实验八 酶促反应的影响因素 一、目的要求 1．了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。 2．学习检定温度、pH、激活剂、抑制剂影响酶促反应速度的方法。 二、实验原理 在酶促反应中，酶的催化活性与环境温度、 pH 有密切关系，通常各种酶只 有在一定的温度、pH 范围内才表现它的活性，一种酶表现其活性最高时的温度、 pH 值称为该酶的最适温度、最适 pH。 在酶促反应中， 酶的激活剂和抑制剂可加速或抑制酶的活性，如氯化钠在 低浓度时为唾液淀粉酶的激活剂，而硫酸铜则是它的抑制剂。 本实验利用淀粉水解过程中不同阶段的产物与碘有不同的颜色反应，定性观 察唾液淀粉酶在酶促反应中各种因素对其活性的影响。 淀粉（遇碘呈蓝色）→紫色糊精(遇碘呈紫色)→红色糊精(遇碘呈红色)→无 色糊精 (遇碘不呈色)→麦芽糖(遇碘不呈色)→葡萄糖(遇碘不呈色)。 所以淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判 断，以此反映淀粉酶的活性，由此检定温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应的 影响。 三、实验器材 试管和试管架、恒温水浴、冰浴、吸量管（1 mL6 支、2 mL4 支、5 mL4 支）、 滴管、量筒、玻棒、白瓷板、秒表、烧杯、棕色瓶。 四、实验试剂 1．新鲜唾液稀释液(唾液淀粉酶液)：每位同学进实验室自己制备，先用蒸 馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，0.5 min 后使其流入量筒并稀释 至 200 倍(稀释倍数可因人而异)混匀备用。 2．1%淀粉溶液 A(含 0.3%NaCl)：将 1 g 可溶性淀粉及 0.3 g 氯化钠混悬于 5 mL 蒸馏水中，搅动后，缓慢倒入沸腾的 60 mL 蒸馏水中，搅动煮沸 1 min，冷 却至室温，加水至 100 mL,置冰箱中保存。 3．1%淀粉溶液 B(不含 NaCl) 4．碘液：称取 2 g 碘化钾溶于 5 mL 蒸馏水中，再加入 1 g 碘，待碘完全溶 解后，加蒸馏水 295 mL，混匀贮于棕色瓶中。 5．1%NaCl 溶液 6．1%CuSO4溶液 7．缓冲溶液系统按下表混合配制
实验八 酶促反应的影响因素 一、目的要求 1．了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。 2．学习检定温度、pH、激活剂、抑制剂影响酶促反应速度的方法。 二、实验原理 在酶促反应中，酶的催化活性与环境温度、 pH 有密切关系，通常各种酶只 有在一定的温度、pH 范围内才表现它的活性，一种酶表现其活性最高时的温度、 pH 值称为该酶的最适温度、最适 pH。 在酶促反应中， 酶的激活剂和抑制剂可加速或抑制酶的活性，如氯化钠在 低浓度时为唾液淀粉酶的激活剂，而硫酸铜则是它的抑制剂。 本实验利用淀粉水解过程中不同阶段的产物与碘有不同的颜色反应，定性观 察唾液淀粉酶在酶促反应中各种因素对其活性的影响。 淀粉（遇碘呈蓝色）→紫色糊精(遇碘呈紫色)→红色糊精(遇碘呈红色)→无 色糊精 (遇碘不呈色)→麦芽糖(遇碘不呈色)→葡萄糖(遇碘不呈色)。 所以淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判 断，以此反映淀粉酶的活性，由此检定温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应的 影响。 三、实验器材 试管和试管架、恒温水浴、冰浴、吸量管（1 mL6 支、2 mL4 支、5 mL4 支）、 滴管、量筒、玻棒、白瓷板、秒表、烧杯、棕色瓶。 四、实验试剂 1．新鲜唾液稀释液(唾液淀粉酶液)：每位同学进实验室自己制备，先用蒸 馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，0.5 min 后使其流入量筒并稀释 至 200 倍(稀释倍数可因人而异)混匀备用。 2．1%淀粉溶液 A(含 0.3%NaCl)：将 1 g 可溶性淀粉及 0.3 g 氯化钠混悬于 5 mL 蒸馏水中，搅动后，缓慢倒入沸腾的 60 mL 蒸馏水中，搅动煮沸 1 min，冷 却至室温，加水至 100 mL,置冰箱中保存。 3．1%淀粉溶液 B(不含 NaCl) 4．碘液：称取 2 g 碘化钾溶于 5 mL 蒸馏水中，再加入 1 g 碘，待碘完全溶 解后，加蒸馏水 295 mL，混匀贮于棕色瓶中。 5．1%NaCl 溶液 6．1%CuSO4溶液 7．缓冲溶液系统按下表混合配制
五、操作步骤 1．温度对酶促反应的影响 取 3 支试管编号，按下表进行操作： 试管 号 淀粉酶 液体积 / mL 酶液处理温 度/ ℃，5 min pH6.8缓冲溶 液体积/ mL 1%淀粉溶 液 A 体积/ mL 反应温 度/ ℃，10 min 观察结果 1 2 3 1 1 1 0 37～40 70 左右 2 2 2 1 1 1 0 37～40 70 左右 上述各管在不同的温度下保温反应 10 min 后，立即取出，流水冷却 3 min， 向各管分别加入碘液 1 滴。仔细观察各试管溶液的颜色并记录，说明温度对酶活 性的影响，确定最适温度。 2．pH 对酶促反应的影响 取 1 支试管,加入 1%淀粉溶液(A)2 mL、pH6.8 缓冲溶液 3 mL、淀粉酶液 2 mL， 摇匀后，向试管内插入一支玻棒,置 37 ℃水浴保温。每隔 1 min 用玻棒从试管 中取出 1 滴混合液于白瓷板上，随即加入碘液 1 滴，检查淀粉水解程度。待混合 液遇碘不变色时，从水浴中取出试管，立即加入碘液 1 滴，摇匀后，观察溶液的 颜色，再次确认水解程度。记录从加入酶液到加入碘液的时间，此时间称为保温 时间。若保温时间太短（2～3 min），说明酶液活力太高，应酌情稀释酶液；若 保温时间太长（15 min 以上），说明酶液活力太低，应酌情减少稀释倍数，保温 时间最好在 8～15 min。然后进行如下操作： 取 4 支试管编号，按下表操作： 试管号 缓冲溶液体积/ mL 1% 淀粉溶 液 A 体积/ mL 淀粉酶液体积/ mL（每隔 1 min 逐管加入） 观察 结果 pH 5.0 pH 5.8 pH 6.8 pH 8.0 1 2 3 4 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 2 2 2 2 2 2 2 2 pH 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液 体积/ mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液 体积/ mL 5.0 5.8 6.8 8.0 5.15 6.05 7.72 9.72 4.85 3.95 2.28 0.28
五、操作步骤 1．温度对酶促反应的影响 取 3 支试管编号，按下表进行操作： 试管 号 淀粉酶 液体积 / mL 酶液处理温 度/ ℃，5 min pH6.8缓冲溶 液体积/ mL 1%淀粉溶 液 A 体积/ mL 反应温 度/ ℃，10 min 观察结果 1 2 3 1 1 1 0 37～40 70 左右 2 2 2 1 1 1 0 37～40 70 左右 上述各管在不同的温度下保温反应 10 min 后，立即取出，流水冷却 3 min， 向各管分别加入碘液 1 滴。仔细观察各试管溶液的颜色并记录，说明温度对酶活 性的影响，确定最适温度。 2．pH 对酶促反应的影响 取 1 支试管,加入 1%淀粉溶液(A)2 mL、pH6.8 缓冲溶液 3 mL、淀粉酶液 2 mL， 摇匀后，向试管内插入一支玻棒,置 37 ℃水浴保温。每隔 1 min 用玻棒从试管 中取出 1 滴混合液于白瓷板上，随即加入碘液 1 滴，检查淀粉水解程度。待混合 液遇碘不变色时，从水浴中取出试管，立即加入碘液 1 滴，摇匀后，观察溶液的 颜色，再次确认水解程度。记录从加入酶液到加入碘液的时间，此时间称为保温 时间。若保温时间太短（2～3 min），说明酶液活力太高，应酌情稀释酶液；若 保温时间太长（15 min 以上），说明酶液活力太低，应酌情减少稀释倍数，保温 时间最好在 8～15 min。然后进行如下操作： 取 4 支试管编号，按下表操作： 试管号 缓冲溶液体积/ mL 1% 淀粉溶 液 A 体积/ mL 淀粉酶液体积/ mL（每隔 1 min 逐管加入） 观察 结果 pH 5.0 pH 5.8 pH 6.8 pH 8.0 1 2 3 4 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 2 2 2 2 2 2 2 2 pH 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液 体积/ mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液 体积/ mL 5.0 5.8 6.8 8.0 5.15 6.05 7.72 9.72 4.85 3.95 2.28 0.28
将上述各管溶液混匀后，再以 1 min 间隔依次将 4 支试管置于 37 ℃水浴中 保温。达保温时间后，依次将各管迅速取出，并立即加入碘液 1 滴。观察各试管 溶液的颜色并记录。分析 pH 对酶促反应的影响，确定最适 pH。 3．激活剂、抑制剂对酶促反应的影响 取 3 支试管编号，按下表加入各试剂（体积单位：mL）： 试管 号 1%淀粉溶液B 1%NaCl溶液 1%CuSO4 溶 液 蒸馏 水 淀 粉 酶液 观察结 果 1 2 3 2 2 2 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 将上述各管溶液混匀后，向 1 号试管内插入一支玻棒，3 支试管同置于 37 ℃ 水浴保温 1 min 左右，用玻棒从 1 号试管中取出 1 滴混合液，检查淀粉水解程度 (方法同步骤 2)。待混合液遇碘液不变色时，从水浴中迅速取出 3 支试管，各加 碘液 1 滴。摇匀观察各试管溶液的颜色并记录，分析酶的激活和抑制情况。 六、注意事项 1．加入酶液后，要充分摇匀，保证酶液与全部淀粉液接触反应，得到理想 的颜色梯度变化。 2．用玻棒取液前，应将试管内溶液充分混匀，取出试液后， 立即放回试管 中一起保温。 七、问题与思考 1．什么是酶的最适温度、最适 pH？ 它们是酶的特征物理常数吗？ 2．激活剂分几类? 氯化钠属哪种类型？ 硫酸钠对淀粉酶的活性有无影 响？
将上述各管溶液混匀后，再以 1 min 间隔依次将 4 支试管置于 37 ℃水浴中 保温。达保温时间后，依次将各管迅速取出，并立即加入碘液 1 滴。观察各试管 溶液的颜色并记录。分析 pH 对酶促反应的影响，确定最适 pH。 3．激活剂、抑制剂对酶促反应的影响 取 3 支试管编号，按下表加入各试剂（体积单位：mL）： 试管 号 1%淀粉溶液B 1%NaCl溶液 1%CuSO4 溶 液 蒸馏 水 淀 粉 酶液 观察结 果 1 2 3 2 2 2 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 将上述各管溶液混匀后，向 1 号试管内插入一支玻棒，3 支试管同置于 37 ℃ 水浴保温 1 min 左右，用玻棒从 1 号试管中取出 1 滴混合液，检查淀粉水解程度 (方法同步骤 2)。待混合液遇碘液不变色时，从水浴中迅速取出 3 支试管，各加 碘液 1 滴。摇匀观察各试管溶液的颜色并记录，分析酶的激活和抑制情况。 六、注意事项 1．加入酶液后，要充分摇匀，保证酶液与全部淀粉液接触反应，得到理想 的颜色梯度变化。 2．用玻棒取液前，应将试管内溶液充分混匀，取出试液后， 立即放回试管 中一起保温。 七、问题与思考 1．什么是酶的最适温度、最适 pH？ 它们是酶的特征物理常数吗？ 2．激活剂分几类? 氯化钠属哪种类型？ 硫酸钠对淀粉酶的活性有无影 响？