南开大学案例 RT-PCR为基础的T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析_微生物发酵工程.doc_大学文库

微生物发酵丁程室案树教学 RT-PCR为基础的T-P应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析 Jorge I.Sa'nchez a,Lia Kossetti b,Beatriz Nartr'nez a. Ana Rodr'guez a Giorgio Giraffa b. a Instituto de Productos La'cteos de Asturias (IPLA-CSIC),ctra.Infiesto,s/n 33300 Villaviciosa.Asturias,Spain bIstituto Sperimentale Lattiero Caseario,via A.Lombardo 11.26 Lodi,Italy Received 2 February 2005:received in revised form 21 July 2005;accepted 28 July 2005 Available online 21 September 20 (杨明翻译) 摘要：一种包括T-PCR扩增全部微生物群落的16SrA和T-LP的方法，对于在确定的乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌菌株培莽中半定量的描述新陈代活性数量是最优的，这是两种在奶生产中鞍通常使用的暗温的乳酸菌种。选择好的PCR引物高效地扩增这两个菌种的16SrRN。用DeI消化PCR 产物生产每种南种的不同的末瑞限制性酶切片段(T-Fs)。然而，由于嵌合分子的形成和来源于部分单链 16SrN的扩增子的T-Rs产生的额外的T-s在两个种中都被观察到了，尽管是很少量的。为了免过量CR产物对定量DN产生的饱和效果导致的对总量的低估和尽量减少假片段的出现，0个PCR循环是最佳的。当应用于混合乳品培养时，T-LP分析表现出很好的可重复性。用这种方法和结果研究包括乳酸乳球南乳酸亚种菌株和柠檬明串珠菌菌株的两种混合初始物的动力学，并和用纯培养获得的微对比。这些数据显示了用T-P进行半定量微生物数量分析的适宜性。某些微小的差别可以用菌落计数不能被检测到的新陈代谢活性细胞的出现米解释。以RT-0R为基醋的T-丽P可以作为传统方法之外的另外一种选择，用于研究相对简单的微生物（比如确定乳品起始物的培养物）生态系统的新陈代谢活性的群体动力学。关健词：乳品初始物：RT-PCR:半定量：T-P 1.前言几种奶酪生产中常用的初始培养物通常包括成酸性的乳球南，和一些通常属于乳酸乳球南乳酸亚种丁围链球菌和明串珠菌属某些种的利用柠檬酸益的菌株。这些培养菌对于器官感觉的特征的发展是非常的(Ca'reoba etal.,2000.)。确定的南株的初始物已经被奶酪制造商日益增多地采用，作为一种尝试来解决与未受控制的自然发酵相关的问圈。这对于奶酪的质量有积极的效果。因为整个发醇过程中茵株的平衡是一个关键点，所以需要监控任何对细菌群落结构的暂时影响，这些影响可能改变思得到的奶整的特性的正确过程。(Giraffa,.204 培浆作为一种评价食品中微生物群落多样性和动力学的方法己经有几十年了。以培浆为梵础的方法被

微生物发酵工程案例教学 1 RT-PCR 为基础的 T-RFLP 应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析 Jorge I. Sa´nchez a, Lia Rossetti b, Beatriz Martı´nez a, Ana Rodrı´guez a, Giorgio Giraffa b,* a Instituto de Productos La´cteos de Asturias (IPLA-CSIC), ctra. Infiesto, s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias, Spain b Istituto Sperimentale Lattiero Caseario, via A. Lombardo 11, 26900 Lodi, Italy Received 2 February 2005; received in revised form 21 July 2005; accepted 28 July 2005 Available online 21 September 2005 （杨明翻译）摘要：一种包括 RT-PCR 扩增全部微生物群落的 16S rRNA 和 T-RFLP 的方法，对于在确定的乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌菌株培养中半定量的描述新陈代谢活性数量是最优的，这是两种在奶酪生产中被通常使用的嗜温的乳酸菌种。选择好的 PCR 引物高效地扩增这两个菌种的 16S rRNA。用 DdeI 消化 PCR 产物生产每种菌种的不同的末端限制性酶切片段（T-RFs）。然而，由于嵌合分子的形成和来源于部分单链 16S rRNA 的扩增子的假 T-RFs 产生的额外的 T-RFs 在两个菌种中都被观察到了，尽管是很少量的。为了避免过量 PCR 产物对定量 DNA 产生的饱和效果导致的对总量的低估和尽量减少假片段的出现，20 个 PCR 循环是最佳的。当应用于混合乳品培养时，T-RFLP 分析表现出很好的可重复性。用这种方法和结果研究包括乳酸乳球菌乳酸亚种菌株和柠檬明串珠菌菌株的两种混合初始物的动力学，并和用纯培养获得的做对比。这些数据显示了用 T-RFLP 进行半定量微生物数量分析的适宜性。某些微小的差别可以用菌落计数不能被检测到的新陈代谢活性细胞的出现来解释。以 RT-PCR 为基础的 T-RFLP 可以作为传统方法之外的另外一种选择，用于研究相对简单的微生物（比如确定乳品起始物的培养物）生态系统的新陈代谢活性的群体动力学。关键词：乳品初始物；RT-PCR；半定量；T-RFLP 1．前言几种奶酪生产中常用的初始培养物通常包括成酸性的乳球菌，和一些通常属于乳酸乳球菌乳酸亚种、二丁酮链球菌和明串珠菌属某些种的利用柠檬酸盐的菌株。这些培养菌对于器官感觉的特征的发展是非常重要的（Ca´rcoba et al., 2000.）。确定的菌株的初始物已经被奶酪制造商日益增多地采用，作为一种尝试来解决与未受控制的自然发酵相关的问题。这对于奶酪的质量有积极的效果。因为整个发酵过程中菌株的平衡是一个关键点，所以需要监控任何对细菌群落结构的暂时影响，这些影响可能改变想得到的奶酪的特性的正确过程。（Giraffa, 2004）培养作为一种评价食品中微生物群落多样性和动力学的方法已经有几十年了。以培养为基础的方法被

微生物发酵工程案例教学 2 长期接受并获得普溶成功，但是这些技术费时费力，而且在某些情况下不一定能提供微生物群落组成的可萃信总。未知的和不可培养的种的出现以及样本的混合和稀释步骤会对微生物的生存能力产生影响，能够导致对产品真实生态学组成的失真的观察(F1eet,1999)。而且，在不利条件下，比如营养耗尽、低温和其他压力，某些微生物能进入可生存的但不可培养(C) 的状态。C状态的微生物仍然具有新陈代谢活性但是不能在道常支持它们生长的培养基上形成菌落，因此它们不能被传统的方法发现。为了克服这些问题，免培养法比如变性梯度凝胶电冰/温度梯度凝胶电泳 (GF/TGGE)、单链构象多态性(SSCP)、荧光原位杂交(FTSH),或者以PCR为基础的技术比如长度异质PCR(HPC)和末端限制性片段长度多态性(T-FLP)在过去几年得到发展(Giraffa and Neviani,.2001)。T-LP是一种分析不同细幽的16srA的差异，并提供微生物种群结构信总的方法 (Osb0 rn et al.,2000)。它是以限制性核酸内切酶清化荧光末滨标记的PCR产物为基础的。单独的末端限制性辞切片段(T-s)被电泳分开并由荧光信号亮度量化。依靠微生物群落的物种组成，获得明显的外形(T-F图案)，一种代表一个物种的#在。一个相对定量的分布可以获得，因为每个顶点的荧光密度是和泥合物中每个物种的N量成比例的。然而，PCR的偏差可能对微生物群落真实组成的量化产生消极的影响(Suzuki and Giovannoni,,196:Suzuki et al.,1998)。以DNA为基础的方法的缺点是不能区分活的和死的生物体，因为溶解细胞中的DN能够在自然环境中存在很长时间(Bentsink et al..,2002: o1 ffset al.,20O5),因此，以DA为基础的PCR不能区分生活的、N心C和死细胞，这就限制了它用于监控目的的使用(Sheridanet a.,19s)。在死细胞中比DA降解的快(Van der Vliet et al.,1994),因此，逆转录辞PC8(RT-PCR)可能是生存能力、新陈代谢活力和细胞完整性的一个好的指示器(Bentsink et al.,2002)。这项工作的目的是检验与RT-CR相连系的T一丽P监控确定微生物种样（比如乳品确定菌株的初始物)的新陈代谢活性部分的群体动力学的能力。在这一点上，研究了整个发酵过程中两种确定菌株的初始物的成分的演变。为了碱少的偏差，这种方法被最优化并且检验了它的可重复性。 2.材料与方法 2.1细南南株和生长条件本研究中使用的细菌菌株包括从人工奶酪中分离的两株柠檬明串珠菌菌株(1PLA621和IPLA1687) 和一株酸乳球茵乳酸亚种南株(IPLA947)(Cuesta e-a tl.,1996)。明串珠南属在Ms肉i汤(Biokar,Beauvais,France)和乳球菌在M17(Scharlau Chenie,.Bareon,Spain)中被常栽地紧殖。 2,2确定南株初始物培养两种确定菌株初始物培养物在10%(w1,01)复配脱脂乳(RS)中准备：培养物A包括乳酸乳球菌乳

微生物发酵工程案例教学 2 长期接受并获得普遍成功，但是这些技术费时费力，而且在某些情况下不一定能提供微生物群落组成的可靠信息。未知的和不可培养的种的出现以及样本的混合和稀释步骤会对微生物的生存能力产生影响，能够导致对产品真实生态学组成的失真的观察（Fleet，1999）。而且，在不利条件下，比如营养耗尽、低温和其他压力，某些微生物能进入可生存的但不可培养（VNC）的状态。VNC 状态的微生物仍然具有新陈代谢活性但是不能在通常支持它们生长的培养基上形成菌落，因此它们不能被传统的方法发现。为了克服这些问题，免培养法比如变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）、单链构象多态性（SSCP）、荧光原位杂交（FISH），或者以 PCR 为基础的技术比如长度异质 PCR（LH-PCR）和末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）在过去几年得到发展（Giraffa and Neviani,2001）。T-RFLP 是一种分析不同细菌的16s rRNA 的差异，并提供微生物种群结构信息的方法（Osborn et al.,2000）。它是以限制性核酸内切酶消化荧光末端标记的PCR产物为基础的。单独的末端限制性酶切片段（T-RFs）被电泳分开并由荧光信号亮度量化。依靠微生物群落的物种组成，获得明显的外形（T-RF图案），一种代表一个物种的存在。一个相对定量的分布可以获得，因为每个顶点的荧光密度是和混合物中每个物种的 DNA 量成比例的。然而，PCR 的偏差可能对微生物群落真实组成的量化产生消极的影响（Suzuki and Giovannoni, 1996; Suzuki et al.,1998）。以 DNA 为基础的方法的缺点是不能区分活的和死的生物体，因为溶解细胞中的 DNA能够在自然环境中存在很长时间（Bentsink et al.,2002; Wolffset al.,2005）。因此，以 DNA 为基础的 PCR 不能区分生活的、VNC 和死细胞，这就限制了它用于监控目的的使用（Sheridanet al.,1998）。在死细胞中 RNA 比 DNA 降解的快（Van der Vliet et al.,1994），因此，逆转录酶 PCR（RT-PCR）可能是生存能力、新陈代谢活力和细胞完整性的一个好的指示器（Bentsink et al.,2002）。这项工作的目的是检验与 RT-PCR 相连系的 T-RFLP 监控确定微生物种群（比如乳品确定菌株的初始物）的新陈代谢活性部分的群体动力学的能力。在这一点上，研究了整个发酵过程中两种确定菌株的初始物的成分的演变。为了减少 PCR 的偏差，这种方法被最优化并且检验了它的可重复性。 2．材料与方法 2.1 细菌菌株和生长条件本研究中使用的细菌菌株包括从人工奶酪中分离的两株柠檬明串珠菌菌株（IPLA621 和 IPLA1687）和一株乳酸乳球菌乳酸亚种菌株（IPLA947）（Cuesta e= q t al.,1996）。明串珠菌属在 MRS 肉汤（Biokar, Beauvais, France）和乳球菌在 M17（Scharlau Chemie, Barcelona, Spain）中被常规地繁殖。 2.2 确定菌株初始物培养两种确定菌株初始物培养物在10%（wt/vol）复配脱脂乳（RSM）中准备；培养物A包括乳酸乳球菌乳

微生物发醇工程案例教学酸亚种1风97和柠檬明串珠菌ILA621,培养物B包括乳酸乳球国乳酸亚种1PA97和柠檬明串珠闺 1P刊1687，前一夜的肉汤培养物在乳中1%被转接，给与起始的种群比率。大约是3：1.3，分别为乳球菌和明串味菌。培养物在30℃培养，并于0,3,6,9和24小时取样。 23微生物分析 10倍稀释法在四分之一浓度套环溶液被使用，在含有万古看素(30g-1)的5琅脂和为明申珠菌准备的能糖(2器t/￥o】)或者为乳球离准备的加入环己米特的17琼脂中进行透择性计数.平板在30℃ 培养48小时， 24NA提取在5或者I7培养基上生长的纯培养物的NA用如前文描述的基于ce]ex的程序进行提取。分离的NA在使用前在-20℃温度下保存， 25从培养物中提取N侧用91DTA(1%t/yol,H12)预处理从乳培养物得到的11样品，使覆国的留蛋白分散以利于细胞的分离.样品在8000×g离心5分钟，然后用TE buffer瓷两次.。沉淀物在含有1ys0zie(2Dg■l-1) 的100■1的TES中重瑟，然后37℃培养30分钟。提取N使用Tr1xol公可的试剂(1r1tr0emSK,L, i1no,Italy),拔愿厂家提供的说明书进行授作，沉淀物在50#1用DEPC处理的水中重悬，污索NM清化在U的plification Grade DN南I(Sig国Aldrich,Milano,Italy)在厂家给定的条件下，XA 的量和纯度用20和280n的光密度确定(S4ar0 ok et al,1989)。提取的RNA在使用前保存在-90℃， 2.6引物遗择扩增16SrXA可变区的A减的基因。使用荧光标记的正向引物63F(5-[6FA]CAG GCC TA4 CAC ATG CAA GTC-3V)(Marchesi et al.,1Sg8)和未标记的反向引物355球(5-GCTG0CTCC0可TA0GGT-3Y) (Suzuki et al.,1998).. 2.7 RT-PCR 使用Gene Amp立rTth RNA PCR试剂盒(Applera Italia,ona,Italy),按题厂家的明进行一步CR.反应在终容量为5u】的体系中进行，包括5u1的5×☑b如ffr,3μ1的dNTP混合液（每种NTP 浓度10aW),2.5u1的l临(0e)2溶液，每种引物溶液1.251(10uM).1u1的rTth聚合酶(2.5 Uμ1-l:Applera Italia》和2.5u1的模板（稀释到O0gμ1-）。反应在Perkin Elner thermal cycler(od.9700:Applera Italia)中进行，反应条件为：60℃初始变性步靠于91℃1min,接下米进行循环。箭环数由样品决定(10,20.30成者40)，着环条件为94℃15s(变性).49℃30s(退火). T2℃30s(延伸)。最后一岁72℃7i。为了检查然A提取物中可能存在的D污染，按盟上述方法使用A提取物作为核板进行对照反应

微生物发酵工程案例教学 3 酸亚种IPLA947 和柠檬明串珠菌IPLA621，培养物B包括乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947 和柠檬明串珠菌 IPLA1687。前一夜的肉汤培养物在乳中 1% 被转接，给与起始的种群比率，大约是3∶1.3，分别为乳球菌和明串珠菌。培养物在30℃培养，并于0，3，6，9和24小时取样。 2.3 微生物分析 10倍稀释法在四分之一浓度套环溶液被使用，在含有万古霉素（30 mg ml-1）的 MRS 琼脂和为明串珠菌准备的蔗糖（2% wt/vol）或者为乳球菌准备的加入环己米特的M17琼脂中进行选择性计数。平板在30℃ 培养48小时。 2.4 DNA提取在 MRS 或者 M17 培养基上生长的纯培养物的 DNA 用如前文描述的基于chelex的程序进行提取。分离的 DNA 在使用前在-20℃温度下保存。 2.5 从培养物中提取 RNA 用9ml EDTA（1% wt/vol, pH 12）预处理从乳培养物得到的1ml样品，使凝固的酪蛋白分散以利于细胞的分离。样品在8000×g离心5分钟，然后用TE buffer洗两次。沉淀物在含有lysozime（20 mg ml -1）的100μl的 TES 中重悬，然后37℃培养30分钟。提取 RNA 使用Trizol公司的试剂（Invitrogen S.r.L., Milano, Italy），按照厂家提供的说明书进行操作。沉淀物在50μl用 DEPC处理的水中重悬，污染 DNA 消化在 5U 的 Amplification Grade DNA酶I（Sigma Aldrich, Milano, Italy）在厂家给定的条件下。RNA 的量和纯度用260和280nm的光密度确定（Sambrook et al., 1989）。提取的RNA在使用前保存在-80℃。 2.6 引物选择扩增16S rRNA 可变区的A域的基因，使用荧光标记的正向引物63F（5V-[6FAM] CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3V）（Marchesi et al., 1998）和未标记的反向引物355R （5V-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3V）（Suzuki et al., 1998）。. 2.7 RT-PCR 使用 Gene Amp EZ rTth RNA PCR 试剂盒（Applera Italia, Monza, Italy），按照厂家的说明进行一步 PCR。反应在终容量为25μl 的体系中进行，包括5μl的5×EZ buffer，3μl的 dNTP混合液（每种 dNTP 浓度10mM），2.5μl的mM Mn （OAc）2溶液，每种引物溶液1.25μl（10μM），1μl的 rTth DNA 聚合酶（2.5 U μl-1；Applera Italia）和 2.5 μl 的 RNA 模板（稀释到100 ngμl-1）。反应在 Perkin Elmer thermal cycler （mod. 9700;Applera Italia）中进行，反应条件为：60℃初始变性步骤于94℃ 1min，接下来进行循环，循环数由样品决定（10，20，30或者40）。循环条件为：94℃ 15s（变性），49℃ 30s（退火）， 72℃ 30s（延伸）。最后一步72℃ 7min。为了检查 RNA 提取物中可能存在的 DNA 污染，按照上述方法使用RNA提取物作为模板进行对照反应

管生物发酵工程案例教学 2.8 PCR 扩增提取的体A和对盟CR在终体积为20u1的体系中进行，其中含有2μ1的10×Co1 d buffer (Applera Italia》,1,6μ1的dNTP混合液（每种dP法度25M),1,2μ1的MC12(2aM),每种引物的溶液1u1(10=M),Q.1μ1的pliTaq Gold路A聚合酶(Applera Italia)和1u1的NA样品 (或者对照反应的1).反应条件为，95℃10■i:25个循环96℃40s,9℃45s,72℃2ain:最后一步72℃7a1n. 29限制性核酸内切南的选释乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌(GenBank的偏号分别为AFI1198ndB118036)的16sr然A基因序'列，用Sequence Nav1 gator software(version1.01,Appl1 ed Biosystems,,Foster City,CA) 透行件序。为了选择限制，用一种核苷序列限制位点困在线载件ebcutter20(网络地址为： http://.first国rket.cca/cutter/cut2.htnl)进行分析.酶切反应使用l0U限制酶DdeI(Neg England Biolabs,.Beverly,,SA),在0μ1体系中进行1，h,按厂家的建议的条件进行 210-舒1P分析扩增产物的变性和电冰按属全面描述的方法进行(L2 zi et a1.,004)。电泳结果在非变性条件下用BI Prisn310基因分析仪(Applied Biosystens)进行分析，T-P结果使用Genescan软件 (version3.,1:Applied Biosystems)进行分析， (叶度波翻译) 3.轴果检查所透引物可行性以及CR产物的大小的预试险用提取于纯培养物的加NA。从每个菌落利用引物扩增真细菌rNA的A区域，PCR产物长319±1bp,为乳酸乳球商乳酸亚种(A2z10tal,2004),和长318±1 即的柠檬明串殊菌（数据未最示）。因为两者CR产物的大小差异很小，以致无法精确辨别这些种，样品用 DdeI消化产生一种特殊的标记了的T-即。依照在线的限制分析，当以DeI(图1)消化的时候，每个种有一个独特的式样，实验数据通过s1110分析被确认，乳酸乳球菌表现为一个259±1bp的峰，柠檬明串味蘭的为141±1bp(数据未暴示)。这些数据证明了引物以及桃选的限制酶可以用来确认两个种的陵力.相同的消化也用于TP分析扩增的惑A

微生物发酵工程案例教学 4 2.8 PCR 扩增提取的 DNA 和对照 PCR 在终体积为 20μl 的体系中进行，其中含有 2μl 的10×Gold buffer （Applera Italia），1.6μl 的 dNTP 混合液（每种 dNTP 浓度2.5mM），1.2μl的 MgCl2（25mM），每种引物的溶液1μl（10μM），0.1μl的 AmpliTaq Gold DNA 聚合酶（Applera Italia）和1μl的 DNA 样品（或者对照反应的RNA）。反应条件为，95℃ 10min；25个循环 95℃ 40s，49℃ 45s，72℃ 2min；最后一步72℃ 7min。 2.9 限制性核酸内切酶的选择乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌（GenBank的编号分别为 AF111948 and AB118036）的16s rRNA 基因序列，用Sequence Navigator software （version 1.0.1,Applied Biosystems, Foster City, CA）进行排序。为了选择限制酶，用一种核苷序列限制位点图在线软件Webcutter 2.0（网络地址为： http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html）进行分析。酶切反应使用 10 U 限制酶 DdeI （New England Biolabs,Beverly, MA, USA），在20μl 体系中进行1.5h，按照厂家的建议的条件进行。 2.10 T-RFLP分析扩增产物的变性和电泳按照全面描述的方法进行（Lazzi et al., 2004）。电泳结果在非变性条件下用 ABI Prism 310 基因分析仪（Applied Biosystems）进行分析，T-RFLP 结果使用Genescan 软件（version3.1; Applied Biosystems）进行分析。（叶彦波翻译） 3. 结果检查所选引物可行性以及PCR产物的大小的预试验用提取于纯培养物的DNA。从每个菌落利用引物扩增真细菌rDNA的A区域，PCR产物长319±1 bp，为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lazzi et al.,2004），和长318 ±1 bp的柠檬明串珠菌（数据未显示）。因为两者PCR产物的大小差异很小，以致无法精确辨别这些种，样品用 DdeI 消化产生一种特殊的标记了的T-RF。依照在线的限制分析，当以 DdeI（图 1）消化的时候，每个种有一个独特的式样。实验数据通过 silico 分析被确认，乳酸乳球菌表现为一个259 ± 1bp的峰，柠檬明串珠菌的为 141 ±1 bp （数据未显示）。这些数据证明了引物以及挑选的限制酶可以用来确认两个种的能力。相同的消化也用于T- RFLP 分析扩增的rRNA

徵生物发醇工程案例教学 0 Base pairs 319 259 287 5 3 L.lactis ssp.lactis 141 287 5 Ln.citreum 图1.在线限制分析确认的乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌的DI的限制位点，乳酸乳球菌乳酸重种和柠檬明串珠商的PCR产物以引物63F和355R扩增。 3.1来自牛奶培界物的A提取和T-PC累从牛奶培养物被提取A,T-C家用于检测提取方法和T-PC深的适合条件。对于第一种尝试，扩增反应设置了40个循环。一条大约319p的带在所有样品中都可以看到（图2，上胶板），确认预期片段的扩增。负对照缺少扩增带确认了没有A污染发生。（图2A,下胶板）。 T~CR的产物利用D】酶切消化并利用毛细管电泳分离产生的片新。单独的乳酸乳球商牛奶培养物的T-CR产物酶切电冰图在图2B中显示。次级峰(279士1,287士1,299士1和319土1bp) 连同59±1p的预期峰同样核发现，尽管沫度相对较低。这些额外的峰对应的是额外的扩增子，因为当同样的样品不经消化盥毛细管电袜时也被观察到（见图2C)。在这种情况下，除了319±1bp片断外，对位于339±1,359±1,379±1和397±1bp片段的另外的峰也被发现。这些非预期的产物可能是由于幸特异性的引物是火或者是由累时基因组中165的不月将贝的重结合造成的，不同的产物恰好可以反肤16SrNA的序列特异性(ang and Wang,1997):De酶切消化在所有片段的3”端产生了一个60b邮（事实上是28和32bp的二个片断，因为限制位点在287p)的非标记片断（图2D),显示序列特异性更靠近5”隋。缺失这一个606即片断可以解释产物消化后观察到的五个峰中四个的出现，也就是259±1（主要产物），279士1,299±】和319士1bp:对应于397土1bp 的峰在技清化的样品中没有出现，成许因为在消化期间的稀释使它的浓度太低未被发现。被消化的样品（图 2B)中的287士1的峰与假终端限制片断的形成相关（假的T-好s)。这些假片断在3期间因为部分单

微生物发酵工程案例教学 5 图 1.在线限制分析确认的乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌的DdeI的限制位点，乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌的PCR产物以引物63F和355R扩增。 3.1 来自牛奶培养物的RNA提取和RT-PCR 从牛奶培养物被提取RNA，RT-PCR用于检测提取方法和RT- PCR 的适合条件。对于第一种尝试，扩增反应设置了40个循环。一条大约319 bp 的带在所有样品中都可以看到（图 2A，上胶板），确认预期片段的扩增。负对照缺少扩增带确认了没有DNA污染发生。（图 2A，下胶板）。 RT- PCR的产物利用Dde I 酶切消化并利用毛细管电泳分离产生的片断。单独的乳酸乳球菌牛奶培养物的RT- PCR产物酶切电泳图在图2 B 中显示。次级峰（279 ±1，287 ±1，299 ± 1和 319 ±1 bp）连同 259 ±1 bp 的预期峰同样被发现，尽管浓度相对较低。这些额外的峰对应的是额外的扩增子，因为当同样的样品不经消化跑毛细管电泳时也被观察到（见图2 C）。在这种情况下，除了319 ±1 bp 片断外，对应于339 ±1，359 ± 1，379 ± 1和 397 ±1 bp 片段的另外的峰也被发现。这些非预期的产物可能是由于非特异性的引物退火或者是由PCR时基因组中16S rRNA的不同拷贝的重结合造成的，不同的产物恰好可以反映16S rRNA的序列特异性（Wang and Wang，1997）。DdeI 酶切消化在所有片段的3’端产生了一个60 bp（事实上是 28 和32 bp的二个片断，因为限制位点在287 bp）的非标记片断（图 2 D），显示序列特异性更靠近5’端。缺失这一个60bp片断可以解释产物消化后观察到的五个峰中四个的出现，也就是259 ±1（主要产物），279 ± 1，299 ±1 和 319 ±1 bp。对应于397 ±1 bp 的峰在被消化的样品中没有出现，或许因为在消化期间的稀释使它的浓度太低未被发现。被消化的样品（图 2 B）中的287 ±1 bp的峰与假终端限制片断的形成相关（假的T-RFs）。这些假片断在PCR期间因为部分单

微生物发醇工程案例教学 9 的T-版(287±1b邮》的峰面积。所有峰三个样品之间的标准差在%以下。同样地，峰面积与乳酸乳球菌以柠檬明串珠菌的即之阿的比的标准差为4.多，指示在单一样品里两个菌株相对定量的重复性很好。 (陈忠良) A.4应用T-R可P蓝测初始培养物的群体动力学为了测定-℉P监测群体动力学的能力，在牛奶培养物中培养的样品同时利用商落计数以及发酵过程中的T-P的分析，然后对结果进行比较。化验包含两种确定的菌落的起给物，乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明伟殊菌。图最示发醇中两培养物的进化。培养物A中两者表现为相似的行为，9到达静止期。可培养细围数直到潜优期结柬保持不变。在培养物B中，可以在9h之后观黎到柠檬明串珠菌41687的可培养细胞数的减少，可能是按酸和/或其能的压力条件引起。乳腹乳球商P刊A947的生长看起米并没有因IP21或I刊A1687的出现面改变。平行的，-R扩增片段的T-P分析也核进行。相应每个阿株T-F的峰面积核测量，为了对新陈代谢活性群体进行半定量分析，它们之闻的比率也被计算出米。在培养物中，T-FP分析与发酵时期菌落计数相比菌落I刊A947和IP621的相对比例的波动更大。然商，IPA947(753器和75.1%)和IPL621 (24.和24.9%)T-P和商落计数的平均菌体总数，分别地，在发醇的是初9h是相叙的，24h后两种技术的望异则会相当明显，通过定量T-阿P计算得来的947的比例比通过菌落计数得米的数据大。这表明部分细胞仍具有新陈代谢活力，但是处于VC状态，因此，不能通过接菌发现。另一方面，培养物的群体动力学用两种技术最示出相似的结果（图5B,5D)。A94?的相对总数随着发酵过程逐渐增加。特别是6励以后当1PA1687的可培养总数明最的诚少时，两个技术之间的最大不同在24再次被发现。如上讨论。VNC细胞的出现，在IPLA1687的情形下，可以解释经由以RT-CR为甚础的T-P观察得来的较高比例

微生物发酵工程案例教学 9 的T-RF（287 ±1bp）的峰面积。所有峰三个样品之间的标准差在 7% 以下。同样地，峰面积与乳酸乳球菌以柠檬明串珠菌的T-RF之间的比的标准差为4.1%，指示在单一样品里两个菌株相对定量的重复性很好。（陈忠良） 3.4 应用T- RFLP监测初始培养物的群体动力学为了测定T-RFLP监测群体动力学的能力，在牛奶培养物中培养的样品同时利用菌落计数以及发酵过程中的T-RFLP的分析，然后对结果进行比较。化验包含两种确定的菌落的起始物，乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌。图4显示发酵中两培养物的进化。培养物A中两者表现为相似的行为，9 h到达静止期。可培养细胞数直到潜伏期结束保持不变。在培养物B中，可以在9 h之后观察到柠檬明串珠菌IPLA1687的可培养细胞数的减少，可能是被酸和/或其他的压力条件引起。乳酸乳球菌IPLA947的生长看起来并没有因 IPLA621或IPLA1687的出现而改变。平行的，RT-PCR扩增片段的T-RFLP分析也被进行。相应每个菌株T-RF的峰面积被测量，为了对新陈代谢活性群体进行半定量分析，它们之间的比率也被计算出来。在培养物A中，T- RFLP分析与发酵时期菌落计数相比菌落IPLA947 和IPLA621 的相对比例的波动更大。然而，IPLA947（75.3% 和 75.1%）和IPLA621 （24.7%和24.9%）T-RFLP和菌落计数的平均菌体总数，分别地，在发酵的最初9 h是相似的。24h后两种技术的差异则会相当明显。通过定量T- RFLP计算得来的 IPLA947 的比例比通过菌落计数得来的数据大。这表明部分细胞仍具有新陈代谢活力，但是处于 VNC 状态，因此，不能通过接菌发现。另一方面，培养物B的群体动力学用两种技术显示出相似的结果（图5 B，5 D）。IPLA947 的相对总数随着发酵过程逐渐增加，特别是6h以后当IPLA1687的可培养总数明显的减少时。两个技术之间的最大不同在24 h再次被发现。如上讨论，VNC细胞的出现, 在IPLA1687的情形下，可以解释经由以 RT- PCR为基础的T-RFLP观察得来的较高比例

南开大学 案例 RT-PCR为基础的T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析_微生物发酵工程

南开大学案例 RT-PCR为基础的T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析_微生物发酵工程