呼和浩特职业学院教案首页 课 题 第七章层析分离技术 授课时间4.20,4.22 授课对象2013级生物技术及应用1、2班 授课学时4 1. 掌握层析分离原理及分类 教学目的 2.掌握常用层析技术的操作方法 3.了解层析设备 教学重点 层析基本技术 教学难点 层析基本原理 教学方法 举例子，演绎法，图示法，比较法，提问法，作业法等 “、 组织教学：点名、检查学生的出勤情况(5min) 二、从威茨曼分离色素实验导入新课：层析技术(25min 教学步骤 三、开始讲解（层析的基本原理与分类，层析分离的基本 及 操作技术，吸附、离子交换、凝胶、疏水、分配柱层析， 内容提要 检测手段气相、液相色谱，仪器分析已讲过(140min) 四、小结与思考题(2min) 五、学习本课程的方法及要求，结束本次课(8min) 备注
呼和浩特职业学院教案首页 课 题 第七章 层析分离技术 授课时间 4.20,4.22 授课对象 2013 级生物技术及应用 1、2 班 授课学时 4 教学目的 1．掌握层析分离原理及分类 2.掌握常用层析技术的操作方法 3.了解层析设备 教学重点 层析基本技术 教学难点 层析基本原理 教学方法 举例子，演绎法，图示法，比较法，提问法，作业法等 教学步骤 及 内容提要 一、组织教学:点名、检查学生的出勤情况（5min） 二、从威茨曼分离色素实验导入新课：层析技术（25min） 三、开始讲解（层析的基本原理与分类，层析分离的基本 操作技术，吸附、离子交换、凝胶、疏水、分配柱层析， 检测手段气相、液相色谱，仪器分析已讲过（140 min） 四、小结与思考题（2 min） 五、学习本课程的方法及要求，结束本次课（8 min） 备注
问题：层析怎样分类，各自有哪些特点 第七章层析分离技术 第一节层析的基本原理与分类（概述） 一、层析分离的基本原理与特点 (一)基本原理 层析分离是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学 性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。其中一相是固定相， 通常为表面积很大的或多孔性固体：另一相是流动相，是液体或气体。当流 动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分 而达到分离，或者说，易于分配于固定相中的物质移动速度慢，易于分配于 流动相中的物质移动速度快，因而逐步分离。 副板书 重点 集组： 副板书 (二)与其他分离纯化方法相比，层析分离具有如下基本特点 ()分离效率高色谱分离的效率是所有分离纯化技术中最高的。 (2)应用范围广从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子 无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，都可用色谱 法分离。 (3)选择性强色谱分离可变参数之多也是其他分离技术无法相比的，因 而具有很强的选择性。 (4)设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件，因而不容易使物质 变性，特别适用于稳定的大分子有机化合物。 层析法的缺点是处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于 实验室，工业生产上还应用较少
2 问题：层析怎样分类，各自有哪些特点 第七章 层析分离技术 第一节 层析的基本原理与分类（概述） 一、层析分离的基本原理与特点 （一）基本原理 层析分离是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学 性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。其中一相是固定相， 通常为表面积很大的或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。当流 动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配 而达到分离，或者说，易于分配于固定相中的物质移动速度慢，易于分配于 流动相中的物质移动速度快，因而逐步分离。 （二）与其他分离纯化方法相比，层析分离具有如下基本特点 （l）分离效率高色谱分离的效率是所有分离纯化技术中最高的。 （2）应用范围广从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、 无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，都可用色谱 法分离。 （3）选择性强色谱分离可变参数之多也是其他分离技术无法相比的，因 而具有很强的选择性。 （4）设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件，因而不容易使物质 变性，特别适用于稳定的大分子有机化合物。 层析法的缺点是处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于 实验室，工业生产上还应用较少。 副板书 重点 副板书
(三)层析的基本概念 1.固定相 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质，也可以是液体物质，这 些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析 的效果起着关键的作用。 2.流动相 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、 气体或租临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时 称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。 3.分配系数及迁移率（或比移值） 副板书 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓 度)的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据， 迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在提问：哪 固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用R,来表示(R<I)。 些物质可 分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的 用作柱层 先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。 析用？ 4分辨率（或分离度） 分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用R,来表示。 5.正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程 中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出 来。 提问：结 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极 合天然药 性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 化的内谷 一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正 想一想， 相柱)，而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱 何谓分配 (或反相柱)。 系数？它 的意义何 在？
3 教学内容与设计 （三）层析的基本概念 1.固定相 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质，也可以是液体物质，这 些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析 的效果起着关键的作用。 2.流动相 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、 气体或租临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时 称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。 3.分配系数及迁移率（或比移值） 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓 度）的比值，常用 K 来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。 迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在 固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用 R,来表示（Rr<1）。 分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的 先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。 4.分辨率（或分离度） 分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用 R，来表示。 5.正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程 中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出 来。 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极 性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正 相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱 （或反相柱）。 副板书 提问：哪 些物质可 用作柱层 析用？ 提问：结 合天然药 化的内容 想一想， 何谓分配 系数？它 的意义何 在？
6.操作容量（或交换容量） 在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上 副板书 的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。它的单位是mg/g(基质)或 重点 mgml(基质)，数值越大，表明基质对该物质的亲和力越强。应当注意，同一种 基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小（空间效 应)、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，实际操作时，加人 的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加人量更要进行控制，否则用 层析办法不能得到有效的分离 二、层析分离技术的分类 (一)依操作形式分 副板书 或根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 1、纸层析：是指以滤纸作为基质的层析。 2、薄层层析：是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进 行层析。 3、柱层析：则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备， 通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物 化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用 柱层析形式。 比较法 图示法 副板书 柱层析 纸层析 薄层色谱
4 6.操作容量（或交换容量） 在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上 的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。它的单位是 mg/g（基质）或 mg/ml（基质），数值越大，表明基质对该物质的亲和力越强。应当注意，同一种 基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小（空间效 应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，实际操作时，加人 的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加人量更要进行控制，否则用 层析办法不能得到有效的分离 二、层析分离技术的分类 （一）依操作形式分 或根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 1、纸层析：是指以滤纸作为基质的层析。 2、薄层层析：是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进 行层析。 3、柱层析：则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备， 通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物 化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用 柱层析形式。 副板书 重点 副板书 比较法 图示法 副板书
(二)依分离机理分 1、吸附层析：是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不 同而达到分离目的的一种层析技术。 本节课的 重点内容 2、分配层析：是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分 配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。 物质在固定相中的浓度 分配系数= 物质在流动相中的浓度 3、凝胶过滤：层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的 举例法 分子大小进行分离的一种层析技术 图示法 4:离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而 进行分离的一种层析技术。 高子交换 ◆ 进行离了交黎
5 （二）依分离机理分 1、吸附层析：是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不 同而达到分离目的的一种层析技术。 2、分配层析：是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分 配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。 3、凝胶过滤：层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的 分子大小进行分离的一种层析技术。 4：离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而 进行分离的一种层析技术。 本节课的 重点内容 举例法 图示法
5:亲和层析：是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制 剂、抗体和抗原、激素和受体等)，将某种配体连接在载体上作为固定相，而对 副板书 能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生 物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。 用平传流泥 (三)依流动相分 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。 1、气相层析是指流动相为气体的层析。 2、液相层析指流动相为液体的层析。 气相层析测定样品时需要气化、大大限制了其在生化领域的应用，主要用于 氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常 用的层析形式，适于生物样品的分析、分离。 相色
6 教学内容与设计： 5：亲和层析：是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制 剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对 能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生 物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。 （三）依流动相分 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。 1、气相层析是指流动相为气体的层析。 2、液相层析指流动相为液体的层析。 气相层析测定样品时需要气化、大大限制了其在生化领域的应用，主要用于 氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常 用的层析形式，适于生物样品的分析、分离。 副板书
总结应用 凝胶层析实例：蛋白质脱盐 举例法 ●高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的小 分子杂质，可以借助凝胶层析法将其除去，这一 操作称为脱盐。 ●葡聚糖凝胶Sephadex-G25因流动阻力小，交联度 适宜，常用于蛋白质溶液的脱盐。 复习回顾 练习题： ·7-1.针对配基的生物学特异性的蛋白质分离方法是（ 作业法 ·A.凝胶过滤 B离子交换层析 提问法 ·C亲和层析 D.纸层析 ·答案(C) ·7-2.用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是(C) ●A.离子交换色谱B.亲和色谱 ·C凝胶过滤色谱D反相色谱 ·答案(C) ● ●7-3.吸附色谱分离的依据是（)。 ·A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小 不同 ●C、各物质在流动相和固定相的分配系数不同 ●D、各物质与专一分子的亲和力不同 ·答案：A
7 总结应用： 练习题： ⚫ 7-1．针对配基的生物学特异性的蛋白质分离方法是（ ）。 ⚫ A.凝胶过滤 B.离子交换层析 ⚫ C.亲和层析 D.纸层析 ⚫ 答案（ C ） ⚫ 7-2．用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（ C ） ⚫ A．离子交换色谱 B.亲和色谱 ⚫ C.凝胶过滤色谱 D.反相色谱 ⚫ 答案（ C ） ⚫ ⚫ 7-3．吸附色谱分离的依据是（ ）。 ⚫ A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小 不同 ⚫ C、各物质在流动相和固定相的分配系数不同 ⚫ D、各物质与专一分子的亲和力不同 ⚫ 答案：A 举例法 作业法 提问法