单向免疫扩散试验
单向免疫扩散试验
实验原理 ·将抗体与熔化的琼脂均匀混合，倾注平板， 凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入抗原溶 液，放室温或37℃让其向四周扩散，24~ 48h后，可见孔的周围出现沉淀环。抗原 在一定的浓度范围内，沉淀环的直径和抗 原的量成正相关
实验原理 • 将抗体与熔化的琼脂均匀混合，倾注平板， 凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入抗原溶 液，放室温或37℃让其向四周扩散，24～ 48h后，可见孔的周围出现沉淀环。抗原 在一定的浓度范围内，沉淀环的直径和抗 原的量成正相关
主要的试剂和器材 ·人全血清（作为待测） ·试剂：lgG参考（11.43mg/ml25) 抗lgG 1.5%琼脂 ·器材：玻片、打孔器、微量进样器、37℃水浴箱
主要的试剂和器材 • 人全血清（作为待测） • 试剂：IgG参考（11.43mg/ml 25μι） 抗IgG 1.5％琼脂 • 器材：玻片、打孔器、微量进样器、37℃水浴箱
实验步骤 ·制板用移液管吸10ml琼脂加到含有0.1ml抗 IgG的试管中，颠倒混匀，马上浇板，待冷却凝 固。 ·打孔用打孔器打12个孔，孔径3mm,孔距 10mm. ·稀释lgG参考 2 IgG参考 25 200 125 125 125 (μ) 生理盐水 475 50 125 125 125 (μI)
实验步骤 • 制板 用移液管吸10ml琼脂加到含有0.1ml抗 IgG的试管中，颠倒混匀，马上浇板，待冷却凝 固。 • 打孔 用打孔器打12个孔，孔径3mm，孔距 10mm。 • 稀释IgG参考1 2 3 4 5 IgG参考 （µl） 25 200 125 125 125 生理盐水 （ µl ） 475 50 125 125 125
·稀释人全血清用生理盐水进行50倍稀释。 ·加样五个稀释度的gG参考和稀释的人全血清， 每个加两孔，每孔9。 ·温育放在湿盒中，37℃，24h
• 稀释人全血清 用生理盐水进行50倍稀释。 • 加样 五个稀释度的IgG参考和稀释的人全血清， 每个加两孔，每孔9μι 。 • 温育 放在湿盒中，37℃，24h
结果观察和记录 ·孔的周围会出现白色的沉淀环，量出各个沉淀环 的直径（Φ）。 1 3 5 待测1待测2 IgG稀释度 1:201:251:501:1001:200 IgG浓度（μg/ml)571.5457.2228.6114.357.15 中 中2 Φ
结果观察和记录 • 孔的周围会出现白色的沉淀环，量出各个沉淀环 的直径（Ф）
结果计算 ·以直径为横坐标，以IgG参考的浓度的对数 值为纵坐标，制作标准曲线，从而计算出 待测血清中IgG的浓度
结果计算 • 以直径为横坐标，以IgG参考的浓度的对数 值为纵坐标，制作标准曲线，从而计算出 待测血清中IgG的浓度
注意事项 ·浇板用的玻片要洁净。 ·制备抗体琼脂板时，琼脂温度要严格的控 制。温度太低会导致琼脂凝固，太高将影 响所加抗体的活性。 ·加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔 的边缘，确保每孔的液面基本一致。 ·加样时，不能将样品加到孔的外面
注意事项 • 浇板用的玻片要洁净。 • 制备抗体琼脂板时，琼脂温度要严格的控 制。温度太低会导致琼脂凝固，太高将影 响所加抗体的活性。 • 加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔 的边缘，确保每孔的液面基本一致。 • 加样时，不能将样品加到孔的外面