外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞分离
实验原理 外周血中的单个核细胞(PBMC)包括单核细胞和淋巴细 胞，其常用的分离方法为密度梯度离心法，采用ficolls分 层液作为分离液。 Ficolls分层液即为聚蔗糖-泛影葡胺分层液，其密度为 1.077±0.001。外周血中的红细胞和粒细胞密度较大，为 1.090左右，而PBMC密度为1.050~1.077，血小板为 1.030~1.035。 红细胞和粒细胞比重大，离心后沉于管底；PBMC的比 重小于或等于分层液，离心后漂浮于分层液的液面上，也 可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面上的细 胞，就可从外周血中分离到单个核细胞
实验原理 • 外周血中的单个核细胞（PBMC）包括单核细胞和淋巴细 胞，其常用的分离方法为密度梯度离心法，采用ficoll分 层液作为分离液。 • Ficoll分层液即为聚蔗糖-泛影葡胺分层液，其密度为 1.077±0.001。外周血中的红细胞和粒细胞密度较大，为 1.090左右，而PBMC密度为1.050～1.077，血小板为 1.030～1.035。 • 红细胞和粒细胞比重大，离心后沉于管底； PBMC的比 重小于或等于分层液，离心后漂浮于分层液的液面上，也 可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面上的细 胞，就可从外周血中分离到单个核细胞
白色云雾状 稀释的血液 一稀释的血浆 水平离心 单个核细胞 1.050-1.077w 10770.001 ·分离液 粒细胞 一红细胞 1.090
主要的试剂和器材 Ficolls分层液 。250U/ml肝素溶液 ·5g/八台盼兰 ·Hanksi液、含20%灭活小牛血清的Hanks液 注射器、一次性试管、一次性吸管、细胞计数板、 载玻片、盖玻片、加样枪、一次性枪头 。水平离心机、显微镜 (注：绿色字体的物品三组一份，放在中间组；一 次性的物品请适量取材。）
主要的试剂和器材 • Ficoll分层液 • 250U/ml 肝素溶液 • 5g/L台盼兰 • Hanks液、含20％灭活小牛血清的Hanks液 • 注射器、一次性试管、一次性吸管、细胞计数板、 载玻片、盖玻片、加样枪、一次性枪头 • 水平离心机、显微镜 （注：绿色字体的物品三组一份，放在中间组；一 次性的物品请适量取材。）
实验步骤 。抽取静脉血1.5ml,打到肝素抗凝管中，再加等量的Hanksi液， 混匀，称为稀释的全血 。 将稀释的全血沿管壁缓缓地加到分层液上 水平离心，2000rpm×20min 吸取白色云雾状的那一层到另一玻璃管中 加入4 ml Hanksi液，混匀，1000rpm×5min,弃上清（洗涤 细胞) 。 将细胞重复洗涤2次（末次用含20%灭活小牛血清的Hanksi液 洗) 末次洗涤后，弃上清，留在管底的即为PBMC,用含20%灭活 小牛血清的Hanks液0.5ml重悬细胞 充池、计数，将细胞调节成1~2×106/ml 取1d细胞悬液和1d台盼兰于玻片上，混匀，计数100个细胞
实验步骤 • 抽取静脉血1.5ml，打到肝素抗凝管中，再加等量的Hanks液， 混匀，称为稀释的全血 • 将稀释的全血沿管壁缓缓地加到分层液上 • 水平离心，2000rpm×20min • 吸取白色云雾状的那一层到另一玻璃管中 • 加入4ml Hanks液，混匀，1000rpm×5min ，弃上清（洗涤 细胞） • 将细胞重复洗涤2次（末次用含20％灭活小牛血清的Hanks液 洗） • 末次洗涤后，弃上清，留在管底的即为PBMC，用含20％灭活 小牛血清的Hanks液0.5ml重悬细胞 • 充池、计数，将细胞调节成1～2×106/ml • 取1d细胞悬液和1d台盼兰于玻片上，混匀，计数100个细胞， 计算细胞活力
实验结果 PBMC计数结课记录和计算 X十X2tX+X4 PBMC计数结果（个m)= X10X10 4 单个核细胞活力计数结果记录和活力计算 100-死细胞数 单个核细胞活力(%) X100% 100 注：死细胞染成蓝色，活细胞不染色
实验结果 • PBMC计数结果记录和计算 • 单个核细胞活力计数结果记录和活力计算 注：死细胞染成蓝色，活细胞不染色
注意事项 将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高 单个核细胞的收获量。 分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。 将稀释的全血加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以 影响分离效果。 温度变化可直接影响分层液的密度，从而影响细胞的收获 率和纯度，故应在室温（18~25℃)下进行实验，分层 液使用之前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多 温度过高，会影响淋巴细胞活性。 分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。离心速 度在2000~2500rpm,离心时间为15-20min,离心后 若间白雾状细胞层中仍掺有红细胞，应该提高转速或延长 离心时间，若淋巴细胞丢失过多，则应该适当降低转速或 离心时间
注意事项 • 将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高 单个核细胞的收获量。 • 分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。 • 将稀释的全血加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以 影响分离效果。 • 温度变化可直接影响分层液的密度，从而影响细胞的收获 率和纯度，故应在室温（18～25℃）下进行实验，分层 液使用之前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多， 温度过高，会影响淋巴细胞活性。 • 分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。离心速 度在2000～2500rpm，离心时间为15-20min，离心后 若间白雾状细胞层中仍掺有红细胞，应该提高转速或延长 离心时间，若淋巴细胞丢失过多，则应该适当降低转速或 离心时间
应用与评价 本方法操作简便、稳定。细胞回收率达80%~90 %,单个核细胞纯度可达95%，细胞活力可达95 %以上。 该方法是目前最理想、最常用的分离淋巴细胞的 手段，其制备的细胞（主要是淋巴细胞，约占 90%~95%)悬液已能满足许多细胞免疫实验要 求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细 胞，故在免疫学实验中有广泛应用，是细胞免疫 检测中最基本的方法之一
应用与评价 • 本方法操作简便、稳定。细胞回收率达80％～90 ％，单个核细胞纯度可达95％，细胞活力可达95 ％以上。 • 该方法是目前最理想、最常用的分离淋巴细胞的 手段，其制备的细胞（主要是淋巴细胞，约占 90%～95% ）悬液已能满足许多细胞免疫实验要 求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细 胞，故在免疫学实验中有广泛应用，是细胞免疫 检测中最基本的方法之一
E花环形成实验
E花环形成实验
实验原理 。人外周血中的T细胞表面具有能与绵羊红细胞 (SRBC)表面糖肽结合的受体，称为E受体 (CD2)。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面 标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细 胞表面，呈现花环状。通过花环形成检测T细胞的方 法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可 测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能 状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等
实验原理 • 人外周血中的T细胞表面具有能与绵羊红细胞 （SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体 （CD2）。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面 标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细 胞表面，呈现花环状。通过花环形成检测T细胞的方 法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可 测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能 状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等