点开始复制，该起点是 DNA 呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含 A.T。原核一个，真核多个起点。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。 3、复制方向定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。 a. 单向 b. 双向等速 c. 双向异速第二节参与 DNA 复制的一些酶类和蛋白质一、大肠杆菌的 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶（DNA polymerase）的作用是将脱氧核苷酸连接成 DNA，所用底物必须是四种脱氧核苷三磷酸(dNTP ) ，Mg2+存在和一个 DNA 模板，按模板的序列将配对的脱氧核苷酸逐个接上去，并且需要一个具有 3′-OH 的 RNA 引物或 DNA 的 3′-OH 端。使 3′-OH 与合成上去的 dNTP 分子 α-磷酸连接成 3′，5′磷酸二酯键，合成方向为 5′→3′，如图 12-4。从大肠杆菌纯化得到 3 种 DNA 聚合酶(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ )。 (一) DNA 聚合酶Ⅰ 1955 年 Kornberg 发现了 DNA 聚合酶Ⅰ(简称为 polⅠ)，故也称为 Kornberg 酶，并因此而获得诺贝尔奖金。DNA 聚合酶Ⅰ是一条分子质量为 103X103 Da 的多肽链。具有多种催化功能。若用蛋白酶轻度水解可得一个分子质量 68X103 Da 的大片段和一个分子质量为 36X103 Da 的小片段，常将大片段称为 Klenow 片段，此片段具有两种催化活性，一为上述的聚合功能，另一为 3′→5′外切酶的活性，从 3′端水解 DNA 产生 3′单核苷酸。小片段则具 5′→3′外切酶的活性，它能从 5′→3′方向一个挨一个切除，产物为 5′单核苷酸，或跨过若干个核苷酸再进行酶解，从 5′末端释放一寡核苷酸。可除去冈崎片段 5′端的 RNA 引物和在 DNA 损伤修复中起重要的作用。可见，DNA 聚合酶Ⅰ为一条多肽链上具有三种酶的活性，也是一种多功能酶。但 DNA 聚合酶Ⅰ并不是大肠杆菌 DNA 复制中主要的 DNA 合成酶，它的主要作用，是切除 RNA 引物、填补空缺和 DNA 损伤的修复。 (二) DNA 聚合酶Ⅱ 由一条多肽链构成。此酶除具有聚合酶的活性外，还具有 3′→5′外切酶活性。它在生物体内的确切作用不详，可能也是在 DNA 损伤修复中起作用，无 5′→3′外切酶活性

(三)DNA聚合酶Ⅲ 此酶是一个多聚酶，由10种不同亚基组成的（图12-8），称为DNA聚合酶Ⅲ全酶(DNA polymeraseⅢholoenzyme)。它具有三个特点：DNA聚合酶IⅢ催化活性比DNA聚合酶I 高很多倍，每秒可催化1000个核苷酸的聚合，而DNA聚合酶I每秒仅催化16-20个核苷酸聚合。③DNA聚合酶不但催化活性大、合成速度快，而且由于具有3'一5外切酶活性，产物真实性高。所以，大肠杆菌DNA聚合酶I是DNA复制必需的酶。但无5'一3'外切酶活性。二、真核细胞的DNA聚合酶真核细胞的DNA聚合酶有5种，即DNA聚合酶a、B、Y、8和e。DNA聚合酶a负责随从链的合成，无有3'→5'外切酶活性，DNA聚合酶8和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)负贵前导链的合成有3'-→5外切酶活性。PCNA是作为DNA聚合酶 δ活性所需的一种辅助蛋白，有与E.coli DNA聚合酶Ⅲ的B亚基类似的结构和功能，形成环状的夹钳，大大地增强DNA聚合酶δ的续进性。DNA聚合酶Y负责线粒体 DNA(mitochondria DNA,mt DNA)的复制，DNA聚合酶B和e的功能为DNA的修复。三、解旋、解链酶类复制时DNA双螺旋要解开，才能在原来的母链上合成新链。复制在不断延伸，螺旋要不断解开。若每秒钟复制1000个碱基对，则要解旋100次。这样必然在复制前方产生很大的张力，使DNA缠结，这要靠DNA拓扑异构酶等来解决。 (一)DNA解链酶 DNA复制时，复制开始部位的DNA双螺旋必须解开成单链，模板链上的碱基才能以碱基配对原则，指导新链的合成。解开DNA双螺旋的酶有多种，称为DNA解链酶(DNA helicase),该酶具有ATP酶的活性，在ATP的存在下，该酶能解开DNA双链，每解开I 对碱基消耗2个ATP (二)单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白(single strand binding protein,SSB)或螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing protein HDP),能与已被解链酶解开的单链DNA结合，以维持模板处于单链状态，又可保护其不被核酸酶水解。单链DNA结合SSB后既可避免重新形成双链的倾向，又可避免自身发夹黑旋的形成，还能使前端双螺旋的稳定性降低，易被解开。当DNA聚合酶在模板上前进，逐个接上脱氧核苷酸时，SSB即不断脱离，又不断与新解开的链结合。 (三)DNA拓扑异构酶拓扑一词是指物体作弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA拓扑异构酶(topoiso- merase)有两类：其中拓扑异构酶I,曾有过多种其他名称如转轴酶、解缠酶等。它能切断 DNA双链中的一股，使DNA解链旋转时不致缠结，解除张力后又把切口封闭不需ATP, 作用是减少负超螺旋。拓扑异构酶Ⅱ，又称旋转酶(gyrase),暂时切断DNA双链，使另 DNA双链经过此切口，随后又再封闭切口。需ATP,增加负超螺旋。四、引发体引发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是DNA复制开始所必需的。引发体中

(三) DNA 聚合酶Ⅲ 此酶是一个多聚酶，由 10 种不同亚基组成的( 图 12- 8)，称为 DNA 聚合酶Ⅲ全酶(DNA po1ymerase Ⅲ ho1oenzyme)。它具有三个特点： DNA 聚合酶Ⅲ催化活性比 DNA 聚合酶Ⅰ 高很多倍，每秒可催化 1 000 个核苷酸的聚合，而 DNA 聚合酶Ⅰ每秒仅催化 16~20 个核苷酸聚合。③DNA 聚合酶Ⅲ不但催化活性大、合成速度快，而且由于具有 3′→5′外切酶活性，产物真实性高。所以，大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅲ是 DNA 复制必需的酶。但无 5′→3′外切酶活性。二、真核细胞的 DNA 聚合酶真核细胞的 DNA 聚合酶有 5 种，即 DNA 聚合酶 α、β、γ、δ 和 ε。DNA 聚合酶 α 负责随从链的合成，无有 3′→5′外切酶活性，DNA 聚合酶 δ 和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)负责前导链的合成有 3′→5′外切酶活性。PCNA 是作为 DNA 聚合酶 δ 活性所需的一种辅助蛋白，有与 E.coli DNA 聚合酶Ⅲ的 β 亚基类似的结构和功能，形成环状的夹钳，大大地增强 DNA 聚合酶 δ 的续进性。DNA 聚合酶 γ 负责线粒体 DNA(mitochondria DNA, mt DNA)的复制，DNA 聚合酶 β 和 ε 的功能为 DNA 的修复。三、解旋、解链酶类复制时 DNA 双螺旋要解开，才能在原来的母链上合成新链。复制在不断延伸，螺旋要不断解开。若每秒钟复制 1 000 个碱基对，则要解旋 100 次。这样必然在复制前方产生很大的张力，使 DNA 缠结，这要靠 DNA 拓扑异构酶等来解决。 (一) DNA 解链酶 DNA 复制时，复制开始部位的 DNA 双螺旋必须解开成单链，模板链上的碱基才能以碱基配对原则，指导新链的合成。解开 DNA 双螺旋的酶有多种，称为 DNA 解链酶(DNA helicase)，该酶具有 ATP 酶的活性，在 ATP 的存在下，该酶能解开 DNA 双链，每解开 1 对碱基消耗 2 个 ATP。 (二) 单链 DNA 结合蛋白单链 DNA 结合蛋白(single strand binding protein，SSB)或螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing protein HDP)，能与已被解链酶解开的单链 DNA 结合，以维持模板处于单链状态，又可保护其不被核酸酶水解。单链 DNA 结合 SSB 后既可避免重新形成双链的倾向，又可避免自身发夹螺旋的形成，还能使前端双螺旋的稳定性降低，易被解开。当 DNA 聚合酶在模板上前进，逐个接上脱氧核苷酸时，SSB 即不断脱离，又不断与新解开的链结合。 (三) DNA 拓扑异构酶拓扑一词是指物体作弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA 拓扑异构酶(topoisomerase)有两类：其中拓扑异构酶Ⅰ，曾有过多种其他名称如转轴酶、解缠酶等。它能切断 DNA 双链中的一股，使 DNA 解链旋转时不致缠结，解除张力后又把切口封闭不需 ATP，作用是减少负超螺旋。拓扑异构酶Ⅱ，又称旋转酶(gyrase)，暂时切断 DNA 双链，使另一 DNA 双链经过此切口，随后又再封闭切口。需 ATP，增加负超螺旋。四、引发体引发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是 DNA 复制开始所必需的。引发体中

的某些蛋白质如DnaA能结合至DNA复制起始部位，DnaB具有解链酶的作用，DnaC辅助DnaB结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在己解开起始部位的DNA单链按碱基互补配对催化NTP聚合，合成一小片段的RNA,作为 DNA合成的引物，即沿此引物RNA的3'-OH进行延伸。五、DNA连接酶 DNA连接酶(DNA ligase)催化两段DNA链之间磷酸二酯键的形成。要求DNA链 3端有游离的OH,而5端带有磷酸根，连接过程需要ATP供能，如图12-9。 DNA连接酶不能连接两分子单链的DNA,只能作用双链DNA分子中一股链上的缺口，或双链DNA分子双股的缺口。如DNA经限制性内切核酸酶切割后，两个片段的粘性末端相配，DNA连接酶能使之连接。即使是两段平齐DNA,DNA连接酶也能使之连接。在 DNA复制过程中，当RNA引物清除后，靠DNA聚合酶I填补空缺，冈崎片段之间的缺口靠DNA连接酶作用而连成完整的一条新链。DNA连接酶在DNA损伤修复中亦起重要作用，并且是一种重要的工具酶。第三节DNA复制过程一、DNA聚合反应必备的条件 (I)DNA聚合酶 (②)DNA模板（反转录时用RNA模板） (3)引物(DNA、RNA或蛋白质) (④4种dNTP (⑤Mg2+ 二、聚合反应过程及特点总反应式： nidATP DNApol. dAMP n2dGTP +DNA dGMP DNA+(ni+n2+n3+n4)PPi n3dCTP Mg2+ dCMP nadTTP dTMP (一)复制的起始（双链解开，RNA引物合成）大肠杆菌复制时有特定的起始部位称为oC,长度为245bp。有3个串连排列的核苷酸序列，每个由13个核苷酸组成。其序列基本相同为GATCINTINTTTT,而且GATC在 oriC部位出现I1次，oriC还有4个DnaA结合位点，是4个bp序列的反向重复，这些序列都是高度保守的（图12-10。） DnaA先结合至复制起始点，然后发动了复杂的变化。DnaB和DnaC亦参加进去，从而使双链解开，DNA结合蛋白便与单链DNA结合。接着引物酶按碱基配对原则按5'→3 方向合成一小段的RNA引物，此引物的3'-OH可供DNA聚合酶将第一个dNTP加到

的某些蛋白质如 DnaA 能结合至 DNA 复制起始部位，DnaB 具有解链酶的作用，DnaC 辅助 DnaB 结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在已解开起始部位的 DNA 单链按碱基互补配对催化 NTP 聚合，合成一小片段的 RNA，作为 DNA 合成的引物，即沿此引物 RNA 的 3′-OH 进行延伸。五、DNA 连接酶 DNA 连接酶(DNA 1igase)催化两段 DNA 链之间磷酸二酯键的形成。要求 DNA 链 3′端有游离的 OH，而 5′端带有磷酸根，连接过程需要 ATP 供能,如图 12-9。 DNA 连接酶不能连接两分子单链的 DNA，只能作用双链 DNA 分子中一股链上的缺口，或双链 DNA 分子双股的缺口。如 DNA 经限制性内切核酸酶切割后，两个片段的粘性末端相配，DNA 连接酶能使之连接。即使是两段平齐 DNA，DNA 连接酶也能使之连接。在 DNA 复制过程中，当 RNA 引物清除后，靠 DNA 聚合酶Ⅰ填补空缺，冈崎片段之间的缺口靠 DNA 连接酶作用而连成完整的一条新链。DNA 连接酶在 DNA 损伤修复中亦起重要作用，并且是一种重要的工具酶。第三节 DNA 复制过程一、DNA 聚合反应必备的条件 ⑴ DNA 聚合酶 ⑵ DNA 模板(反转录时用 RNA 模板) ⑶引物 (DNA、RNA 或蛋白质) ⑷ 4 种 dNTP ⑸ Mg2+ 二、聚合反应过程及特点总反应式： n1dATP DNA pol . dAMP n2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）PPi n3dCTP Mg2+ dCMP n4dTTP dTMP （一）复制的起始（双链解开，RNA 引物合成）大肠杆菌复制时有特定的起始部位称为 oriC，长度为 245bp。有 3 个串连排列的核苷酸序列，每个由 13 个核苷酸组成。其序列基本相同为 GATCTNTTNTTTT，而且 GATC 在 oriC 部位出现 11 次，oriC 还有 4 个 DnaA 结合位点，是 4 个 9bp 序列的反向重复，这些序列都是高度保守的（图 12-10。） DnaA 先结合至复制起始点，然后发动了复杂的变化。DnaB 和 DnaC 亦参加进去，从而使双链解开，DNA 结合蛋白便与单链 DNA 结合。接着引物酶按碱基配对原则按 5’→3’ 方向合成一小段的 RNA 引物，此引物的 3′-OH 可供 DNA 聚合酶Ⅲ将第一个 dNTP 加到

3′-OH 上而形成 3′，5′磷酸二酯键。复制是从 oriC 开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制(bi-directional replication)。复制开始后由于 DNA 双链解开，在两股单链上进行复制。在电子显微镜下观察 DNA 复制前进部位伸展成叉状，称为复制叉(replication fork)。（二）复制的延长复制的延长指在 DNA-pol 催化下，dNTP 以 dNMP 的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。亲代 DNA 双链分子是反向，一条链是沿 5’→3’，而互补链则沿 3’→5’方向。当原始的双链 DNA 在复制叉处打开时，新生 DNA 逆着模板链产生，即一个子代 DNA 链的生成方向为 5’→3’，而另一个则为 3’→5’。实际上，在以 3’→5’链为模板时, 新生的 DNA 链以 5’→3’ 方向连续合成,这条新生 DNA 链称为前导链。在另一条模板链（方向为 5’→3’）上, DNA 聚合酶以 5’→3’方向合成小片段 DNA(长度约 1000 个核苷酸), 然后将这些片段连接起来。这些片段根据发现者命名为冈崎片段。不连续合成的 DNA 链称为滞后链。 3’ 5’ 前导链 5’ 冈崎片段 3’ 滞后链 5’ （三）复制的终止（切除引物、填补缺口，连接修复）在 DNA 延长阶段结束后，原核生物的 RNA 引物被 DNA 聚合酶Ⅰ切除。留下的空隙，由 DNA 聚合酶Ⅰ进行补满，即从另一冈崎片段的 3′-OH 按 5′→3′根据碱基配对原则，将一个个的 dNTP 补上去。最后的缺口再由 DNA 连接酶将相邻的两个核苷酸借磷酸二酯键连起来，即成完整的一条新链，DNA 的复制即告完成。小结： ⑴ DNA 解螺旋酶解开双链 DNA。 ⑵ SSB 结合于 DNA 单链。 ⑶ DNA 旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 ⑷ DNA 引物酶(在引发体中)合成 RNA 引物。 ⑸ DNA pol.Ⅲ在两条新生链上合成 DNA。 ⑹ DNA polⅠ切除 RNA 引物，并补上 DNA。 ⑺ DNA ligase 连接一个冈崎片段。特点： ➢ 半保留复制

~半不车续复制 >每条链的合成方向都是5'→3 》分子复制在特定起点开始，原核一个真核多个。三、复制的忠实性 DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5x109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点： (1)DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为7×10-6） (2)DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3'5外切酶切除） (3)起始时以RNA作为引物： >()从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配 >(2)新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5→3校对功能难发挥作用。 (4)核苷酸代谢库谢节系统和体内多种修复系统的校对机制。第四节基因突变和DNA的损伤修复一、基因突变基因突变是指DNA碱基顺序发生突然而水久性的变化。其结果使DNA的转录和翻译也跟着转变，因而表现出异常的遗传特征。DNA的突变可以有以下几种形式： (一)造成DNA损伤的因素造成DNA损伤的因素有生物体内自发的、亦有外界物理和化学等因素， 1、白发的因素由于DNA分子受到周围环境溶剂分子的随机热碰撞((thermal collision),腺嘌呤或鸟嘌吟与脱氧核糖间的N糖苷键可以断裂，使A或G脱落。人体细胞中DNA每天每个细胞要脱落5000个嘌吟碱，每天每个细胞也有100个胞嘧啶自发脱氨而成尿嘧啶。 2、物理因素 >紫外线损伤由于嘌呤环与嘧啶环都含有共轭双键，能吸收紫外线而引起损伤。嘧啶碱引起的损伤比嘌呤碱大10倍。损伤是由于嘧啶二聚体的产生，即2个相邻嘧啶碱的Cs和C6共价交联，如图12-18所示。电离辐射损伤如X射线和Y射线，可以是辐射能量直接对DNA的影响，或DNA 周围的溶剂分子吸收了辐射能，再对DNA产生损伤作用。如碱基的破坏、单链的断裂、双链的断裂、分子间的交联、碱基脱落或核糖的破坏等。 3、化学因素 >烷化剂：有活泼烷基，可转移到碱基或磷酸上，如硫酸二甲酯、芥子气等。鸟嘌呤的O6和N7最易烷化，导致错配(GD或脱落。磷酸三酯不稳定，易断裂。双功能试剂可造成交联

➢ 半不连续复制 ➢ 每条链的合成方向都是 5′→3′ ➢ 分子复制在特定起点开始，原核一个真核多个。三、复制的忠实性 DNA 复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌 DNA 复制 5109 碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点: （1）DNA 聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为 7 10-6 ）（2）DNA 聚合酶的校对功能（错配碱基被 3’-5’外切酶切除）（3）起始时以 RNA 作为引物： ➢ ⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配 ➢ ⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA 聚合酶的 5 ，→3，校对功能难发挥作用。（4）核苷酸代谢库谢节系统和体内多种修复系统的校对机制。第四节基因突变和 DNA 的损伤修复一、基因突变基因突变是指 DNA 碱基顺序发生突然而永久性的变化。其结果使 DNA 的转录和翻译也跟着转变，因而表现出异常的遗传特征。DNA 的突变可以有以下几种形式：（一）造成 DNA 损伤的因素造成 DNA 损伤的因素有生物体内自发的、亦有外界物理和化学等因素。 1、自发的因素由于 DNA 分子受到周围环境溶剂分子的随机热碰撞(thermal collision)，腺嘌呤或鸟嘌呤与脱氧核糖间的 N-糖苷键可以断裂，使 A 或 G 脱落。人体细胞中 DNA 每天每个细胞要脱落 5 000 个嘌呤碱，每天每个细胞也有 100 个胞嘧啶自发脱氨而成尿嘧啶。 2、物理因素 ➢ 紫外线损伤由于嘌呤环与嘧啶环都含有共轭双键，能吸收紫外线而引起损伤。嘧啶碱引起的损伤比嘌呤碱大 10 倍。损伤是由于嘧啶二聚体的产生，即 2 个相邻嘧啶碱的 C5 和 C6 共价交联，如图 12-18 所示。 ➢ 电离辐射损伤如 X 射线和 γ 射线，可以是辐射能量直接对 DNA 的影响，或 DNA 周围的溶剂分子吸收了辐射能，再对 DNA 产生损伤作用。如碱基的破坏、单链的断裂、双链的断裂、分子间的交联、碱基脱落或核糖的破坏等。 3、化学因素 ➢ 烷化剂：有活泼烷基，可转移到碱基或磷酸上，如硫酸二甲酯、芥子气等。鸟嘌呤的 O6 和 N7 最易烷化，导致错配 (GT) 或脱落。磷酸三酯不稳定，易断裂。双功能试剂可造成交联

>碱基或核苷类似物：FU、BdU、6-巯基嘌呤等。可竞争抑制核苷酸合成或掺入核酸导致错配。 >亚硝酸盐及亚硝胺：前者造成脱氨，后者氧化后生成烷化剂和自由基。 >代谢活化化合物：如苯并笔、黄曲霉毒素等。经混合功能 (二)DNA突变的类型根据DNA分子的改变，可把突变分为下面几种主要类型。 1、点突变点突变(point mutation)是DNA分子上一个碱基的变异，可分为：①转换(transition)同型碱基，如一种嘌吟代替另一种嘌吟或一种嘧啶代替另一嘧啶。②颠换(transversation)异型碱基，即嘌呤变嘧啶，或嘧啶变嘌呤。点突变可根据发生在DNA分子的部位，如发生在启动子或剪接信号部位可以影响整个基因的功能；若发生在编码序列，有的可以改变蛋白质的功能如引起镰状红细胞贫血：有的则为中性变化，即编码氨基酸虽变化，但功能不受影响：有的甚至是静止突变，碱基虽变但编码氨基酸种类不变。 2、缺失缺失(deletion))是一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因，从DNA大分子上丢失。如有些地中海贫血、生长激素基因缺失，再如上述Lesch-Nyhan综合征是HGPRT基因缺失。 3、插入插入(insertion)是一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸序列插入到DNA大分子中去，或有些芳香族分子如吖啶(acridine)嵌入DNA双螺旋碱基对中，可以引起移码突变 (frame-shift-mutation),影响三联体密码的阅读方式。 4、重排(rearrangement): DNA分子内发生较大片段的交换，也称为重组。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。 5、移码突变：在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动 (reading frame shift),从而突变位点以后的密码都可能发生错误，使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变(frame shift mutaion): 二、DNA的损伤修复由于复制差错或外来理化因素的作用，使DNA分子中的碱基对遭到破坏的现象，称为 DNA分子的损伤。其结果必将阻碍DNA分子的复制和转录，引起错股合成，最终导致细胞死亡。然而在生物细胞内存在着许多修复机制，对DNA的损伤具有一定修复能力。目前己知有4种途径： (1)光复活。这是一种高度专一的修复形式，其机制是利用光能激活光复活酶，切除嘧啶二聚体之间的C一C键，而恢复原来的状态。它只作用于紫外线照射形成的产物。 (2)切除修复。如果DNA损伤较严重，则必须进行切除修复，即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损的部分切除掉，并以另一条完整的链为模板，合成切去的部分，使 DNA恢复正常。切除修复(excision repair)是修复DNA损伤最为普遍的方式，对多种DNA

➢ 碱基或核苷类似物： FU 、 BrdU 、 6- 巯基嘌呤等。可竞争抑制核苷酸合成或掺入核酸导致错配。 ➢ 亚硝酸盐及亚硝胺：前者造成脱氨，后者氧化后生成烷化剂和自由基。 ➢ 代谢活化化合物：如苯并笓、黄曲霉毒素等。经混合功能（二）DNA 突变的类型根据 DNA 分子的改变，可把突变分为下面几种主要类型。 1、点突变点突变(point mutation)是 DNA 分子上一个碱基的变异，可分为：①转换(transition)同型碱基，如一种嘌呤代替另一种嘌呤或一种嘧啶代替另一嘧啶。②颠换(transversation)异型碱基，即嘌呤变嘧啶，或嘧啶变嘌呤。点突变可根据发生在 DNA 分子的部位，如发生在启动子或剪接信号部位可以影响整个基因的功能；若发生在编码序列，有的可以改变蛋白质的功能如引起镰状红细胞贫血；有的则为中性变化，即编码氨基酸虽变化，但功能不受影响；有的甚至是静止突变，碱基虽变但编码氨基酸种类不变。 2、缺失缺失(deletion)是一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因，从 DNA 大分子上丢失。如有些地中海贫血、生长激素基因缺失，再如上述 Lesch- Nyhan 综合征是 HGPRT 基因缺失。 3、插入插入(insertion)是一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸序列插入到 DNA 大分子中去，或有些芳香族分子如吖啶(acridine)嵌入 DNA 双螺旋碱基对中，可以引起移码突变 (frame-shift-mutation)，影响三联体密码的阅读方式。 4、重排 (rearrangement) ： DNA 分子内发生较大片段的交换，也称为重组。移位的 DNA 可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。 5、移码突变：在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是 3 的整倍数，则发生读框移动 (reading frame shift)，从而突变位点以后的密码都可能发生错误，使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变(frame shift mutaion)。二、DNA 的损伤修复由于复制差错或外来理化因素的作用，使 DNA 分子中的碱基对遭到破坏的现象，称为 DNA 分子的损伤。其结果必将阻碍 DNA 分子的复制和转录，引起错股合成，最终导致细胞死亡。然而在生物细胞内存在着许多修复机制，对 DNA 的损伤具有一定修复能力。目前已知有 4 种途径：（1）光复活。这是一种高度专一的修复形式，其机制是利用光能激活光复活酶，切除嘧啶二聚体之间的 C－C 键，而恢复原来的状态。它只作用于紫外线照射形成的产物。（2）切除修复。如果 DNA 损伤较严重，则必须进行切除修复，即在一系列酶的作用下，将 DNA 分子中受损的部分切除掉，并以另一条完整的链为模板，合成切去的部分，使 DNA 恢复正常。切除修复(excision repair)是修复 DNA 损伤最为普遍的方式，对多种 DNA

损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。修复过程需要多种酶的一系列作用，基本步骤如下： ①首先由核酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5'侧切开磷酸二酯键。不同的 DNA损伤需要不同的特殊核酸内切服来识别和切割： ②由5'→3'核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除： ③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5'→3'方向DNA链，填补已切除的空隙： ④由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。 (3)重组修复。在重组修复酶的作用下，含有损伤的DNA仍可进行复制，但在子代 DNA链与损伤链相对应部位出现缺口，通过分子间重组，从完整的亲代或子代DNA链将相应的碱基顺序片段移至缺口处，然后用再合成的多核苷酸补上缺口。 (4)诱导修复。许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理，均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应(SOS反应)。它包括DNA修复和导致变异两个方面。应急反应能诱导切除修复和重组修复中某些关健酶和蛋白质的产生，加强修复能力。此外应急还能诱导产物缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，但却带来了高的变异率。以上几种修复系统只有光复活是利用光能，其余均利用ATP水解释放的能量。 (5)错配修复（甲基指导的不配对修复）错配修复系统(E.coi中至少有12种蛋白质)能够区分“旧链和“新”链。Dm甲基化酶可使DNA的GATC序列中腺嘌呤N6位甲基化.复制后的DNA在短期内为半甲基化的GATC 序列，一旦发现错配碱基，就将未甲基化的链切除，而以甲基化的链为模板进行修复合成。第五节RNA的生物合成一、转录的定义： RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA,从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录。经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA, mRNA,snRNA和HnRNA。二、转录的特点： 1、转录的不对称性：双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那条DNA链称为有意义链（模板链），而与之互补的另一条DNA链称为反意义链（编码链)。模板链并非永远在同一条单链上。 2、录的连续性：

损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的 DNA 修复机制。修复过程需要多种酶的一系列作用，基本步骤如下： ①首先由核酸酶识别 DNA 的损伤位点，在损伤部位的 5'侧切开磷酸二酯键。不同的 DNA 损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割； ②由 5'→3'核酸外切酶将有损伤的 DNA 片段切除； ③在 DNA 聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按 5'→3'方向 DNA 链，填补已切除的空隙； ④由 DNA 连接酶将新合成的 DNA 片段与原来的 DNA 断链连接起来。这样完成的修复能使 DNA 恢复原来的结构。（3）重组修复。在重组修复酶的作用下，含有损伤的 DNA 仍可进行复制，但在子代 DNA 链与损伤链相对应部位出现缺口，通过分子间重组，从完整的亲代或子代 DNA 链将相应的碱基顺序片段移至缺口处，然后用再合成的多核苷酸补上缺口。（4）诱导修复。许多能造成 DNA 损伤或抑制复制的处理，均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS 反应）。它包括 DNA 修复和导致变异两个方面。应急反应能诱导切除修复和重组修复中某些关健酶和蛋白质的产生，加强修复能力。此外应急还能诱导产物缺乏校对功能的 DNA 聚合酶，它能在 DNA 损伤部位进行复制而避免了死亡，但却带来了高的变异率。以上几种修复系统只有光复活是利用光能，其余均利用 ATP 水解释放的能量。（5）错配修复（甲基指导的不配对修复）错配修复系统(E.coli 中至少有 12 种蛋白质)能够区分“旧”链和“新”链。Dam 甲基化酶可使DNA的GATC序列中腺嘌呤N6位甲基化。复制后的DNA在短期内为半甲基化的GATC 序列，一旦发现错配碱基，就将未甲基化的链切除，而以甲基化的链为模板进行修复合成。第五节 RNA 的生物合成一、转录的定义： RNA 聚合酶的催化下，以一段 DNA 链为模板合成 RNA ，从而将 DNA 所携带的遗传信息传递给 RNA 的过程称为转录。经转录生成的 RNA 有多种，主要的是 rRNA ， tRNA ， mRNA ， snRNA 和 HnRNA 。二、转录的特点： 1、转录的不对称性：双链 DNA 中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由 DNA 传递给 RNA 。对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的 DNA 链上。能够转录 RNA 的那条 DNA 链称为有意义链（模板链），而与之互补的另一条 DNA 链称为反意义链（编码链）。模板链并非永远在同一条单链上。 2、录的连续性：

安徽科技学院：《生物化学》课程教学资源（电子教案）第十一章 核酸的生物合成

安徽科技学院：《生物化学》课程教学资源（电子教案）第十一章核酸的生物合成