实验十八 食品中着色剂的测定 一、目的与要求： 1、明确测定各类色素的原理与方法。 2、通过此实验掌握纸层析定性法与提纯色素的定量法。 二、原理： 聚酰胺是具有二极性的化合物，水溶性酸性染料在酸性条件下被聚酰胺吸附， 而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后与标准比较定 性、定量。 三、试剂： 1、聚酰胺粉(尼龙 6) 2、硫酸 1：1 0 3、甲醇—甲酸溶液：6：4 4、甲醇 5、20％柠檬酸溶液 6、10％钨酸钠溶液 7、石油醚：沸程 60-90℃ 8、海砂：先用 l：10 盐酸煮沸 15min，用水洗中性，再用 5％氢氧化钠溶液煮 沸 15min，再于 105℃干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用。 9、乙醇-氨溶液：取 1 毫升氨水，加 70％乙醇至 100 毫升。 10、50％ 乙醇溶液 11、硅胶 G。 12、PH6 的水：用 20％柠檬酸调节至 PH 6。 13、盐酸: 1：10 14、5％氢氧钠溶液 15、碎瓷片：处理方法同海砂 16、展开剂 a、正丁醇-无水乙醇-1％氨水(6：2：3)：供纸色谱用。 b、正丁醇-吡啶-1％氨水(6：3：4)：供纸色谱用。 c、甲乙酮-丙酮-水(7：3：3)：供纸色谱用。 d、甲醇-乙二胺-氨水(10：3：2)：供薄层色谱用
实验十八 食品中着色剂的测定 一、目的与要求： 1、明确测定各类色素的原理与方法。 2、通过此实验掌握纸层析定性法与提纯色素的定量法。 二、原理： 聚酰胺是具有二极性的化合物，水溶性酸性染料在酸性条件下被聚酰胺吸附， 而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后与标准比较定 性、定量。 三、试剂： 1、聚酰胺粉(尼龙 6) 2、硫酸 1：1 0 3、甲醇—甲酸溶液：6：4 4、甲醇 5、20％柠檬酸溶液 6、10％钨酸钠溶液 7、石油醚：沸程 60-90℃ 8、海砂：先用 l：10 盐酸煮沸 15min，用水洗中性，再用 5％氢氧化钠溶液煮 沸 15min，再于 105℃干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用。 9、乙醇-氨溶液：取 1 毫升氨水，加 70％乙醇至 100 毫升。 10、50％ 乙醇溶液 11、硅胶 G。 12、PH6 的水：用 20％柠檬酸调节至 PH 6。 13、盐酸: 1：10 14、5％氢氧钠溶液 15、碎瓷片：处理方法同海砂 16、展开剂 a、正丁醇-无水乙醇-1％氨水(6：2：3)：供纸色谱用。 b、正丁醇-吡啶-1％氨水(6：3：4)：供纸色谱用。 c、甲乙酮-丙酮-水(7：3：3)：供纸色谱用。 d、甲醇-乙二胺-氨水(10：3：2)：供薄层色谱用
e、甲醇-氨水-乙醇(5：1：10)：供薄层色谱用。 f、2.5％柠檬酸钠-氨水-乙醇(8：1：2)供薄层色谱用。 17、色素标准溶液{以下商品作为标准以 100％计。 胭脂红：纯度 60％；苋菜红：纯度 60％；柠檬黄：纯度 60%；靛蓝：纯度 40％； 日落黄：纯度 60％，亮蓝；纯度 60％。 精密称取上述色素各 0.100 克，用 PH6 的水溶解，移入 100 毫升容量瓶中并 稀释至刻度。此溶液每毫升相当于 1 毫克商品色素。靛蓝溶液需在暗处保存。 18、色素标准使用液：用时吸取色素标准溶液各 5.0 毫升，分别置于 50 毫升 容量瓶中，加 PH6 的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于 0.1 毫克商品色素。 四、仪器： 1、分光光度计 2、微量注射器或色素吸管 3、展开槽，25 X 6 x 4cm 4、层析缸 5、滤纸、中速滤纸，纸色谱用 6、薄层板：5 X 20em 7、电吹风机 8、水泵 五、操作方法： 1、样品处理 A、果味水、果子露、汽水：吸取 50.0 毫升样品于 100 毫升烧杯中，汽水需 加热驱除二氧化碳。 B、配制酒：吸取 100.0 毫升样品于烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。 C、硬糖：蜜饯类，淀粉软糖：称取 5.0 或 10.0 克粉碎的样品，加 30 毫升水， 温热溶解，若样液 PH 值较高，用 20％柠檬酸溶液调至 PH4 左右。 D、含蛋奶的样品 (1)奶糖：称取 10.0 克粉碎均匀的样品，加 30 毫升乙醇-氨溶液溶解，置水浴 上浓缩至约 20 毫升，立即用 1：10 硫酸调溶液至微酸隆再加 1.0 毫升 1：l0 硫酸， 加 1 毫升 l0％钨酸钠溶液，使蛋白质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。 (2)蛋糕类：称取 10.0 克粉碎均匀的样品，加海砂少许，混匀、用热风风干样
e、甲醇-氨水-乙醇(5：1：10)：供薄层色谱用。 f、2.5％柠檬酸钠-氨水-乙醇(8：1：2)供薄层色谱用。 17、色素标准溶液{以下商品作为标准以 100％计。 胭脂红：纯度 60％；苋菜红：纯度 60％；柠檬黄：纯度 60%；靛蓝：纯度 40％； 日落黄：纯度 60％，亮蓝；纯度 60％。 精密称取上述色素各 0.100 克，用 PH6 的水溶解，移入 100 毫升容量瓶中并 稀释至刻度。此溶液每毫升相当于 1 毫克商品色素。靛蓝溶液需在暗处保存。 18、色素标准使用液：用时吸取色素标准溶液各 5.0 毫升，分别置于 50 毫升 容量瓶中，加 PH6 的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于 0.1 毫克商品色素。 四、仪器： 1、分光光度计 2、微量注射器或色素吸管 3、展开槽，25 X 6 x 4cm 4、层析缸 5、滤纸、中速滤纸，纸色谱用 6、薄层板：5 X 20em 7、电吹风机 8、水泵 五、操作方法： 1、样品处理 A、果味水、果子露、汽水：吸取 50.0 毫升样品于 100 毫升烧杯中，汽水需 加热驱除二氧化碳。 B、配制酒：吸取 100.0 毫升样品于烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。 C、硬糖：蜜饯类，淀粉软糖：称取 5.0 或 10.0 克粉碎的样品，加 30 毫升水， 温热溶解，若样液 PH 值较高，用 20％柠檬酸溶液调至 PH4 左右。 D、含蛋奶的样品 (1)奶糖：称取 10.0 克粉碎均匀的样品，加 30 毫升乙醇-氨溶液溶解，置水浴 上浓缩至约 20 毫升，立即用 1：10 硫酸调溶液至微酸隆再加 1.0 毫升 1：l0 硫酸， 加 1 毫升 l0％钨酸钠溶液，使蛋白质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。 (2)蛋糕类：称取 10.0 克粉碎均匀的样品，加海砂少许，混匀、用热风风干样
品(用手摸已干燥即可以)，加入 30 毫升石油醚搅拌，放置片刻，倾出石油醚， 如此重复处理三次，以除去脂肪吹干后研细，全部转人 G3 垂融漏斗或普通漏斗 中，用乙醇—氨溶液提取色素，直至色素全部提完以下按(1)自“置水浴下浓缩 至约 20 毫升”起依法操作。 2、吸附分离 将处理后所得的溶液加热至 70℃，加入 0.5-1.0 克聚酰胺粉充分搅拌，用 20％ 柠檬酸溶液调 PH 至 4，使色素完全被吸附，若溶液还有颜色，可以再加一些聚 酰胺粉。将吸附色素的聚酰胺全部转入 G3 垂融漏斗或玻璃漏斗中过滤(如用 G3 垂融漏斗过滤，可以用水泵慢慢地抽滤)。用 20％柠檬酸酸化 PH＝4 的 70℃水 反复洗涤，每次 20 毫升，边洗边搅拌，若含有天然色素再用甲醇-甲酸溶液洗涤 1-3 次，每次 20 毫升，至洗液无色为止。再用 70℃水多次洗涤至流出的溶液为 中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇-氨溶液分次解吸全部色素，收集 全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至 50 毫升，用分光 光度法进行测定。如果为多种色素混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测 定，即将上述溶液置水浴上浓缩至约 2 毫升后移人 5 毫升容量瓶中，用 50％乙 醇洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。 3、定性 A、纸色谱 取色谱用纸，在距底边 2cm 的起始线上分别点 3-10 微升样品溶液，1-2 微升 色素标准溶液，挂于分别盛有 a、b、c、d、e、f 的展开剂的层析缸中，用上行 法展开，待溶剂前沿展至 15cm 处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定 性。 也可取 0.5 毫升样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的右边点色素标准溶 液，依法展开，晾干后先定性后定量，靛蓝在碱性条件下易褪色可用 e 展开剂。 B、薄层色谱 (1)薄层板的制备 称取 1.6 克聚胺粉，0.4 克可溶性淀粉及 2 克硅胶 G，置于合适的研钵中，加 15 毫升水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为 0.3mm 的板。在室温晾干后，于 80℃干燥 1 小时置于燥器中备用。 (2)点样
品(用手摸已干燥即可以)，加入 30 毫升石油醚搅拌，放置片刻，倾出石油醚， 如此重复处理三次，以除去脂肪吹干后研细，全部转人 G3 垂融漏斗或普通漏斗 中，用乙醇—氨溶液提取色素，直至色素全部提完以下按(1)自“置水浴下浓缩 至约 20 毫升”起依法操作。 2、吸附分离 将处理后所得的溶液加热至 70℃，加入 0.5-1.0 克聚酰胺粉充分搅拌，用 20％ 柠檬酸溶液调 PH 至 4，使色素完全被吸附，若溶液还有颜色，可以再加一些聚 酰胺粉。将吸附色素的聚酰胺全部转入 G3 垂融漏斗或玻璃漏斗中过滤(如用 G3 垂融漏斗过滤，可以用水泵慢慢地抽滤)。用 20％柠檬酸酸化 PH＝4 的 70℃水 反复洗涤，每次 20 毫升，边洗边搅拌，若含有天然色素再用甲醇-甲酸溶液洗涤 1-3 次，每次 20 毫升，至洗液无色为止。再用 70℃水多次洗涤至流出的溶液为 中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇-氨溶液分次解吸全部色素，收集 全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至 50 毫升，用分光 光度法进行测定。如果为多种色素混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测 定，即将上述溶液置水浴上浓缩至约 2 毫升后移人 5 毫升容量瓶中，用 50％乙 醇洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。 3、定性 A、纸色谱 取色谱用纸，在距底边 2cm 的起始线上分别点 3-10 微升样品溶液，1-2 微升 色素标准溶液，挂于分别盛有 a、b、c、d、e、f 的展开剂的层析缸中，用上行 法展开，待溶剂前沿展至 15cm 处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定 性。 也可取 0.5 毫升样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的右边点色素标准溶 液，依法展开，晾干后先定性后定量，靛蓝在碱性条件下易褪色可用 e 展开剂。 B、薄层色谱 (1)薄层板的制备 称取 1.6 克聚胺粉，0.4 克可溶性淀粉及 2 克硅胶 G，置于合适的研钵中，加 15 毫升水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为 0.3mm 的板。在室温晾干后，于 80℃干燥 1 小时置于燥器中备用。 (2)点样
离板底边 2cm 处将 0.5 毫升样液从左到右点成与底边平行的条状的右边点 2 微升色素标准溶液。 (3)展开 苋菜红与胭脂红用 d 展开剂，靛蓝与亮蓝用 e 展开剂，柠檬黄与其他色素用 f 展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待色素明显分开后取 出，晾干，与标准斑比较，如比移值相同即为同一色素。 4、定量 A 样品测定 将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入 10 毫升比色管 中，并加水稀释至刻度，作比色法定用。 将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中， 用乙醇-氨溶液解吸色素，少量反复多次至解吸液无色，收集解吸液于蒸发皿中， 于水浴上挥发除去氨，移入 10 毫升比色管中，加水至刻度作比色用。 B、标准曲线制备 分别吸取 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml 胭脂红，柠檬黄，日落黄色素标 准使用液或 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml 亮蓝，靛蓝色素标准溶液，分别置于 10ml 比色管中，各加水稀释至刻度。 上述样品与标准管分别用 1cm 比色杯，以零管调节零点，于一定波长下（胭 脂红 510nm，苋菜红 520nm，柠檬黄 430nm，日落黄 482nm，亮蓝 627nm），测 定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较。 计算： 式中： X：样品中色素的含量，克/千克/升 A：测定用样液中色素的含量，毫克 :m：样品质量（体积），克（毫克） V1：样品解吸后总体积，毫升 V1：样液点板（纸）体积，毫升 X= A*100 V2 m * - *1000 V1
离板底边 2cm 处将 0.5 毫升样液从左到右点成与底边平行的条状的右边点 2 微升色素标准溶液。 (3)展开 苋菜红与胭脂红用 d 展开剂，靛蓝与亮蓝用 e 展开剂，柠檬黄与其他色素用 f 展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待色素明显分开后取 出，晾干，与标准斑比较，如比移值相同即为同一色素。 4、定量 A 样品测定 将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入 10 毫升比色管 中，并加水稀释至刻度，作比色法定用。 将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中， 用乙醇-氨溶液解吸色素，少量反复多次至解吸液无色，收集解吸液于蒸发皿中， 于水浴上挥发除去氨，移入 10 毫升比色管中，加水至刻度作比色用。 B、标准曲线制备 分别吸取 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml 胭脂红，柠檬黄，日落黄色素标 准使用液或 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml 亮蓝，靛蓝色素标准溶液，分别置于 10ml 比色管中，各加水稀释至刻度。 上述样品与标准管分别用 1cm 比色杯，以零管调节零点，于一定波长下（胭 脂红 510nm，苋菜红 520nm，柠檬黄 430nm，日落黄 482nm，亮蓝 627nm），测 定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较。 计算： 式中： X：样品中色素的含量，克/千克/升 A：测定用样液中色素的含量，毫克 :m：样品质量（体积），克（毫克） V1：样品解吸后总体积，毫升 V1：样液点板（纸）体积，毫升 X= A*100 V2 m * - *1000 V1