天津科技大学：《生物化学》课程教学实验技术操作指导（共十四个实验）.doc_大学文库

实验四：碱性蛋白酶活力的测定 16 实验五: 植物组织中 DNA 和 RNA 的提取和鉴定 19 实验六：糖酵解中间产物的鉴定22 实验七：综合设计实验—蛋白质的制备及其含量测定24 实验八：还原糖和总糖的测定（3，5-二硝基水杨酸法） 35 实验九：发酵过程中无机磷的利用37 实验十：氨基酸的分离鉴定—纸层析法39 实验十一：细菌血栓溶解酶活性测定41 实验十二：可溶性糖的硅胶 G 薄层层析43 实验十三：植物材料中总黄酮的提纯与鉴定44 实验十四： IEF/SDS-PAGE 双向电泳分离鉴定蛋白质 45 附录 49 一、实验室主要仪器使用操作规程与注意事项49 二、常用缓冲溶液的配制55 三、硫酸铵饱和度的常用表60 生物化学实验须知 1．实验室规则 (1) 实验课必须提前 5 分钟到实验室,不迟到,不早退，应自觉遵守课堂纪律。 (2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯净, 严防混杂污染。 (3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验室。 (4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。使用精密仪器时, 应严格遵守操作规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。 (5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告, 由课代表收齐交给教师。 (6)仪器损坏时, 应如实向教师报告, 真填写损坏仪器登记表, 然后补偿一定金额。 (7)每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。 2．实验记录实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写

在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。 3．实验报告的书写实验结束后,应及时整理和总结实验结果, 写出实验报告。（1）标题标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验室条件。（2）实验目的（3）实验原理应简述基本原理，不要完全照抄实验指导书。（4）操作步骤操作步骤 (或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。（5）实验结果将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。建议尽量使用图表法来表示实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。（6）讨论包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见等。 4．生物化学实验课评分标准 ◼ 实验预习情况（10%） ◼ 实验操作情况（20%） ◼ 实验报告情况（30%） ◼ 实验考试成绩（40%）实验室一些常用知识介绍一．玻璃仪器的洗涤及一些常用的洗涤剂 1. 玻璃仪器的洗涤（1）新购买的玻璃仪器, 首先用自来水洗去表面灰垢, 然后用洗衣粉刷洗, 自来水冲净后, 浸泡在 1%~2% 盐酸溶液中过夜以除去玻璃表面的碱性物质。最后, 用自来水冲洗干净, 并用蒸馏水冲洗 2 次。（2）对于使用过的玻璃仪器, 应先用自来水冲洗, 再用毛刷蘸取洗衣粉刷洗。用自来水充分冲洗后再用蒸馏水冲洗 2 次。凡洗净的玻璃仪器壁上都不应带有水珠, 否则表示尚未洗净, 需重新洗涤。（3）比较脏的仪器或不便刷洗的仪器, 使用前应用流水冲洗, 以除去粘附物, 如果仪器上有凡士林或其他油污, 应先用软纸擦除, 再用有机溶剂擦净，最后用自来水冲洗。待仪器晾干后, 放入铬酸洗液中浸泡过夜。取出后用自来水充分冲洗, 再用蒸馏水冲洗 2 次。（4）普通玻璃仪器可在烘箱内烘干, 但定量的玻璃仪器如吸管、滴定管、量筒、容量瓶等不能加热, 应晾干备用。另外, 分光光度计中的比色杯的四壁是用特殊胶水粘合而成, 受热

后会散架, 所以也不能烘干。对疑有传染性的样品 ( 如肝炎病人的血清 ), 其容器应先消毒再清洗。盛过剧毒药物或放射性同位素物质的容器, 应先经过专门处理后再清洗。 2. 一些常用的洗涤剂 a. 肥皂水或洗衣粉溶液这是最常用的洗涤剂, 主要是利用其乳化作用以除去污垢, 一般玻璃仪器均可用其刷洗。 b. 铬酸洗液 ( 重铬酸钾一硫酸洗液 ) 铬酸洗液广泛用于玻璃仪器的洗涤, 其清洁效力来自于它的强氧化性 (6 价铬) 和强酸性。铬酸洗液具有强腐蚀性, 使用时应注意安全。铬酸洗液可反复使用多次, 如洗液由红棕色变为绿色或过于稀释则不宜再用。 c. 5%~10% 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na2) 溶液: 加热煮沸, 利用 ED-TA 和金属离子的强配位效应, 可去除玻璃器皿内部钙镁盐类的白色沉淀和不易溶解的重金属盐类。 d. 45% 的尿素洗液: 是蛋白质的良好溶剂, 适用于洗涤盛蛋白质制剂血样的容器。 e.乙醇一硝酸混合液用于清洗一般方法难于洗净的有机物, 最适合于洗涤滴定管。二．生物化学常用缓冲液 1. 磷酸盐缓冲液磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂, 由于它们是二级解离, 有 2 个 pka 值, 所以用它们配制的缓冲液, pH 范围最宽： NaH2P04：pKa1=2.12, pKa2=7.21 Na2HP04：pKa1=7.21, pKa2=12.32 配酸性缓冲液：用 NaH2P04, pH 值为 1~4 。配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐, pH 值为 6~8。配碱性缓冲液：用 Na2HP04, pH 值为 10~12 。磷酸盐缓冲液的优点为： ① 容易配制成各种浓度的缓冲液; ② 适用的 pH 范围宽; ③ pH 受温度的影响小; ④ 缓冲液稀释后 pH 变化小, 如稀释 10 倍后 pH 的变化小于 0.1 。其缺点为： ①易与常见的 Ca2+、 Mg2+以及重金属离子缔合生成沉淀; ②会抑制某些生物化学过程, 如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 2.Tris 缓冲液( 三羟甲基氨基甲烷) Tris 缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多, 有超过磷酸盐缓冲液的趋势, 如在 SDS- 聚丙烯酷胶凝胶电泳中己都使用 Tris 缓冲液, 而很少再用磷酸盐。 Tris 缓冲液的常用有效 pH 范围是在 " 中性 " 范围 , 例如 Tris-HCl 缓冲液 pH 值为 7.5~8.5 Tris- 磷酸盐缓冲液 pH 值为 5.0~9.0 Tris-HCl 缓冲液的优点是： ① 因为 Tris 碱的碱性较强 , 所以可以只用这一种缓冲体系, 配制 pH 范围由酸性到碱性的大范围 pH 值的缓冲液;

② 对生物化学过程干扰很小, 不与钙离子及重金属离子发生沉淀。其缺点是： ①缓冲液的 pH 值受溶液浓度影响较大, 缓冲液稀释 10 倍 , pH 值的变化大于 0.1; ②温度效应大, 温度变化对缓冲液 pH 值的影响很大, 例如 4℃时缓冲液的 pH 值为 8.4, 则 37 ℃时的 pH 值为 7.4, 所以一定要在使用温度下进行配制, 室温下配制的 Tris-HCl 缓冲液不能用于 0~4℃; ③易吸收空气中的 C02, 所以配制的缓冲液要盖严密封; ④此缓冲液对某些 pH 电极发生一定的干扰作用, 所以要使用与 Tris 溶液具有兼容性的电极。 3. 硼酸盐缓冲液常用的有效 pH 范围是：pH 值为 8.5~10.0, 因而它是碱性范围内最常用的缓冲液, 其优点是配制方便, 只使用一种试剂, 缺点是能与很多代谢产物形成络合物, 尤其是能与糖类的短基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。 4. 氨基酸缓冲液此缓冲液使用的范围宽, 可用于 pH 值为 2.0~11.0, 例如最常用的有：甘氨酸 -HCl 缓冲液：pH 值为 2.0~5.0 。甘氨酸 -NaOH 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0 。甘氨酸 -Tris 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0( 此缓冲液用于广泛使用的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液 ) 。组氨酸缓冲液：pH 值为 5.5~6.5 。甘氨酰胺(glycine amide) 缓冲液：pH 值为 7.8~8.8 。甘氨酰甘氨酸 (glycylglycine 〉缓冲液：pH 值为 8.0~9.0 。此类缓冲体系的优点是：为细胞组分和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似, 也会干扰某些生物化学反应过程, 如代谢过程等; ②试剂的价格较高。三．pH 值的测定测定溶液 pH 值通常有两种方法, 最简便但较粗略的方法是用 pH 试纸, 分为广泛和精密 pH 试纸两种。精确测定溶液 pH 值要使用 pH 计, 其精确度可达 0.005 个 pH 单位, 关键是要正确选用和校对 pH 电极。过去是使用两个电极, 即玻璃电极和参比电极, 现在它们已淘汰, 被两种电极合一的复合电极所代替。玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感, 其头部为一薄玻璃泡, 内装有 0.lmol/L HCl, 上部由银 -氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时, 薄玻璃泡内外两侧的电位差取决于溶液的 pH 值, 即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度 ( 活度 ) 的变化而变化。参比电极的功能是提供一个恒定的电位, 作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差的参照。常用的参比电极是甘汞电极 (Hg/HgCl) 或银 -氯化银电极 (Ag/AgCl) 。参比电极电位是氯离子浓度的函数, 因而电极内充以 4mol/L KCl 或饱和 KC1, 以保持恒定的氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和 KCl 是为使电极内沉积有部分 KCl 结晶, 以使 KCl 的饱和浓度不受温度和湿度的影响。现在 pH 值测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极, 即将它们共同组装在

一根玻璃管使用时应注意： (1) 经常检查电极内的 4mol/L KCl 溶液的液面, 如液面过低则应补充 4mol/L KCl 溶液。 (2) 玻璃泡极易破碎, 使用时必须极为小心。 (3) 复合电极长期不用, 可浸泡在 2mol/L KCl 溶液中, 平时可浸泡在无离子水或缓冲溶液中, 使用时取出, 用洗并冲洗玻璃泡部分, 然后用吸水纸吸干余水, 将电极浸入待测溶液中 , 稍加搅拌, 读数时电极应静止不动, 以免数字跳动不稳定。 (4) 使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。 (5) 使用前要用标准缓冲液校正电极, 其数据见书后附录, 常用的 3 种标准缓冲液 pH 值 4.00 、 6.88 和 9.23(20 ℃ ), 精度为± 0.002pH 单位。校正时先将电极放入 6.88 的标准缓冲液中, 用 pH 计上的 " 标准 " 旋钮校正 pH 读数, 然后取出电极洗净, 再放入 pH 值为 4.00 或 9.23 的标准缓冲液中, 用 " 斜率 " 旋钮校正 pH 读数, 如此反复多次, 直至二点校正正确, 再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。 (6) 电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的 pH 值时, 玻璃泡表面会覆盖一层蛋白质膜, 不易洗净而干扰测定, 此时可用 0.1mol/L HCl 的 lInurnl 胃蛋白酶溶液浸泡过夜。若被油脂污染, 可用丙酣浸泡。若电极保存时间过长, 校正数值不准时, 可将电极放入 2mol/L KCl 溶液中 ,40 ℃加热 lh 以上, 进行电极活化。 pH 测定时会有几方面的误差： (1) 钠离子的干扰：多数复合电极对 Na+ 和 H+ 都非常敏感, 尤其是高 pH 值的碱性溶液 ,Na 的干扰更加明显。例如 , 当 Na+ 浓度为 0.1mol/L 时, 可使 pH 值偏低 0.4~ 0.5 个单位。为减少 Na+ 对 pH 测定的干扰, 每个复合电极都应附有一条校正 Na+ 干扰的标准曲线, 有的新式的复合电极具有 Na+ 不透过性能, 如不具备以上两个条件, 则可以将电极内的 KCl 换成 NaCl。 (2 〉浓度效应：溶液的 pH 值与溶液中缓冲离子浓度和其他盐离子浓度有关, 因为溶液 pH 值取决于溶液中的离子活度而不是浓度, 只有在很稀的溶液中, 离子的活度才与其浓度相等。生化实验中经常配制比使用浓度高 10 倍的 " 贮液 ", 使用时再稀释到所需浓度，由于浓度变化很大，溶液 pH 会有变化，因此稀释后仍需对其 pH 进行调整。 (3）温度效应：有的缓冲液的 pH 受温度影响很大，如 Tris 缓冲液，因此配制和使用都要在同一温度下进行。实验一：离子交换法分离氨基酸一、实验目的学习用阳离子交换树脂柱分离氨基酸的操作方法和基本原理。二、实验原理

离子交换层析（ion exchange chromatography，简称 ICE）是分析和制备样品混合物的液 -固相层析方法，是基于待测物质的阳离子或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质的酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附原理将电解质溶液各组分分开。它是从复杂混合物体系中分离性质极为相似的生物分子的有效手段之一。由于带电荷不同的各种物质对离子交换剂有不同亲和力，通过改变洗脱液的离子强度和 pH 值，控制这种亲和力，即可使这些物质依据亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的 pH 值，各种氨基酸分子结构不同，在同一 pH 值时所带电荷的性质（正、负）和多少不同，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序被洗脱液分别洗脱下来，达到分离的效果。三、仪器与试剂（一）实验器材（1）玻璃层析柱（2）试管（3）移液管（4）恒压洗脱瓶（5）部分收集器（6）水浴锅（7）分光光度计（8）电炉（二）材料与试剂（1）苯乙烯磺酸钠型树脂（100~200 目）（2）2mol/L 盐酸溶液（3）2mol/L 氢氧化钠溶液（4）标准氨基酸溶液：将天门冬氨酸和赖氨酸分别配成 2mg/mL 的 0.1mol/L 盐酸溶液。（5）混合氨基酸溶液：将上述天门冬氨酸和赖氨酸溶液按 1：4 比例混合。（6）柠檬酸-氢氧化钠-盐酸溶液（pH5.8，钠离子浓度 0.45mol/L）：取柠檬酸 14.25 克、氢氧化钠 9.30 克分别溶于水后混合，加入浓盐酸 5.25 毫升，定容至 500 毫升；4℃冰箱保存。（7）显色剂：2 克水合茚三酮溶于 95%乙醇中，加水至 100 毫升。四、操作步聚（1）层析柱的准备：将强酸性阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成 Na+型后洗至中性，搅拌 1 小时后装入层析柱，使之自然降沉到一定高度，用缓冲液平衡。（2）平衡：用 pH5.8 的柠檬酸缓冲液冲洗平衡离子交换柱，调节流速，收集洗脱液至 4 倍床体积即可上样。（3）加样分离：将液面缓慢放至贴近层析柱表面，由柱上端仔细加入氨基酸混合液 0.25~0.5 毫升，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，立即加入 0.5 毫升柠檬酸缓冲液。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入 0.5 毫升柠檬酸缓冲液。如此重复两次，然后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液（切勿搅动床面）。用试管收集洗脱液，每管收集 1 毫升，直至无氨基酸流出为止

（4）氨基酸的鉴定：向各管收集液中加入 1 毫升水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中加热 15 分钟，冷至室温测定光密度值。以收集的管数为横坐标，以吸光度值 A 为纵坐标，绘制洗脱曲线。（用以已知两种氨基酸的纯溶液为样品，按上述方法和条件分别操作，将得到的洗脱曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照，即可确定两个峰为何种氨基酸。）五、思考题 1.何谓氨基酸的离子交换？本实验采用的离子交换剂属于哪一种？ 2.离子交换树脂用缓冲液平衡，为何又用缓冲液冲洗？实验中为什么要用 pH5.8 的柠檬酸缓冲液？可不可以用其它 pH 值的缓冲液？如果可以，应选用的 pH 为多少？并阐述原理。 3.茚三酮显色剂在与氨基酸显色时，是与氨基酸的什么基团反应？反应条件是什么？显色时为什么要沸水浴加热？显色原理是什么？ 4.本实验分离的两种氨基酸，是否可以采用阴离子交换树脂分离，如果使用阴离子树脂，条件和结果如何？请说明原理。 5.除氨基酸外，用离子交换柱层析法还适合分离哪些物质？为什么？实验二：垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的学习 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下解离而带电荷。当溶液的 pH 大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的 pH 小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的

区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶 pH=6.7—6.8，下层胶 pH＝8.9；Tris —HCI 缓冲液中的 Tris 用于维持溶液的电中性及 pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在 pH6.8 时，缓冲液中的 Gly-为尾随离子，而在 pH＝8.9 时，Gly 的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间 pH 的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于 SDS 带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与 SDS 充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS 复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： Mr =K(10- b·m ) logMr =LogK—b·Rm，式中 Mr ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； Rm ——相对迁移率。实验证明，蛋白质分子量在 15,000—200,000 的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率 Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴酚蓝)迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。三、试剂及主要器材 1．主要试剂 1)标准蛋白混合液内含：磷酸化酶(Mw 94,000)，牛血清蛋白(Mw 67,000)，肌动蛋白(Mw 43,000)，磷酸酐酶(Mw 30,000)和溶菌酶(Mw 14,000) 2)30％凝胶贮备液：Acr 30g，Bis 0.8g,加蒸馏水至 100mL 3)分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.15g,加水溶解,6mol/L HCl 调 pH8.9,定容 100mL 4)浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6g,加水溶解，6mol/L HCl 调 pH6.8，并定容到 100mL 5)电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 6g，Gly 28.8g，加水溶解并定容到1000mL。用时稀释五倍