呼和浩特职业学院教案首页 课 题第九章电泳分离与检测技术 授课时间 5.4,5.6 授课对象 2013级生物技术及应用1、2班 授课学时 4 1.熟悉电泳分离技术的原理及分类 教学目的2.熟悉常用电泳技术的操作及应用 教学重点 电泳分离技术的原理及操作 教学难点 影响电泳分离的因素 教学方法 举例法，比较法，图示法，提问法，作业法等 一、组织教学：点名、检查学生的出勤情况(5min) 二、 亲子鉴定案例：导入新课：什么是电泳？哪些物质的 教学步骤 分离与检测需要电泳(25min) 及 三、 讲授本次课（原理，种类，特点，应用）(60min) 内容提要 四、老师电泳及检测演示实验(80min) 五、小结与思考题(8min) 六、结束本次课，学生讨论(2min) 备注
呼和浩特职业学院教案首页 课 题 第九章 电泳分离与检测技术 授课时间 5.4,5.6 授课对象 2013 级生物技术及应用 1、2 班 授课学时 4 教学目的 1．熟悉电泳分离技术的原理及分类 2．熟悉常用电泳技术的操作及应用 教学重点 电泳分离技术的原理及操作 教学难点 影响电泳分离的因素 教学方法 举例法，比较法，图示法，提问法，作业法等 教学步骤 及 内容提要 一、组织教学:点名、检查学生的出勤情况（5min） 二、亲子鉴定案例：导入新课：什么是电泳？哪些物质的 分离与检测需要电泳（25min） 三、讲授本次课（原理，种类，特点，应用）（60min） 四、老师电泳及检测演示实验（80min） 五、小结与思考题（8min） 六、结束本次课，学生讨论（2min） 备注
教学内容与设计： 教学提示 提问：亲子鉴定是怎么鉴定的呢？讲解：用的就是电泳技术。 ■鉴定亲子关系目前用得最多的是DNA分型鉴定。人的血液、毛发 睡液、口腔细胞及骨头等都可以用于亲子鉴定，十分方便。 ■一个人有23对(46条)染色体，同一对染色体同一位置上的一对基 因称为等位基因，一般一个来自父亲，一个来自母亲。如果检测到某 个DNA位点的等位基因，一个与母亲相同，另一个就应与父亲相同， 否则就存在疑问了。 ■利用DNA进行亲子鉴定，只要作十几至几十个DNA位点作检测，如 果全部一样，就可以确定亲子关系，如果有3个以上的位点不同，则 可排除亲子关系，有一两个位点不同，则应考虑基因突变的可能，加 做一些位点的检测进行辨别。DNA亲子鉴定，否定亲子关系的准确 率几近100%，肯定亲子关系的准确率可达到99.99%。 提问 新课导入：电泳分离技术有何特点？ 副板书 第九章电泳分离技术 第一节电泳的基本理论及分类 一、电泳的基本理论 (一)概念及原理 导出QE=6πrnv 电场强度(E),所带净电荷一 的半径，n是缓冲液黏度，v是电泳速度 结论：迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的 黏度成反比。 (二)影响电泳分离的主要因素 1、大分子的性质2、电场强度3、溶液的pH4、溶液的离子强度 5、电渗6、温度7、支持物的影响 二、电泳的分类 (一)按分离原理分类 1、区带电泳2、自由界面电泳3、等速电泳4、等电聚焦电泳 2
2 教学内容与设计： 提问：亲子鉴定是怎么鉴定的呢？讲解：用的就是电泳技术。 ◼ 鉴定亲子关系目前用得最多的是 DNA 分型鉴定。人的血液、毛发、 唾液、口腔细胞及骨头等都可以用于亲子鉴定，十分方便。 ◼ 一个人有 23 对（46 条）染色体，同一对染色体同一位置上的一对基 因称为等位基因，一般一个来自父亲，一个来自母亲。如果检测到某 个 DNA 位点的等位基因，一个与母亲相同，另一个就应与父亲相同， 否则就存在疑问了。 ◼ 利用 DNA 进行亲子鉴定，只要作十几至几十个 DNA 位点作检测，如 果全部一样，就可以确定亲子关系，如果有 3 个以上的位点不同，则 可排除亲子关系，有一两个位点不同，则应考虑基因突变的可能，加 做一些位点的检测进行辨别。DNA 亲子鉴定，否定亲子关系的准确 率几近 100%，肯定亲子关系的准确率可达到 99.99%。 新课导入: 电泳分离技术有何特点？ 第九章 电泳分离技术 第一节 电泳的基本理论及分类 一、电泳的基本理论 （一）概念及原理 导出 Q•E = 6πrηυ 电场强度（E），所带净电荷（Q），r 是球状分子 的半径，η 是缓冲液黏度，υ 是电泳速度 结论：迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的 黏度成反比。 （二）影响电泳分离的主要因素 1、大分子的性质 2、电场强度 3、溶液的 pH 4、溶液的离子强度 5、 电渗 6、温度 7、支持物的影响 二、电泳的分类 （一）按分离原理分类 1、区带电泳 2、自由界面电泳 3、等速电泳 4、等电聚焦电泳 教学提示 提问 副板书
教学内容与设计： (二)按有无固体支持物分类 教学提示 按有无固体支持物可以分为两类：自由电泳和支持物电泳。支持物电泳 根据所用的支持物不同又可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳 第二节常用电泳分离技术 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (一)基本原理 重点 1、凝胶的聚合及孔径 2、电泳效应 (二)影响凝胶聚合的因素 1.试剂质量2.凝胶浓度3温度和氧气的影响 (三)聚丙烯酰胺胶体的制备 重点讲解 垂直板型电泳的聚丙烯酰胺胶体的制作方法 画图 (四)聚丙烯酸胺凝胶电泳的特点与用途 副板书 1.电渗作用比较小2.凝胶孔径可调3.电泳分辨率高4.化学稳定性和热稳 定性好5.机械强度高 二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (一)基本原理 在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS),不影响 凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于其自身分子量的大小。 视频法 主要是因为SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松 散的线状。同时大多数蛋白质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合，溶液中 的SDS总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS按1： 1.4的比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。其结果：(1)由于SDS解离后带 提问： 有很强的负电荷，致使SDS-蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电 SDS是什 量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质原有的 么？ 电荷差异：(2)SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白 质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。 (二)SDS-聚丙烯酰胺凝胶胶体的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可采用垂直板型 (三)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点及应用 副板书 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优 点，现己成为测定大多数蛋白质分子量的常用方法。 3
3 教学内容与设计： （二）按有无固体支持物分类 按有无固体支持物可以分为两类：自由电泳和支持物电泳。支持物电泳 根据所用的支持物不同又可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。 第二节 常用电泳分离技术 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）基本原理 1、凝胶的聚合及孔径 2、电泳效应 （二）影响凝胶聚合的因素 1.试剂质量 2.凝胶浓度 3 温度和氧气的影响 （三）聚丙烯酰胺胶体的制备 重点讲解 垂直板型电泳的聚丙烯酰胺胶体的制作方法 （四）聚丙烯酸胺凝胶电泳的特点与用途 1.电渗作用比较小 2.凝胶孔径可调 3.电泳分辨率高 4.化学稳定性和热稳 定性好 5.机械强度高 二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）基本原理 在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS），不影响 凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于其自身分子量的大小。 主要是因为 SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松 散的线状。同时大多数蛋白质的每个氨基酸能与固定量的 SDS 相结合,溶液中 的 SDS 总量，至少要比蛋白质的量高 3 倍以上，大多数蛋白质与 SDS 按 1： 1.4 的比例结合，形成 SDS–蛋白质复合物。其结果：（1）由于 SDS 解离后带 有很强的负电荷，致使 SDS–蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电 量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质原有的 电荷差异；（2）SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白 质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。 （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶胶体的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可采用垂直板型 （三）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点及应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优 点，现已成为测定大多数蛋白质分子量的常用方法。 教学提示 重点 画图 副板书 视频法 提问： SDS 是什 么？ 副板书
教学内容与设计： 三、等电聚焦电泳 (一)基本原理 等电聚焦电泳是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，利 教学提示 用两性电解质形成的一个由阳极到阴极逐步增加的p梯度，使不同的酶或蛋 白质聚焦于与其等电点相当的pH值位置而进行分离的电泳技术。 (二)pH梯度的建立 产生pH梯度的方法通常有两种：一种是用两种不同pH的缓冲液互相打 散，在混合区形成pH梯度，称为人工pH梯度。但这种pH梯度不很稳定， 常用于制备电泳。另一种是利用两性电解质载体(Carrier ampholytes)在电场 了解内容 的作用下自然形成pH梯度，称为天然pH梯度。 (三)支持H梯度的介质 (1)梯度溶液(2)凝胶 (四)等电点聚焦电泳的操作过程 1.H梯度支持介质的制备2.电泳3.分离组分的检测 (五)等电聚焦电泳的特点及应用 (1)具有很高的分辨率(2)显现的区带窄(3)聚焦力强(4)可直接并准 确测出第申点 等电聚焦技术的缺点是：①等电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀：②样品中的成分必须停留在其等电点处，不适用于在等 电点不溶或发生变性的蛋白质 四、其他电泳技术 (一)琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的 提纯、分析琼脂糖凝胶电泳的分辨率较聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，但在分 视频法 离范围上优于聚丙烯酰胺凝胶电泳，并有便于制备和操作的优点。 重点 1234567123456789
4 教学内容与设计： 三、等电聚焦电泳 （一）基本原理 等电聚焦电泳是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，利 用两性电解质形成的一个由阳极到阴极逐步增加的 pH 梯度，使不同的酶或蛋 白质聚焦于与其等电点相当的 pH 值位置而进行分离的电泳技术。 （二）pH 梯度的建立 产生 pH 梯度的方法通常有两种：一种是用两种不同 pH 的缓冲液互相扩 散，在混合区形成 pH 梯度，称为人工 pH 梯度。但这种 pH 梯度不很稳定， 常用于制备电泳。另一种是利用两性电解质载体（Carrier ampholytes）在电场 的作用下自然形成 pH 梯度，称为天然 pH 梯度。 （三）支持 pH 梯度的介质 （1）梯度溶液（2）凝胶 （四）等电点聚焦电泳的操作过程 1.pH 梯度支持介质的制备 2.电泳 3.分离组分的检测 （五）等电聚焦电泳的特点及应用 （1）具有很高的分辨率（2）显现的区带窄（3）聚焦力强（4）可直接并准 确测出等电点 等电聚焦技术的缺点是：①等电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀；②样品中的成分必须停留在其等电点处，不适用于在等 电点不溶或发生变性的蛋白质 四、其他电泳技术 （一）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的 提纯、分析琼脂糖凝胶电泳的分辨率较聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，但在分 离范围上优于聚丙烯酰胺凝胶电泳，并有便于制备和操作的优点。 教学提示 了解内容 视频法 重点
■使用方法： ■L.首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意 极性不要接反。 ■2.电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要 选择稳压稳流方式及电压电流范围。 ■3接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电 泳终止时间，此时电泳即开始进行。 ■4.工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳 插头。 注意事项： ■1.电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可 能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触视频法 电。同时要求仪器必须有良好接地端，以防漏电。 讲授法 ■2.仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发 生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。 ■3.由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同， 其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不 要同时在同一电泳仪上进行。 ■4.在总电流不超过仪器额定电流时（最大电流范围），可以多槽关联使 用，但要注意不能超载，否则容易影响仪器寿命。 (二)醋酸纤维素薄膜电泳 用醋酸纤维素条带或塑料薄膜做支持物来进行的电泳特点是分离快速，在低 电压下，仅0.5~2h,分离出米的区带非常清晰鲜明，背景完全无色，操作方 便，加上不会像纸电泳那样，造成蛋白质的变性，所以醋酸纤维素己在多种 用途上完全取代滤纸电泳，而得到比滤纸电泳更理想的结果，醋酸纤维素溶 解在丙酮里，被分离的区带就可以用比色计测定，非常准确。 总结： 实验植物基因组DNA的分离。 演示法 思考题： 实验法 1.电泳分离技术在生物分离上有哪些应用？ 5
5 ◼ 使用方法： ◼ 1.首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意 极性不要接反。 ◼ 2.电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要 选择稳压稳流方式及电压电流范围。 ◼ 3.接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电 泳终止时间，此时电泳即开始进行。 ◼ 4.工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳 插头。 注意事项： ◼ 1.电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可 能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触 电。同时要求仪器必须有良好接地端，以防漏电。 ◼ 2.仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发 生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。 ◼ 3.由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同， 其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不 要同时在同一电泳仪上进行。 ◼ 4.在总电流不超过仪器额定电流时（最大电流范围），可以多槽关联使 用，但要注意不能超载，否则容易影响仪器寿命。 （二）醋酸纤维素薄膜电泳 用醋酸纤维素条带或塑料薄膜做支持物来进行的电泳特点是分离快速，在低 电压下，仅 0.5～2h，分离出来的区带非常清晰鲜明，背景完全无色，操作方 便，加上不会像纸电泳那样，造成蛋白质的变性，所以醋酸纤维素已在多种 用途上完全取代滤纸电泳，而得到比滤纸电泳更理想的结果，醋酸纤维素溶 解在丙酮里，被分离的区带就可以用比色计测定，非常准确。 总结： 实验植物基因组 DNA 的分离。 思考题： 1.电泳分离技术在生物分离上有哪些应用？ 视频法 讲授法 演示法 实验法