微生物发酵工程案例教学 通过Yanthomonas campetris利用HOC1自由基介导提高黄原胶量 及其机制研究 Y.Man juln Rao,G.K.Sureshkumar Biochenical Engineering Group,Department of Chemical Engineering. Indian Institute of Technology,Boobay,Porai,Mubai 400 076.India: te1 ephone:91-22-576-T208:fax:91-22-572-3480:E-i1: gksuresheche.iitb,ernet.in Received 6 September 1999:accepted 29 June 2000 (周鑫因译) 精要：自由基介导已经被利用在生物反应生产中，特别是在ata哪s campestr生产黄原胶的 产量和品质提高中体现的尤为突出，KC1(氧化剂)处理带米了产量增长21作，产物数度（品质）提高2八： 另外，耀酸在产物中的质量比下降了2%，内制酸的质量比增加了63%，生长率几乎未C1处理的影响， 解释自由基介导的高产黄皋胶的机制的假设也己提出。S0S蛋白与基因的启动子结合提高XA的转求 水平是这个假说的重要内容，并且得到了实验证实，o2001 John Wiley&Sons,1nc.Biotechno】Bioeng 72:62-68,2001 关键词：自由基：适成反应：anthowonas capestri:SouS-路A结合：黄原胶 1,简介 白由基可以用来调节一生重要的细图周期，如细图两亡和癌变(Feig and Loe地，1994：Feig et al., 1994:0 kuno et al.,199B:Reid and L0e中，1993)。并且，自由基也通常被认为在温度、渗透压和营养 水平起到了博节子的作用(garathnarma et al.,1997:0 sbourn et al..,1990),这些也是生物反应 墨中的重要环境参数。因此，自由基可以被认为在决定生物反应产量中有重要的角色。 氧白由基和氧分压是植物抵抗如酸sCst这种植物病原微生物入侵的重要因子。黄原 校是由thooonas campestrist在入授时分瓷的，并且这种黏液（黄原胶液）的分瓷程度与政病性直接相 关(Thorene et8l.,1987:e1s8etal.,1994)。从工业角度看，anthowonas campestris用米生产 有商业价值的黄原敢，可以广泛利用于食品、医药，石油等其他行业(L心，19的6》。如果白由基介导和黄 原胶产量的关系可以澜明，就可以用来大大促进黄原取的产量。并且，更深入的研究有利于改进通过培养 过氧化氢酶分解过氧化氢实现原位债氧的培养方法(S1 ram et al.,199网)。 我们通过加入白由基和研究南体生长和黄原胶生产的反应，来调查自由基对生物反应器的反应影响。 目的在于促进黄原胶产量。自由基促进生物反应产量没有在文献中报道过。此外，这种方法可以很蔺单的 2001 John Wey Sons,Inc
微生物发酵工程案例教学 1 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 1 通过 Xanthomonas campetris 利用 HOCl 自由基介导提高黄原胶量 及其机制研究 Y. Manjula Rao, G. K. Sureshkumar Biochemical Engineering Group, Department of Chemical Engineering. Indian Institute of Technology, Bombay, Powai, Mumbai 400 076, India; telephone: 91-22-576-7208; fax: 91-22-572-3480; E-mail: gksuresh@che.iitb.ernet.in Received 6 September 1999; accepted 29 June 2000 （周鑫翻译） 摘 要：自由基介导已经被利用在生物反应生产中，特别是在Xanthomonas campestris生产黄原胶的 产量和品质提高中体现的尤为突出。HOCl（氧化剂）处理带来了产量增长210%，产物黏度（品质）提高20%。 另外，醋酸在产物中的质量比下降了42%，丙酮酸的质量比增加了63%。生长率几乎未受HOCl处理的影响。 解释自由基介导的高产黄原胶的机制的假设也已提出。SoxS蛋白与gum基因的启动子结合提高mRNA的转录 水平是这个假说的重要内容，并且得到了实验证实。© 2001 John Wiley & Sons, Inc. Biotechnol Bioeng 72: 62–68, 2001 关键词：自由基；适应反应；Xanthomonas campestris；SoxS-DNA结合；黄原胶 1. 简介 自由基可以用来调节一些重要的细胞周期，如细胞凋亡和癌变（Feig and Loeb, 1994; Feig et al., 1994; Okuno et al., 1998; Reid and Loeb,1993）。并且，自由基也通常被认为在温度、渗透压和营养 水平起到了调节子的作用（Nagarathnamma et al., 1997; Osbourn et al., 1990），这些也是生物反应 器中的重要环境参数。因此，自由基可以被认为在决定生物反应产量中有重要的角色。 氧自由基和氧分压是植物抵抗如Xanthomonas campestris这种植物病原微生物入侵的重要因子。黄原 胶是由Xanthomonas campestris在入侵时分泌的，并且这种粘液（黄原胶液）的分泌程度与致病性直接相 关（Thorene et al., 1987; Weiss et al., 1994）。从工业角度看，Xanthomonas campestris用来生产 有商业价值的黄原胶，可以广泛利用于食品、医药、石油等其他行业（Lee, 1996）。如果自由基介导和黄 原胶产量的关系可以阐明，就可以用来大大促进黄原胶的产量。并且，更深入的研究有利于改进通过培养 过氧化氢酶分解过氧化氢实现原位供氧的培养方法（Sriram et al., 1998）。 我们通过加入自由基和研究菌体生长和黄原胶生产的反应，来调查自由基对生物反应器的反应影响。 目的在于促进黄原胶产量。自由基促进生物反应产量没有在文献中报道过。此外，这种方法可以很简单的
微生物发醇工程案例授学 应用到工业生产中，只不过就是在接种到种子培养瓶之前处理若干小时。 在这次研究中，我们]通过一种自由基形成剂《活性氧类，6)次氯酸(HOC1)进行胞外处理来实现 氧化条件。就生长和黄原胶生产反面而言，对这种白由基产生剂的适应性反应（如面之产生的应答）己经 被研究。同时，也授出了关于自由基刻微黄原敢过量生产的一种遵传学假说。假说中关于50x5蛋白（一种 自由基介导的调节蛋白)N结合和高X转录己经由实险证明，特异性的甲基化研究表明，SQxS问雪 基因启动子区城特定的GCAY序列结合。S0S蛋白引起的由于基因的转柔活性增加了的NA也被证明。 2.材料与方法 2.1培养物和其它符殊株 实验用微生物为生产黄原胶的anthomonas caapestris(TCC2286,IWTE用，Chandigarh,Inda). 黄种保存在4℃，含有20g/L葡萄糖、10g/酵母浸出物、10e/LCa003和20g/L琼胎的斜面上。生长培养基 含有40z/L.葡萄糖，3z/L解母浸出物，5g/LK册0，Q.6g/LMS0,·7H0和0.4g/L.尿素，用自米水溶解（提 供痕量元素，培养基接种前不加入笔萄糖进行高压蒸汽灭菌)。 Escherichia coliXA90(K-l2),用来表达soxS蛋白(Li and Deaple,.1S的)和Sox5的抗体，由ProL, Derple(Harvard School of Public Health,lSA)惠赠.SoxS缺失突变(Dukan and Touati,.l996)的 Ecai由法国Jacques Monod Institutel的Prof.Touati提供。携带有完整的.anthosonas c写estrist的 gs基因片段的质粒pl15-251(Katzen et al..,1996)由University of Argentinaf的Prof,lelpil惠赠。 2.2分析方法、试剂和仪暑 细胞末度可以通过分光光度计测量(Jsc0 Japan》650m处吸光值，利用细围浓度对光密度标准曲 线标定。利用放大镜计数平板上的商落数目。黄原胶浓度的测量可以通过10000x离心45ai,然后乙醇阀 淀分离。测量其干重(Gar心la0 hoa et al.,1993)。提取出的黄源胶溶解在去离子水中，利用数字度 计(Coatraves1 ow shear30)在37℃和8s'的剪切力下测量0.2g/L黄原胶溶液黏度（不是培养液黏度）， 乙酸和丙酮酸的测定依照B1 unerkrantz和nsen(l973)以及enned和5 utherland(1987)的方法.M 表达量可以在乙醇沉淀和饱化除去不反位的核糖后用分光光度计计量(Sadas1 van and Manickan199:和 e48l.,1985)。 核糖核苷酸和其他的标准化学物质从S,Indial购买。次氯酸从次氧酸的定量合成(S风，India)并 仅仅使用新配制的次氯酸，自能标记物前体，2,6一二甲基-戴呢刚从德国F1 uka Che©nls公可购买。寡 核皆酸由印度Genet i购买。 使用的生物反应器是2L搅拌罐(1L.工作体积)带有两个ushton祸轮机叶轮和转速、温度控制装置。 在空气流速为3/鱼in和叶轮00rp转速下，利川动态响应(dynamic response)测定的容积氧传递套数(M.a) 为32.5站'.溶氧和p的数据由一台电脑上的数据获得控制系统(SCR Elektroniks,India)通过探头(Bela 2001 John Wey Sons.Ine 2
微生物发酵工程案例教学 2 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 2 应用到工业生产中，只不过就是在接种到种子培养瓶之前处理若干小时。 在这次研究中，我们通过一种自由基形成剂（活性氧类，ROS）次氯酸（HOCl）进行胞外处理来实现 氧化条件。就生长和黄原胶生产反面而言，对这种自由基产生剂的适应性反应（如随之产生的应答）已经 被研究。同时，也提出了关于自由基刺激黄原胶过量生产的一种遗传学假说。假说中关于SoxS蛋白（一种 自由基介导的调节蛋白）同DNA结合和高mRNA转录已经由实验证明。特异性的甲基化研究表明，SoxS同gumB 基因启动子区域特定的GCAY序列结合。SoxS蛋白引起的由于gum基因的转录活性增加了的mRNA也被证明。 2. 材料与方法 2.1 培养物和其它特殊菌株 实验用微生物为生产黄原胶的Xanthomonas campestris（MTCC 2286，IMTECH，Chandigarh，India）。 菌种保存在4℃，含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母浸出物、10g/L CaCO3和20g/L琼脂的斜面上。生长培养基 含有40g/L葡萄糖，3g/L酵母浸出物，5g/L K2HPO4，0.6g/L MgSO4·7H2O和0.4g/L尿素，用自来水溶解（提 供痕量元素；培养基接种前不加入葡萄糖进行高压蒸汽灭菌）。 Escherichia coli XA 90（K-12），用来表达SoxS蛋白（Li and Demple，1994）和SoxS的抗体，由Prof. Demple（Harvard School of Public Health，USA）惠赠。SoxS缺失突变（Dukan and Touati, 1996）的 E.coli由法国Jacques Monod Institute的Prof. Touati提供。携带有完整的Xanthomonas campestris的 gum基因片段的质粒pIZD15-261（Katzen et al., 1996）由University of Argentina的Prof. Ielpi惠赠。 2.2 分析方法、试剂和仪器 细胞浓度可以通过分光光度计测量（Jasco, Japan）650nm处吸光值，利用细胞浓度对光密度标准曲 线标定。利用放大镜计数平板上的菌落数目。黄原胶浓度的测量可以通过10000g离心45min，然后乙醇沉 淀分离，测量其干重（Garcia-Ochoa et al., 1993）。提取出的黄原胶溶解在去离子水中，利用数字黏度 计（Contraves low shear 30）在37℃和8s-1的剪切力下测量0.2g/L黄原胶溶液黏度（不是培养液黏度）。 乙酸和丙酮酸的测定依照Blumerkrantz和Hansen（1973）以及Kennedy和Sutherland（1987）的方法。mRNA 表达量可以在乙醇沉淀和纯化除去不反应的核糖后用分光光度计计量（Sadasivam and Manickam,1996; Wu et al., 1995）。 核糖核苷酸和其他的标准化学物质从SRL, India购买。次氯酸从次氯酸钠定量合成（SRL, India）并 仅仅使用新配制的次氯酸。自旋标记物前体，2,6-二甲基-4-哌啶酮从德国Fluka Chemicals公司购买。寡 核苷酸由印度Genetix购买。 使用的生物反应器是2L搅拌罐（1L工作体积）带有两个Rushton涡轮机叶轮和转速、温度控制装置。 在空气流速为3L/min和叶轮300rpm转速下，利用动态响应（dynamic response）测定的容积氧传递系数（KLa） 为32.5h-1。溶氧和pH的数据由一台电脑上的数据获得控制系统（SCR Elektroniks, India）通过探头（Bela
微生物发醇工程案例教学 Instruments,.1ndia)实时获得。一个电子蒙转共叛(ES球)分光光度计用来获阁EsR光语. 2.3处理过程 简要的说，0C1对层c处理在利用。然而，C1浓度和菌体生长阶段难以界定。在必需的生长阶段 时，细胞沫度达到2/八L。是浮于0.0训的磷酸缓冲液分装到几个2L摇商瓶中。瓶在使用前，用硫硫酸等 彻底清洗。新配置的次氯酸，浓度用确滴定法标定，在三个阶爱方法如入到培养基中。每个阶段包括60s 的HCC1处理细胞，离心分离细胞，再用普通生长培养基30℃暗处温和装荡培养40分钟，三个阶段最初用CC1 处理步骤的使用浓度分别为：0,66ol/gce11(阶段I》,4.653l/gcol1(阶段II),20mol/gce11 (阶段111)，在第三次培养后，留在瓶中的白由氯可用无南硫代硫限钠除尽。培养的菌种用B踪脂平版 分析，在培养十小时后计数。 2.4婚养研究 话菌分离后用前面提到的生长培养暴，在℃摇床中震等培养。生长实验用1L生物反空器30℃下进行。 2.5DNA-蛋自质相互作用研究 2.5.1蛋白分离 从细围培养物中米进行SoxS蛋白分离的方法是L1和即le提出的(1994)， 2.5.2自旋标记的S06蛋白合成 顺碱性标签2,266-四乙基曦呢解1-氧基，由2,6-二甲基-4-戴院刚通过0催化氧化，并标记S0xS 蛋白。过程由agner和sU《196的)是供的自能标签准备和蛋白标记，不同的是。H保转在6，防止SoS不 反应并且正确形成希夫碱。 2.5.3客豪核甘酸合成 同包含有Sx5交感序列和对应的甲基化序列（见结果与讨论）的基因启动子区域类似的赛聚核苷 酸，由前面提到的供方获得合成， 2,5.4电子自旋共振(SR)粒测光谱测定S0x5一寡聚核苷酸结合 通过E5那检测5x5蛋白月核苷酸序列结合，其原理是，当标记的底物被结合时，与之固定的自旋标签 颜色变化，号致SR谱线增宽(o1s0tt,1976:Smith et a1.,1976),光谱线的高度诚小和吸收由线 高斯分布的标准差增加可以量亿光谱增宽的程度。高斯分布十分找近生物系统中的S吸牧曲线。并且这 种光谱曲线宽度和分布的标准整在数量上的一致性通过它们的数学表达是非常明显的(Bolton et al., 1972:Bo%,1976)。石英测量杯用米整放样品，在所有SR分析中，每个不同的样品体积相同(250#L》, 同时注意保持每个测量杯中的样品浓度在要求的范围内。 2.5.5转录活性试验 含有全部燃基因的质粒和分离纯化的5oxS蛋白用作转录话性试验。程序由和等提供(1995)，是进 2001 John Wey Sor,Ine
微生物发酵工程案例教学 3 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 3 Instruments, India）实时获得。一个电子旋转共振（ESR）分光光度计用来获得ESR光谱。 2.3 处理过程 简要的说，HOCl对E.coli处理在利用。然而，HOCl浓度和菌体生长阶段难以界定。在必需的生长阶段 时，细胞浓度达到2g/L，悬浮于0.05M的磷酸缓冲液分装到几个25mL摇菌瓶中。瓶在使用前，用硫磺酸等 彻底清洗。新配置的次氯酸，浓度用碘滴定法标定，在三个阶段方法加入到培养基中。每个阶段包括60s 的HOCl处理细胞，离心分离细胞，再用普通生长培养基30℃暗处温和震荡培养40分钟。三个阶段最初用HOCl 处理步骤的使用浓度分别为：0.66mmol/g cell（阶段I），4.65mmol/g cell（阶段II），20mmol/g cell （阶段III）。在第三次培养后，留在瓶中的自由氯可用无菌硫代硫酸钠除尽。培养的菌种用LB琼脂平板 分析，在培养十小时后计数。 2.4 培养研究 活菌分离后用前面提到的生长培养基，在30℃摇床中震荡培养。生长实验用1L生物反应器30℃下进行。 2.5 DNA-蛋白质相互作用研究 2.5.1 蛋白分离 从细胞培养物中来进行SoxS蛋白分离的方法是Li和Demple提出的（1994）。 2.5.2 自旋标记的 SoxS 蛋白合成 顺磁性标签2,2,6,6-四乙基哌啶酮-1-氧基，由2,6-二甲基-4-哌啶酮通过H2O2催化氧化，并标记SoxS 蛋白。过程由Wagner和Hsu（1969）提供的自旋标签准备和蛋白标记，不同的是，pH保持在6，防止SoxS不 反应并且正确形成希夫碱。 2.5.3 寡聚核苷酸合成 同包含有SoxS交感序列和对应的甲基化序列（见结果与讨论）的gumB基因启动子区域类似的寡聚核苷 酸，由前面提到的供方获得合成。 2.5.4 电子自旋共振（ESR）检测光谱测定 SoxS-寡聚核苷酸结合 通过ESR检测SoxS蛋白同核苷酸序列结合，其原理是，当标记的底物被结合时，与之固定的自旋标签 颜色变化，导致ESR谱线增宽（Morisett, 1976; Smith et al., 1976）。光谱线的高度减小和吸收曲线 高斯分布的标准差增加可以量化光谱增宽的程度。高斯分布十分接近生物系统中的ESR吸收曲线，并且这 种光谱曲线宽度和分布的标准差在数量上的一致性通过它们的数学表达是非常明显的（Bolton et al., 1972; Borg, 1976）。石英测量杯用来盛放样品，在所有ESR分析中，每个不同的样品体积相同（250μL）。 同时注意保持每个测量杯中的样品浓度在要求的范围内。 2.5.5 转录活性试验 含有全部gum基因的质粒和分离纯化的SoxS蛋白用作转录活性试验。程序由Wu等提供（1995），是进
微生物发酵工程案例餐学 行分析。 所有以不同方式提述的试验至少重复了三次并且是不同时间： (张琼林翻译) 3.结果和讨论 3.1致死浓度，菌落形态和繁性 次氧酸(C1)的处理浓度的确定，是在添加了0C1的普通生长琼脂平板上，处理组达到同野生细围 相比只有50%存活的剂量（玫死浓度C】)。结果表明野生型anthoeonas caopestrist细胞能够耐受非常 低浓度的0C1(LC50=9aW成4.5mol/gcell)。 野生型和C1处理过的菌体，在普通的生长平板上的菌落形态和黏度（黄原胶生产能力）在表一中示 出。处理是来自野生型细胞的四个生长时期。名为对数期早期《1山)，对数期中期(25动)，稳定期早期 (1体》，和整定期晚期（地）·四个时期的野生型细雅都是圆形药落并表现出黏液样。0C1处理组，早 期的细胞体现出圆形菌落和鞋性，然而生长晚期的细胞形成的南落早圆据齿形。电镜检查显示，锯齿彩菌 落的微结构类似于经溶菌酶处理的野生型细胞（结果未显示）·溶菌酶除掉细胞壁，面圈锯齿形菌落的形 成也是由于细胞量的破坏(1tf1 eld et al.,181)。不过，同野生型相比，细型的度更大，更多。 表一野生型和OCl处理的anthowonas campe5tr细胞的菌落形老和素度 处理方法 对数期早期 对数期中期 稳定期早期 稳定期晚期 无（野生型） 圆形、黏 圆形、黏 圆形、黏 圆形、盐 0C1 圆形、黏 圆影齿形、 圆锯齿形、 圆锯齿形、 3.2精养生长 图一表示了W0C1处理的细胞的生长情况。初浓度保持在0,3±0,2/几。H0C1处理组的最大细鞋浓度 达到.94士0.03g/八，这个可以和野生型相当。 生长可以通过Riccati公式模报，这个方法用米模拟细胞生长由来已久(Bai1 ey and011is,I986): (1) 这种模拟也在图一中体现。对应的最大浓度作为公式中的红s。野生型和C1处理组的细胞生长速半相 当（通过最小二乘法分析），分别为06和065h”。 2001 John Wey Sons,Inc. 4
微生物发酵工程案例教学 4 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 4 行mRNA分析。 所有以不同方式描述的试验至少重复了三次并且是不同时间。 （张琼林翻译） 3. 结果和讨论 3.1 致死浓度，菌落形态和黏性 次氯酸（HOCl）的处理浓度的确定，是在添加了HOCl的普通生长琼脂平板上，处理组达到同野生细胞 相比只有50%存活的剂量（致死浓度[LC50]）。结果表明野生型Xanthomonas campestris细胞能够耐受非常 低浓度的HOCl（LC50=9mM或4.5mmol/gcell）。 野生型和HOCl处理过的菌体，在普通的生长平板上的菌落形态和黏度（黄原胶生产能力）在表一中示 出。处理是来自野生型细胞的四个生长时期，名为对数期早期（1h），对数期中期（2.5h），稳定期早期 （10h），和稳定期晚期（50h）。四个时期的野生型细胞都是圆形菌落并表现出黏液样。HOCl处理组，早 期的细胞体现出圆形菌落和黏性，然而生长晚期的细胞形成的菌落呈圆锯齿形。电镜检查显示，锯齿形菌 落的微结构类似于经溶菌酶处理的野生型细胞（结果未显示）。溶菌酶除掉细胞壁，而圆锯齿形菌落的形 成也是由于细胞壁的破坏（Whitfield et al., 1981）。不过，同野生型相比，细胞的黏度更大，更多。 表一 野生型和HOCl处理的Xanthomonas campestris细胞的菌落形态和黏度 处理方法 对数期早期 对数期中期 稳定期早期 稳定期晚期 无（野生型） 圆形、黏 圆形、黏 圆形、黏 圆形、黏 HOCl 圆形、黏 圆锯齿形、 黏 圆锯齿形、 黏 圆锯齿形、 黏 3.2 培养生长 图一表示了HOCl处理的细胞的生长情况。初浓度保持在0.63±0.02g/L。HOCl处理组的最大细胞浓度 达到5.94±0.03g/L，这个可以和野生型相当。 生长可以通过Riccati公式模拟，这个方法用来模拟细胞生长由来已久（Bailey and Ollis, 1986）： X Xs X k dt dX = 1− （1） 这种模拟也在图一中体现。对应的最大浓度作为公式中的Xs。野生型和HOCl处理组的细胞生长速率相 当（通过最小二乘法分析），分别为0.6和0.65h-1
微生物发醇工程案例教学 wrid-hce HOCi-toofod (/6) 5 4 3 o 30 40 60 60 t(h) 图一野生型和0CI处理组的anthowonas campestr细胞生长曲线。点表明实验数据，线表示核抓 的生长趋势。(O》野生里细胞：（●）0C1处理细围。 (李盛兵翻译) 3,3黄原胶性质 图二示出野生型和0C1处理组的黄原敢生产概括。50时，野生型产黄原胶浓度达到3,1w/L。0C1处 理组产物浓度有6.5g/L,这个是相同培养基条件下牙生型产量的210%。因此，BC1处理显著地提高了 Kanthomonas caopestrisi产黄原取的最大能力： 黄原胶在一定浓度和温度下的水溶液的鹭度，是表明其品质的一个重要参数。黄原胶是由B1-4葡萄 酵苷键彩成骨某，甘露糖、葡糖醛酸、酯酸、丙酮酸构成侧时的高聚物：它的品质依赖于丙酮酸和留酸在 黄原胶中的质量百分数(ss1 er and Doherty,99到)，因此，我门分析了智酸和丙解酸分别在野生型 和HDC1处理组的黄原较产物中的质量分数和君度。表二中的结果（到50%时的黄原胶生产）显示出DC1处 理组的内制酸质量含量是a.。比野生型的多63%。船酸质量分数在野生型细胞产物中为5.？%，比0C1处 理组的3.3%高出72.7%. 0C1处理组细产的黄原胶黏度为4.2P。比野生型的3,5P多了20%：据移，黏度增加意味着丙酮酸 质量分数增加同时督酸质量分数减夕(Hassler and Dohert:男，1990)，实验结果也证明了这一点。 不同程度的丙例酸化（丙阴酸质量分数）应该是由两个培养中不月的糖类含量引起的。胶中的糖类分 析从气象色谱分析仪(GC5》获得，在表三中显示，表明，鼠李糖在HDC1处理组的产物中完全没有，然而 在野生型饵胞产物中达到24%。同时，甘露糖质量分数是37.5。这个比野生型产物明显高很多。有趣的是， 2001 John Wey Sons.Inc. 5
微生物发酵工程案例教学 5 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 5 图一 野生型和HOCl处理组的Xanthomonas campestris细胞生长曲线。点表明实验数据，线表示模拟 的生长趋势。（○）野生型细胞；（●）HOCl处理细胞。 （李盛兵翻译） 3.3 黄原胶性质 图二示出野生型和HOCl处理组的黄原胶生产概括。50h时，野生型产黄原胶浓度达到3.1g/L，HOCl处 理组产物浓度有6.5g/L，这个是相同培养基条件下野生型产量的210%。因此，HOCl处理显著地提高了 Xanthomonas campestris产黄原胶的最大能力。 黄原胶在一定浓度和温度下的水溶液的黏度，是表明其品质的一个重要参数。黄原胶是由β1-4葡萄 糖苷键形成骨架，甘露糖、葡糖醛酸、醋酸、丙酮酸构成侧链的高聚物；它的品质依赖于丙酮酸和醋酸在 黄原胶中的质量百分数（Hassler and Doherty, 1990）。因此，我们分析了醋酸和丙酮酸分别在野生型 和HOCl处理组的黄原胶产物中的质量分数和黏度。表二中的结果（到50h时的黄原胶生产）显示出HOCl处 理组的丙酮酸质量含量是3.1%，比野生型的多63%。醋酸质量分数在野生型细胞产物中为5.7%，比HOCl处 理组的3.3%高出72.7%。 HOCl处理组细胞产的黄原胶黏度为4.2cP，比野生型的3.5cP多了20%。据称，黏度增加意味着丙酮酸 质量分数增加同时醋酸质量分数减少（Hassler and Doherty, 1990），实验结果也证明了这一点。 不同程度的丙酮酸化（丙酮酸质量分数）应该是由两个培养中不同的糖类含量引起的。胶中的糖类分 析从气象色谱分析仪（GCMS）获得，在表三中显示，表明，鼠李糖在HOCl处理组的产物中完全没有，然而 在野生型细胞产物中达到24%。同时，甘露糖质量分数是37.5%，这个比野生型产物明显高很多。有趣的是
卷生物发酵工程案例教学 6 葡萄糖和葡糖醛酸质量分数江C1处理组的黄原胶产物中与野生型产物基本一致。高含量的甘露糖必然引 起高水平的内刚酸化，因为内制酸化发生在甘露糖木端(1t0m0tl.,19?B)而且高的丙制酸化程度 会引起C1处理组产物比野生型产物黏度更高。 2 10 40 50 0 Time (h) 图二野生型和C1处理组的黄原胶产量对比。(O)野生型细胞：（●）C1处理细胞。 表二野生型和OC1处理组的黄原校获得的降浓度和性质 细胞类型 50角封胶浓 丙酮酸 酯酸 黏度 度(g/L) (质量分 (质量分 (cP) 数) 数) 野生型 3.1 1.86 5.7 3.5 0C1处理组 65 3.10 3.3 4.2 表三野生型和H0C1处理组的胶产品中的糖类分析 细胞类型一 野生型 0C1处理组 糖类！ (质量分数) (质量分数) 葡萄帮 46.0 45.0 甘露糖 13.0 37.5 服李糖 24.0 Q.00 葡糖；酸 18.0 17.5 2001 John Wey Sor,Ine. 6
微生物发酵工程案例教学 6 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 6 葡萄糖和葡糖醛酸质量分数在HOCl处理组的黄原胶产物中与野生型产物基本一致。高含量的甘露糖必然引 起高水平的丙酮酸化，因为丙酮酸化发生在甘露糖末端（Melton et al., 1976）而且高的丙酮酸化程度 会引起HOCl处理组产物比野生型产物黏度更高。 图二 野生型和HOCl处理组的黄原胶产量对比。（○）野生型细胞；（●）HOCl处理细胞。 表二 野生型和HOCl处理组的黄原胶获得的终浓度和性质 细胞类型 50h时胶浓 度（g/L） 丙酮酸 （质量分 数） 醋酸 （质量分 数） 黏度 （cP） 野生型 3.1 1.86 5.7 3.5 HOCl处理组 6.5 3.10 3.3 4.2 表三 野生型和HOCl处理组的胶产品中的糖类分析 细胞类型→ 糖类↓ 野生型 （质量分数） HOCl处理组 （质量分数） 葡萄糖 46.0 45.0 甘露糖 13.0 37.5 鼠李糖 24.0 0.00 葡糖醛酸 18.0 17.5
微生物发醇工程案例教学 3,4自由基介导的黄原胶高产量的机理 C1通过Fenton反成和ber-eiss反应产生自由基(Dukan and Touati,l9g6),也就能了解到BC1 处理给anthooonas campestris带米了自由基(nj加laRa0 and Sureshkunar,2000), 我们发现了通过白由基介导的黄原取过量生产的机理。己经研究出，黄原胶基因表达，在一般情况下， 是由一个堪因上游的强启动子所调节(atzen et al.,1996)·因此，可以设想自由基可以激活前 围提到的启动子并增加胶产量。 在这个研究中，因为我们己经由C1获得了自由基，可以正明C1直接产生前面提到的效应，而不是 通过自由基。因此，如果是这样的话，当C1处理组细胞生长在痕量BC1条件下，会有更高浓度的较产量。 但是，当C1处理组细胞在4.6#ol/gce11浓度的0C1(痕量，初始浓度)下，在50h时，仅仅获得了4.7g/L 的黄原败，与普通培养基中的就，5g八产量可以微个对比。然而，生长并没有受到显著影响。这就印证了这 个看法，C1的影响并不是直接的，而是通过白由基产生的。 在Eco中，对氧的们生物造成的氧化环境的反应，是通过5Sox调节子博节的(unoshiba et al., 1994:和eta1,1995》。对过氧化环境的反应是通过你y调节子调节的1然而，因为用0进行了相似 的处理设有箭米黄原胶浓度的显著增加（林果未显示），这就有理由假设和调节子在研究中有重要作 用.通过5x(敏感蛋白)，一个细胞内的氧化条件信号提高了Sx5水平。.S0S紧接着引起了一连串的几 种由调节子控制的基因的表达。应对细胞内氧化条件。到目简，Sx调节子并没有在以往的文献中报道 过。然面，thowonas caopestris中的可能月米应对环境压力如搞渗透压培养或者是营养限制的双元件 的调节系饶还是有一定了解的。 我们怀凝anthomonas campestris中白由基介导的黄原胶过量生产的机理，涉及到5OS调节子或者 是类似的元件。作为一个适应性反应。S船调节子的蛋白期望在随后的世代中保持在一个高水平上，这 可能会带米敢的高表达，甚至是在缺少自由基介导物的条件下。我们观察到，商株保持了黄原胶的高表达 特续了至少50代一一或者说是14次包括3到个世代的传代培养一在处理后的。然面，表达量随着传代增 如而减少。举例来说，一次传代后，黄原胶产量达到6.5g/L,二次传代后到了5.4g/L,然面在14次传代后， 仅仅有3.3g/八，与之做对比的是野生型3.1/儿的产量。 对5和调节子梦米高表达黄原胶的假设如下：介导的自由基带来了Sx俗调节子藏话：调节蛋白50x5, 同基因的强启动子结合，引起黄原校过量生产。后面的文字详细介绍了所提出的假设中关于蛋白风 结合和转录方面的实验证明 另外，高浓度的C1(对于colit高于57uM。转换作2.1的l/gce11),有可能破坏一些抗氧化 酶知容陆甘肽(ukan et al..,1999)并且这就引起了大量的白由基形成。这些过量的自由基。紧接着进 2001 John Wey Sons,Inc. 7
微生物发酵工程案例教学 7 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 7 3.4 自由基介导的黄原胶高产量的机理 HOCl通过Fenton反应和Haber-Weiss反应产生自由基（Dukan and Touati, 1996），也就能了解到HOCl 处理给Xanthomonas campestris带来了自由基（Manjula Rao and Sureshkumar, 2000）。 我们发现了通过自由基介导的黄原胶过量生产的机理。已经研究出，黄原胶基因表达，在一般情况下， 是由一个gumB基因上游的强启动子所调节（Katzen et al., 1996）。因此，可以设想自由基可以激活前 面提到的启动子并增加胶产量。 在这个研究中，因为我们已经由HOCl获得了自由基，可以证明HOCl直接产生前面提到的效应，而不是 通过自由基。因此，如果是这样的话，当HOCl处理组细胞生长在痕量HOCl条件下，会有更高浓度的胶产量。 但是，当HOCl处理组细胞在4.6μmol/g cell浓度的HOCl（痕量，初始浓度）下，在50h时，仅仅获得了4.7g/L 的黄原胶，与普通培养基中的6.5g/L产量可以做个对比。然而，生长并没有受到显著影响。这就印证了这 个看法，HOCl的影响并不是直接的，而是通过自由基产生的。 在E.coli中，对氧的衍生物造成的氧化环境的反应，是通过SoxRS调节子调节的（Nunoshiba et al., 1994; Wu et al., 1995）。对过氧化环境的反应是通过OxyR调节子调节的；然而，因为用H2O2进行了相似 的处理没有带来黄原胶浓度的显著增加（结果未显示），这就有理由假设SoxRS调节子在研究中有重要作 用。通过SoxR（敏感蛋白），一个细胞内的氧化条件信号提高了SoxS水平。SoxS紧接着引起了一连串的几 种由调节子控制的基因的表达，应对细胞内氧化条件。到目前，SoxRS调节子并没有在以往的文献中报道 过。然而，Xanthomonas campestris中的可能用来应对环境压力如搞渗透压培养或者是营养限制的双元件 的调节系统还是有一定了解的。 我们怀疑Xanthomonas campestris中自由基介导的黄原胶过量生产的机理，涉及到SoxRS调节子或者 是类似的元件。作为一个适应性反应，SoxRS调节子的蛋白期望在随后的世代中保持在一个高水平上，这 可能会带来胶的高表达，甚至是在缺少自由基介导物的条件下。我们观察到，菌株保持了黄原胶的高表达 持续了至少50代——或者说是14次包括3到4个世代的传代培养——在处理后的。然而，表达量随着传代增 加而减少。举例来说，一次传代后，黄原胶产量达到6.5g/L，二次传代后到了5.4g/L，然而在14次传代后， 仅仅有3.3g/L，与之做对比的是野生型3.1g/L的产量。 对SoxRS调节子带来高表达黄原胶的假设如下：介导的自由基带来了SoxRS调节子激活；调节蛋白SoxS， 同gumB基因的强启动子结合，引起黄原胶过量生产。后面的文字详细介绍了所提出的假设中关于蛋白-DNA 结合和转录方面的实验证明。 另外，高浓度的HOCl（对于E.coli：高于57μM，转换作2.1mmol/g cell），有可能破坏一些抗氧化 酶如谷胱甘肽（Dukan et al., 1999）并且这就引起了大量的自由基形成。这些过量的自由基，紧接着进
微生物发醇工程案例教学 一步激活了Sx调节子，引品黄原胶高产和更高的超氧化物歧化酶(S0)活性。超氧化物歧化酶是众所 周知的抗氧化前(l1iwel1 and Gutteridge,1S85)并且更高的S0话性在H0C1处理的a thotoes caapestr1s中有发现(anjula Ra0 and Sureshkumar,20o0). 《陈家瑞翻译) 3.5S0x5蛋白同GmB启动子结合 SoS的特异性交感序列由L1和0eple(1996)测出1 AN GCAYNCKA 其中，X代表任意碱基，Y是一种密院，是A或T。 同时，相关的不月基本序列的重要性不同，GCAY是最重要的。根据SxS识别片爱，几种由S0带在 调节的基因已经由Ecolil基因组数据库确定(Li and Demple,1S96)。 我们检查nthomonas campestris的响动子线《在基因上等的-35区)： COGGCMCDOGTCGCGAT 并且在其中发现最重要的S0x5蛋白识别位点（由斜体标出》。因此，S0x5蛋白很有可能可5基因启 动子域结合 为了深入研究50S蛋自同s基因启动子的结合，我们合成了一段靠聚核苷酸，月基因启动子包 括S0x5交感序列一样。分离出的S0x5蛋白真实性由Sx5抗体旺明，通过ES求检测，如“材料与方法”中所 述。谱线峰高减少了56并且标流差增加了200%，这就表明了结合。55蛋白月Sax5抗体结合也通过免疫 电泳法证明了（数据未显示）。寡聚核苷酸蛋自(N蛋白)相气作用也通过5R研究。带有白旋标记蛋 白的赛案核苷酸的拒S震话线（图三）显示出高度减少了2L.3第，标准差增加了20.1%。这个结果显示出，蛋 白确实同靠聚核皆酸相结合，相似的结果通过E0/S0S蛋白和寡聚核背酸获得，这正明了在ataa8 C即srs中的SoxS蛋白可能与Eco/中发现的类似 2001 John Wey Sons.Ine 8
微生物发酵工程案例教学 8 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 8 一步激活了SoxRS调节子，引起黄原胶高产和更高的超氧化物歧化酶（SOD）活性。超氧化物歧化酶是众所 周知的抗氧化酶（Halliwell and Gutteridge, 1985）并且更高的SOD活性在HOCl处理的Xanthonomas campestris中有发现（Manjula Rao and Sureshkumar, 2000）。 （陈家瑞翻译） 3.5 SoxS 蛋白同 Gum B 启动子结合 SoxS的特异性交感序列由Li和Demple（1996）测出： AN2GCAYN7CWA 其中，N代表任意碱基，Y是一种嘧啶，W是A或T。 同时，相关的不同基本序列的重要性不同，GCAY是最重要的。根据SoxS识别片段，几种由SoxRS潜在 调节的基因已经由E.coli基因组数据库确定（Li and Demple, 1996）。 我们检查Xanthomonas campestris的gumB启动子域（在gumB基因上游的-35区）： CCGGCACGCGTCGGGAT 并且在其中发现最重要的SoxS蛋白识别位点（由斜体标出）。因此，SoxS蛋白很有可能同gumB基因启 动子域结合。 为了深入研究SoxS蛋白同gumB基因启动子的结合，我们合成了一段寡聚核苷酸，同gumB基因启动子包 括SoxS交感序列一样。分离出的SoxS蛋白真实性由SoxS抗体证明，通过ESR检测，如“材料与方法”中所 述。谱线峰高减少了5.6%并且标准差增加了200%，这就表明了结合。SoxS蛋白同SoxS抗体结合也通过免疫 电泳法证明了（数据未显示）。寡聚核苷酸-蛋白（DNA-蛋白）相互作用也通过ESR研究。带有自旋标记蛋 白的寡聚核苷酸的ESR谱线（图三）显示出高度减少了21.3%，标准差增加了20.1%。这个结果显示出，蛋 白确实同寡聚核苷酸相结合。相似的结果通过E.coli SoxS蛋白和寡聚核苷酸获得，这证明了在Xanthonomas campestris中的SoxS蛋白可能与E.coli中发现的类似
微生物发醇工程案例教学 9 (A) Field Set 图三(A)自旋标记SS蛋白的SR谱线：(B)带有寡素核苷酸的自能标记SaxS蛋白的S爱谢线 3.6DNA-蛋白结合的特任 对照组用米排除幸特异性蛋白寡聚核苷酸结合。用作对现组的是自能标记抗血清，一种包括白蛋白和 一种S5缺失突变的白旋标记蛋白提取物。每种对照和寡聚核甘酸结合也通过S求检测。可以观黎到，当 分别同靠聚核苷酸混在一起时。没有明显的光游特狂的变化，因此，S05同嘉聚核苷酸的结合是高度专一 的： 蛋白特异性地结合在u动子的GCAY序列可以通过特殊的甲琴化CAY其中一个碱基并且检测SoS 同甲基化森聚核苷酸的结合这种实验来证明.已知，甲基化可以干扰蛋白-%A结合(Li and De即le,1996). 我门们研究了白旋标记5x5蛋白和带有一个甲基化G(表示在如下序列中最号标记)的寡聚核甘酸之间的反 应： QOCG米CA00 GTCGCG4T 发观在存在或者缺少甲基化寡聚核苷酸时，没有暴著的光请改变（请线没有列出）这表明了50x5蛋白 2001 John Wey Sor,ie. 9
微生物发酵工程案例教学 9 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 9 图三 （A）自旋标记SoxS蛋白的ESR谱线；（B）带有寡聚核苷酸的自旋标记SoxS蛋白的ESR谱线 3.6 DNA-蛋白结合的特征 对照组用来排除非特异性蛋白寡聚核苷酸结合。用作对照组的是自旋标记抗血清，一种包括白蛋白和 一种SoxS缺失突变的自旋标记蛋白提取物。每种对照和寡聚核苷酸结合也通过ESR检测。可以观察到，当 分别同寡聚核苷酸混在一起时，没有明显的光谱特征的变化，因此，SoxS同寡聚核苷酸的结合是高度专一 的。 蛋白特异性地结合在gumB启动子的GCAY序列可以通过特殊的甲基化GCAY其中一个碱基并且检测SoxS 同甲基化寡聚核苷酸的结合这种实验来证明。已知，甲基化可以干扰蛋白-DNA结合（Li and Demple, 1996）。 我们研究了自旋标记SoxS蛋白和带有一个甲基化G（表示在如下序列中星号标记）的寡聚核苷酸之间的反 应： CCGG*CACGCGTCGGGAT 发现在存在或者缺少甲基化寡聚核苷酸时，没有显著的光谱改变（谱线没有列出）这表明了SoxS蛋白
微生物发酵工程案例餐学 10 没有问甲基化的寡聚核昔酸结合。因此，可以得出结论，55蛋自同启动子域的GCAY序列特异性结合。 3.7S05引起的一连串um基因转录米活 在ax5蛋白结合启动子域后，下一步就是有关A的转录。确定是否S0x结合会引起下一步合成黄原 胶生产相关基因，我们估量了存在和缺少S©S下的mRXA的获得水平（和其他必着的真聚核背酸）·SoS存 在时的XA浓度为比缺少SoS高很多。S05增加A水平的事实证明了SoS为一连串基因的转录羞活 子 4.的论 利用C1处理得到自由基提高黄原胶的产量和品质，这样的一个新的方法由此提出。存在和不存在 OC1的anthomonas canpestris生长速率帮本相同。时，HCC1处理梦来了黄原胶品质的显著提高。.留酸、 内制酸质量分数和胶中糖类的波谱，0C1处理的菌株同野生型菌株分泾的胶不同。一个解释自由基介导高 产黄原胶的机理也阐述明确，并且得到了实验正实：S0xS蛋白同g基因启动子特异性结合位点：高NA 通过5oS存在到s基因转录表达。 参考文献 Bailey J,01lis D.1986.Biochenical engineering fundanentals.New York:McGraw-Hill. Bjerrun OJ,Bog-Hansen TC.1976.Immunochenical gel precipitation techniques in meshrane studies.In:Maddy AH,editor.Biochenical analysis of mombranes.London:Chapman-Hall. Bolton JR,Borg IC,Swartz L 1972.Biological applications of electron spin resonance. New York:Niley Interscfence. Borg DC.1976.Applications of ESR in biology.In:Pryor WA.editor.Free radicals in biology. New York:Academic Press. Blumerkrantz N,Hansen AG.1973.Determination of acetate and pyruvate contents in xanthan gun Amal Biochem 54:483-489. Chamnongpol S.Vattanaviboon P.Lopraset S,Mongkolsuk S.1995.Atypical oxidative stress regulation of a Xanthomonas oryzae py.oryzae moeofunetional catalase.Can J Microbiol 41:541-547. Dukan S,Touati D.1996.Hypochlorous acid stress in Escherichia coli:resistance,DNA dange and comparison with hydrogen peroxide stress.J Bacteriol 178:6145-6150. Dukan S,Belkin S,Touati D.1999.Reactive oxygen species are partially imvolved in 2001 John Wey Sons,Inc. 10
微生物发酵工程案例教学 10 © 2001 John Wiley & Sons, Inc. 10 没有同甲基化的寡聚核苷酸结合。因此，可以得出结论，SoxS蛋白同gumB启动子域的GCAY序列特异性结合。 3.7 SoxS 引起的一连串 gum 基因转录激活 在SoxS蛋白结合启动子域后，下一步就是有关mRNA的转录。确定是否Sox结合会引起下一步合成黄原 胶生产相关基因，我们估量了存在和缺少SoxS下的mRNA的获得水平（和其他必需的寡聚核苷酸）。SoxS存 在时的mRNA浓度为比缺少SoxS高很多。SoxS增加mRNA水平的事实证明了SoxS为一连串gum基因的转录激活 子。 4. 结论 利用HOCl处理得到自由基提高黄原胶的产量和品质，这样的一个新的方法由此提出。存在和不存在 HOCl的Xanthomonas campestris生长速率基本相同。同时，HOCl处理带来了黄原胶品质的显著提高。醋酸、 丙酮酸质量分数和胶中糖类的波谱，HOCl处理的菌株同野生型菌株分泌的胶不同。一个解释自由基介导高 产黄原胶的机理也阐述明确，并且得到了实验证实：SoxS蛋白同gumB基因启动子特异性结合位点；高mRNA 通过SoxS存在时gum基因转录表达。 参考文献 Bailey J, Ollis D. 1986. Biochemical engineering fundamentals. New York: McGraw-Hill. Bjerrum OJ, Bog-Hansen TC. 1976. Immunochemical gel precipitation techniques in membrane studies. In: Maddy AH, editor. Biochemical analysis of membranes. London: Chapman-Hall. Bolton JR, Borg DC, Swartz HM. 1972. Biological applications of electron spin resonance. New York: Wiley Interscience. Borg DC. 1976. Applications of ESR in biology. In: Pryor WA, editor. Free radicals in biology. New York: Academic Press. Blumerkrantz N, Hansen AG. 1973. Determination of acetate and pyruvate contents in xanthan gum. Anal Biochem 54:483–489. Chamnongpol S, Vattanaviboon P, Lopraset S, Mongkolsuk S. 1995. Atypical oxidative stress regulation of a Xanthomonas oryzae pv. oryzae monofunctional catalase. Can J Microbiol 41:541–547. Dukan S, Touati D. 1996. Hypochlorous acid stress in Escherichia coli: resistance, DNA damage and comparison with hydrogen peroxide stress. J Bacteriol 178:6145–6150. Dukan S, Belkin S, Touati D. 1999. Reactive oxygen species are partially involved in