实验十一 色素的分离(层析法) 一、目的要求 1．进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。 2．学会用层析法分离色素的操作技术，了解层析分析的有关知识。 二、实验原理 层析分离技术是一种物理分离方法，按分离原理的不同，层析法可分为吸附 层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等数种方法。按操作方式的不同，又 可分为柱型、薄层和纸型。在本实验中采用柱吸附层析法分离叶色素，由于叶色 素中各色素被吸附剂吸附的程度不同以及它们被溶剂溶解的能力不同，所以在层 析柱中向下移动的距离不同而得以分离。 用适当的溶剂如石油醚、甲醇、丙酮、苯等，可将绿叶中的色素（叶绿素 a、 叶绿素 b、胡萝卜素、叶黄素）提取出来，提取液通过吸附柱将其中的各种色素 分开，吸附柱常用蔗糖、碳酸钙、氧化铝等吸附剂制成。 三、实验器材 抽滤瓶、研钵、带托玻璃棒、层析柱(20 ㎝×1 ㎝)、分液漏斗、烧杯，具塞 试管。 40 ℃烘干的菠菜叶、脱脂棉 四、实验试剂 1.石油醚 2.甲醇 3.苯 4.无水硫酸钠 5.细粉状蔗糖 6.无水碳酸钙 7.氧化铝 8.海砂 五、操作步骤 1．取烘干的菠菜叶 1 g 置于研钵中，加少许海砂研碎。浸入含有 22.5 mL 的石油醚、2.5 mL 苯和 7.5 mL 甲醇的混合溶剂中，放置约 1 h。 2．将上述溶液置于分液漏斗中，加 5 mL 水轻轻上下颠倒数次，静置后弃去 水层（其中溶有甲醇），应避免剧烈振荡，否则发生乳化现象。将剩余的液体通 过装有无水硫酸钠（5 g）的漏斗过滤除去水分，即得到色素提取液(必要时可在 通风橱中小心浓缩)。提取液于干燥的试管中保存，并用塞子将试管塞紧。 3．取层析柱 1 支（也可用 25 mL 酸式滴定管代替），在下端塞上一块脱脂棉， 将约 2 g 细粉状氧化铝装入柱中，每装少许就用带托的玻璃棒压紧，尤其四周要 与柱壁紧密相接，不得留有空隙。装到 3 cm 高为止。用同样的方法装入约 2.5 g 细粉状碳酸钙，高度为 5 cm，然后再用同样的方法将约 3.5 g 的细蔗糖粉末装 入柱内，高度为 7 cm。最后在蔗糖上面再放一块脱脂棉，将准备好的吸附柱装 在抽滤瓶上(见图实-3)
实验十一 色素的分离(层析法) 一、目的要求 1．进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。 2．学会用层析法分离色素的操作技术，了解层析分析的有关知识。 二、实验原理 层析分离技术是一种物理分离方法，按分离原理的不同，层析法可分为吸附 层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等数种方法。按操作方式的不同，又 可分为柱型、薄层和纸型。在本实验中采用柱吸附层析法分离叶色素，由于叶色 素中各色素被吸附剂吸附的程度不同以及它们被溶剂溶解的能力不同，所以在层 析柱中向下移动的距离不同而得以分离。 用适当的溶剂如石油醚、甲醇、丙酮、苯等，可将绿叶中的色素（叶绿素 a、 叶绿素 b、胡萝卜素、叶黄素）提取出来，提取液通过吸附柱将其中的各种色素 分开，吸附柱常用蔗糖、碳酸钙、氧化铝等吸附剂制成。 三、实验器材 抽滤瓶、研钵、带托玻璃棒、层析柱(20 ㎝×1 ㎝)、分液漏斗、烧杯，具塞 试管。 40 ℃烘干的菠菜叶、脱脂棉 四、实验试剂 1.石油醚 2.甲醇 3.苯 4.无水硫酸钠 5.细粉状蔗糖 6.无水碳酸钙 7.氧化铝 8.海砂 五、操作步骤 1．取烘干的菠菜叶 1 g 置于研钵中，加少许海砂研碎。浸入含有 22.5 mL 的石油醚、2.5 mL 苯和 7.5 mL 甲醇的混合溶剂中，放置约 1 h。 2．将上述溶液置于分液漏斗中，加 5 mL 水轻轻上下颠倒数次，静置后弃去 水层（其中溶有甲醇），应避免剧烈振荡，否则发生乳化现象。将剩余的液体通 过装有无水硫酸钠（5 g）的漏斗过滤除去水分，即得到色素提取液(必要时可在 通风橱中小心浓缩)。提取液于干燥的试管中保存，并用塞子将试管塞紧。 3．取层析柱 1 支（也可用 25 mL 酸式滴定管代替），在下端塞上一块脱脂棉， 将约 2 g 细粉状氧化铝装入柱中，每装少许就用带托的玻璃棒压紧，尤其四周要 与柱壁紧密相接，不得留有空隙。装到 3 cm 高为止。用同样的方法装入约 2.5 g 细粉状碳酸钙，高度为 5 cm，然后再用同样的方法将约 3.5 g 的细蔗糖粉末装 入柱内，高度为 7 cm。最后在蔗糖上面再放一块脱脂棉，将准备好的吸附柱装 在抽滤瓶上(见图实-3)
4．将石油醚和苯的混合液（体积比为 4∶1）从柱的上端注入，使其通过吸 附柱，缓慢抽滤。 5．不要等混合液渗干(吸附柱上还保留一些混合液时)，将色素提取液从柱 上端注入。 6．使提取液通过吸附柱，并继续加入石油醚和苯的混合洗脱液至能区分开 柱上清晰的色带为止。 7．观察各色素在吸附柱上的位置、排列次序和颜色。叶绿素 a 为蓝绿色、 叶绿素 b 为黄绿色、胡萝卜素为橙黄色、叶黄素为米黄色。 图实-3 柱吸附层析示意图 图实-4 纸层析分 离叶色素示意图 1.脱脂棉 2.叶绿素 3.叶绿素 1.大木塞 2.大试管 3.滤纸 4. 叶黄素 5. 胡萝卜素 6. 脱脂棉 4.点样线 5.汽油 六、说明事项 叶色素分离最简单的方法是纸层析法(属分配层析)。 当溶剂不断地从纸上 流过时， 由于混合物中各成分在两相之间具有不同的分配系数，使其移动速度不同而使各 色素分离。方法如下： (1)取叶粉（鲜菜叶在 80 ℃下烘干，研成粉末）2 g 于小烧杯中，加 95%乙 醇 20～30 mL 浸提。浸提中，用玻棒搅动，待乙醇呈深绿色，过滤于锥形瓶中备 用。 (2)用毛细管吸取提取液，在滤纸的一端划一条直线，风干后再重复划几次。 (3)取带木塞大试管一支，加入适量汽油并加 1～2 滴苯。将点样的滤纸条放 入试管中，下端浸入汽油中，点样线要在液面上（见图实-4）。滤纸边缘不可碰 到试管壁，盖紧塞子，直立于暗处层析。 (4)汽油沿滤纸上升，当溶剂前沿接近滤纸顶部时，将滤纸取下，风干后即 可看到分离的各种色素带。 七、问题与思考 1.吸附层析法的原理是什么？ 2.为什么胡萝卜素在层析柱中移动得最快？
4．将石油醚和苯的混合液（体积比为 4∶1）从柱的上端注入，使其通过吸 附柱，缓慢抽滤。 5．不要等混合液渗干(吸附柱上还保留一些混合液时)，将色素提取液从柱 上端注入。 6．使提取液通过吸附柱，并继续加入石油醚和苯的混合洗脱液至能区分开 柱上清晰的色带为止。 7．观察各色素在吸附柱上的位置、排列次序和颜色。叶绿素 a 为蓝绿色、 叶绿素 b 为黄绿色、胡萝卜素为橙黄色、叶黄素为米黄色。 图实-3 柱吸附层析示意图 图实-4 纸层析分 离叶色素示意图 1.脱脂棉 2.叶绿素 3.叶绿素 1.大木塞 2.大试管 3.滤纸 4. 叶黄素 5. 胡萝卜素 6. 脱脂棉 4.点样线 5.汽油 六、说明事项 叶色素分离最简单的方法是纸层析法(属分配层析)。 当溶剂不断地从纸上 流过时， 由于混合物中各成分在两相之间具有不同的分配系数，使其移动速度不同而使各 色素分离。方法如下： (1)取叶粉（鲜菜叶在 80 ℃下烘干，研成粉末）2 g 于小烧杯中，加 95%乙 醇 20～30 mL 浸提。浸提中，用玻棒搅动，待乙醇呈深绿色，过滤于锥形瓶中备 用。 (2)用毛细管吸取提取液，在滤纸的一端划一条直线，风干后再重复划几次。 (3)取带木塞大试管一支，加入适量汽油并加 1～2 滴苯。将点样的滤纸条放 入试管中，下端浸入汽油中，点样线要在液面上（见图实-4）。滤纸边缘不可碰 到试管壁，盖紧塞子，直立于暗处层析。 (4)汽油沿滤纸上升，当溶剂前沿接近滤纸顶部时，将滤纸取下，风干后即 可看到分离的各种色素带。 七、问题与思考 1.吸附层析法的原理是什么？ 2.为什么胡萝卜素在层析柱中移动得最快？